Yazarlar yararlı tartışmalar için yeşil laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen NIH hibe R03AG052018 ve E.M.G. için R01GM124342 tarafından desteklenmiştir

1. ön bağlama antikor manyetik boncuklar için
<ol>
	<li>Protein A/G manyetik boncuklar karıştırın ve bir 1,5 mL tüp manyetik boncuklar bir immunoprecipitation (IP) örnek başına 20 µL aktarın. Not: boncuk pipetting, geniş-geçişli, yüksek tutma ipuçları kullanın.</li>
	<li>Boncuk ile tüp manyetik bir stand içine yerleştirin ve boncuk tüp tarafında toplamak sağlar. Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Boncuk 3 kez 1 mL soğuk Tris tamponlu tuz (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) ile yıkayın.</li>
	<li>TBS 200 µL boncuk ve uygun miktarda antikor ekleyin. Gecede 4 ° C'de 8 RPM döndürme Not: birçok Histon PTM antikor antikor IP başına 1-3 µg yeterlidir. Ancak, titrasyon deneyler uygun konsantrasyonlarda belirlemek için tavsiye edilir. İyi karakterize, ticari Histon PTM antikorlar için önerilen konsantrasyonları çoğu kez doğru ve yayımlanmış bir rapor veya ürün belgeleri içinde bulunabilir.</li>
	<li>Boncuk manyetik tribünde yer ve süpernatant kaldırın. TBS ile 1 mL yıkar</li>
	<li>TBS IP örnek başına 20 µL artı TBS. (pipetting hata) durumunda ek bir 5 µL boncuk resuspend Not: Boncuk kadar kullanmak 4 ° C, kısa süreli depolanabilir.</li>
</ol>
2. Maya hücreleri büyümek
<ol>
	<li>10 mL YPD (% 10 Maya ekstresi, % 20 pepton ve % 20 dekstroz) uygun zorlanma bir koloni ile aşılamak ve titreyen bir kuluçka makinesi 220 rpm'de geceleme 30 ° C'de büyür.</li>
	<li>600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) bir Spektrofotometre kullanarak Maya kültür. Kültür bir OD600 seyreltik 0,2 100 ml YPD yeni bir şişe içinde =.</li>
	<li>Onlar orta log fazı ulaşana kadar 220 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de hücrelerin büyümesine (OD600 = 0,6-0,8).</li>
</ol>
3. proteinler DNA için polietilenin Vivo içinde
<ol>
	<li>Kültürler orta log fazı ulaştığınızda, 2.7 mL % 37 formaldehit doğrudan orta, % 1 formaldehit son konsantrasyonu için ekleyin. Bir shaker 25 ° C (ya da oda sıcaklığında) şişeye aktarmak ve 50 devirde 15 dakika salla.</li>
	<li>5 mL 2.5 M glisin de orta olarak ekleyin ve formaldehit gidermek 5 min için oda sıcaklığında 50 RPM sallayarak devam edin.</li>
	<li>Şişe santrifüj kapasitesi ve hücreleri 5800 x g 4 ° C'de 5 min için de spin için hücreleri transferi Süpernatant dikkatle boşaltmak.
	<ol>
		<li>45 mL soğuk TBS resuspending tarafından hücreleri yıkayın ve süspansiyon 50 mL konik tüp içine aktarın. Tüp 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>10 mL soğuk hücrelerinde lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), %1 nonidet Oktil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C'de depolanan) chIP yıkama.</li>
		<li>Hücreleri 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın. Not: Hücreler sıvı azot ile dondurulmuş ve başka işleme kadar-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Maya Lysates olun
<ol>
	<li>1 mL 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile soğuk çip lizis tampon ve Maya proteaz inhibitörü kokteyl 1:1,000 seyreltme hücrelerde resuspend. Süspansiyon cam boncuk 200 µL içeren 2.0 mL vidalı kapak tüp aktarın.</li>
	<li>Boncuk için 30 6 kere yendi ve hücreleri cihazları, yüksek hızlı ajitasyon için 4 ° C'de yenerek bir boncuk transfer her s. Hücreler yenerek her boncuk arasında en az 1 dk. için buz üzerinde tutmak.</li>
	<li>Lysate jel ipuçları yükleme kullanarak bir 1,5 mL tüp aktarın. Lysate 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g, santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atmak ve Pelet MNase sindirim arabellek 250 µL içinde resuspend (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de) tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting.</li>
	<li>MNase 2.5 µL reaksiyonlar için ekleyin. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen 20 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. Not: MNase yeni bir hazır kullanıldığında Özet koşulları optimize edilmelidir. Adım 10 iletişim kuralı bkz:.</li>
	<li>Hemen tüpler reaksiyonu durdurmak ve 0,5 M EDTA 10 mM EDTA son bir konsantrasyon için 5 µL eklemek için buz üzerine yerleştirin. Onları karışımı yavaşça INVERSION tarafından.</li>
	<li>15,500 x g 4 ° C'de 15 dakika de tepki santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Not: Çözünür (sindirilir) Kromatin süpernatant içinde olacaktır. Pelet bir şey sindirilmemiş ve çözünmez hücre artıkları içerir.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) Histon modifiye
<ol>
	<li>Bir Bradford tahlil kullanarak her MNase yayımlanan Kromatin kesir protein konsantrasyonu belirlemek. Her 8 tek kullanımlık cuvettes artı test edilecek her protein örneği için 1 ek küvet Bradford reaktifi 1 mL ekleyin.
	<ol>
		<li>2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) stok çözeltisi hazırlamak.</li>
		<li>BSA aşağıdaki konsantrasyonları Bradford reaktifi 1 ml elde etmek için uygun birim ekleme: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL ve 10 μg/mL. MNase serbest bırakmak Kromatin fraksiyonunun 2 μL ek cuvettes ekleyin.</li>
		<li>Her küvet parafilm küçük bir parça ile üst kapak ve 4 - 6 kez cuvettes ters çözüm de karıştırmak için. 15 dakika oda sıcaklığında cuvettes kuluçkaya.</li>
		<li>Görünür ışık Spektrofotometre kullanarak ölçmek 595 Absorbans nm standart eğri ve deneysel örnekleri için. Not: küvet BSA olmadan kullanın (0 μg/e doğru önce ilk ölçüm alarak Spektrofotometre boş mL).</li>
		<li>BSA farklı konsantrasyonları Spektrofotometre ile ilişkili yazılım veya elektronik tablo yazılımı için Absorbans değerleri kullanarak standart bir eğri çizmek. Standart eğri ve kullanılan seyreltme faktörü (1:500) göre Absorbans değerleri her Kromatin kesir örnekleri için protein konsantrasyonu hesaplamak için kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Her IP için toplam protein 50 µg çip lizis son hacim 1 ml ulaşmak için arabellek için MNase serbest Kromatin kesir ekleyin. Not: lysate başına birden fazla IP ayarlıyorsanız, lysate ana bir karışımını yapmak ve ChIP lizis tampon ve IP için bireysel tüpler için aliquot 1 mL.</li>
	<li>100 µL giriş örnek olarak işlemek için IP karışımı çıkarın. -20 ° C'de giriş örnek adım kadar 7.1 dondur. Not: Herhangi bir kalan Kromatin örnek ayrıca olabilir-20 ° C'de donmuş ve isterseniz bir sonraki IP için kullanılır.</li>
	<li>Manyetik Protein A/G boncuk ile antikor her IP örnek için önceden bağlı 20 µL ekleyin.</li></ol>Örnek 3 h (Standart) için 8 RPM döndürme veya bir gece 4 ° C'de Eğer (tercih edilen)

6. yıkayayım IP'leri ve Histon-DNA komplekslerinde Elute
<ol>
	<li>Bir manyetik tüplerde durup boncuklar yer tüp tarafında toplayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın. Boncuk sırayla her aşağıdaki arabelleklerinin 1 mL ile yıkayın.
	<ol>
		<li>4 ° C'de 5 min için 8 rpm'de dönen bir manyetik tribünde boncuk yerleştirerek, süpernatant kaldırarak ve sonraki arabellek ekleyerek her yıkama gerçekleştirmek: 2 x - ChIP lizis tampon, 2 x - yüksek tuz yıkama arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de), 1 x - LiCl/deterjan yıkama arabellek (4 ° C'de depolanan 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %1 NP-40, % 1 sodyum deoxycholate,), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C'de depolanan) ve 1 x - TE.</li>
		<li>Son TE yıkama ile boncuk boncuk TE tüp yıkayın ve kalan boncuk aktarmak için daha sonra başka bir 0.5 mL çoğunu aktarmak için TE 0.5 mL kullanarak yeni bir tüp aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Taze yapılmış çip elüsyon arabelleği (%1 SDS, 1 mM NaHCO3) 250 µL ekleyin. Girdap çözüm kısa bir süre. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.</li>
	<li>Tüp manyetik tribünde yer ve boncuk toplamak. Dikkatle süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve boncuk kaçının. Not: Eluate immunoprecipitated protein ve ilişkili DNA içerir.</li>
	<li>Başka bir 250 µL çip elüsyon arabelleği boncuk için ekleyin. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant ilk elüsyon içeren tüp aktarın. Gerekirse, küçük hacim (240 µL) boncuk rahatsız edici önlemek tüm IPS kaldırın.</li>
</ol>
7. Protein-DNA Glossar ters
<ol>
	<li>Giriş örnekleri çözülme ve 400 µL çip elüsyon arabelleği her girdi için ekleyin.</li>
	<li>Hem giriş hem de IP örnekleri için 5 M NaCl, 20 mg/mL glikojen 5 µL ve 20 mg/ml İndinavir K. Mix 12.5 µL 20 µL de ters çevirme veya tüpler flicking ekleyin. 65 ° C su banyosu örneklerinde gecede kuluçkaya.</li>
</ol>
8. arındırmak ve DNA konsantre
<ol>
	<li>10 mg/ml RNase A 10 µL giriş ve IP örnekleri için ekleyin. 37 ° C su banyosu için 30 dk örneklerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Fenol: chlorofrom:isoamyl alkol (25:24:1 PCI) 600 µL sulu ekleyin ve iyice karıştırın. Onları 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin.
	<ol>
		<li>Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 600 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tüp 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın. Dikkat: duman mahallede çalışma ve PCI ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Sıvı ve katı atık kurumsal kurallar tarafından talimat olarak atın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M sodyum asetat ve DNA çökelti soğuk % 100 etanol 1 mL 0.1 x birim ekleme. Tüp 4 - 6 kez ters çözüm de karıştırmak için. -20 ° C'de gecede kuluçkaya.
	<ol>
		<li>Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.</li>
		<li>Pelet 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.</li>
		<li>Yaklaşık 20 dakika kadar (tamamen kuru) başlıklı granül kuruması. IP örnekleri nükleaz ücretsiz su 50 µL içinde resuspend ve giriş örnekleri nükleaz ücretsiz su 100 µL içinde resuspend. DNA örnekleri-20 ° C'de qPCR performans kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. kantitatif PCR (qPCR) genomik bölgelere zenginleştirilmiş tespit
<ol>
	<li>Astar her dizi için bir qPCR ana karışımı olun. Bir reaksiyon 5 µL 2 x qPCR mix, 0,25 µL 20 µM ileri astar ve 20 µM ters astar 0,25 µL içerir. Not: Uygun astar tasarım ve qPCR deneyler için test başka bir14,15,16bölümünde.</li>
	<li>Her DNA örneği DNA ana karışımları yapmak. Bir reaksiyon DNA'ın 0.5 µL ve 4.0 µL nükleaz ücretsiz su içerir.</li>
	<li>5.5 µL uygun astar ana mix ve uygun DNA ana Mix 4,5 µL 384-şey qPCR plaka üzerinde her şey ekleyin. Not: her şey için 5.5 µL astar karışımı ekleyerek başlayın. Kalenin 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de 4,5 µL DNA karışımı eklemeden önce spin.</li>
	<li>Mühür plaka ve 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için spin için uygun.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar ile gerçek zamanlı qPCR sistemle qPCR gerçekleştirmek: 95 ° C 3 dakika; 40 devredir 10 95 ° c s, 30 55 ° C s; erime eğrisi 65 ° C ila 95 ° C 0,5 ° C artışlarla, 5 s.</li>
	<li>Her astar çifti için IP örnek qPCR içinde kullanılan % 5 giriş örnek göre yüzde giriş hesaplayın. Teknik PCR triplicates araçlarının hesaplamaları gerçekleştirmek için kullanın. Not: önemli varyasyon gözlenen Eğer PCR triplicates ana mix kompozisyon, pipetting hataları ve kuyu 384-şey plaka arasında çapraz bulaşma için dikkat qPCR tekrarlamak daha iyi.<ol>
		<li>Cq değerleri % 100'e giriş için seyreltme faktörü çiğ Cq değerleri temsil eden döngü sayısı çıkarılarak ayarlayın. Not: Yüzde beş giriş 20, hangi 4,32 döngüsü (2 20 = 4,32 oturum) eşittir bir seyreltme faktörü temsil eder.</li>
		<li>2 olarak giriş yüzdesini hesaplamak ^ (Cqgiriş - CqIP) 100 ile çarpılmış.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. MNase Özet koşulları (önerilen öncesinde ilk tam çip deney) belirlemek
<ol>
	<li>2.1 4.4 önceki iletişim kuralı aracılığıyla adımları. Kromatin içeren Pelet MNase hazım birden çok örnekleri için yeterince lysate oluşturmak için protokol büyütmek. 4.4. adımda granül MNase sindirim arabellek 1,25 mL resuspend. Örnekleri 5 tüpler yani her aliquot MNase sindirim arabellekte resuspended Kromatin Pelet 250 µL içerir.</li>
	<li>0, 1.5, 2.5 veya 5 ekleyin MNase µL her tüp için. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen bir 37 ° C su banyosu için 20 dk tüplerde kuluçkaya.</li>
	<li>Hemen buza tüpler yerleştirerek ve 0,5 M EDTA 10 mM son yoğunlaşması 5 µL ekleyerek reaksiyonlar durdurmak.</li></ol>Çözüm karışımı yavaşça INVERSION tarafından.
	<li>15,500 x g 4 ° C'de 15 dakika, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın.</li>
	<li>SDS % 1 son konsantrasyonu (25 µL % 10 hisse senedi çözüm) ve NaHCO3 0.1 M son konsantrasyonu (1 M hisse senedi çözüm 25 µL) 1,5 mL tüpler örneklerinde için ekleyin.</li>
	<li>5 M NaCl, glikojen 5 µL ve 20 mg/mL İndinavir K 12.5 µL 20 µL 1,5 mL tüpler örneklerinde ekleyin. Onları gecede 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA 10 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>PCI 300 µL sulu ekleyin ve iyice karıştırın. 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin.
	<ol>
		<li>Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M sodyum asetat (genellikle ~ 30 µL) ve DNA çökelti soğuk % 100 etanol 1 mL 0.1 x birim ekleme. Tüp 4 - 6 kez ters çevir de karıştırmak için. Tüp-80 ° c-20 ° C veya 1 h için gecede kuluçkaya.
	<ol>
		<li>Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde bir pipet ile süpernatant çıkarın.</li>
		<li>Granül 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
		<li>Hood yaklaşık 20 dk (veya kadar tamamen kuru) granül kurumasına izin verin. Granül nükleaz ücretsiz su 30 µL içinde resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Boya yükleme DNA ekleyin ve 20 µL % 2 özel üzerinde çalıştırmak görselleştirmek için jel DNA sindirilir.</li>

<ol>
	<li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Own+Adventure:+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate.">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications.">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Lefran&#231;ois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+yeast+ChIP-Seq+using+multiplex+short-read+DNA+sequencing.">Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 37 (2009).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci.">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAP-MS:+a+method+for+identification+of+proteins+and+histone+posttranslational+modifications+at+a+single+genomic+locus.">ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li><li>Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+systems+approaches+for+the+analysis+of+histone+modification+readout.">Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout.</a> Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li><li>Meluh, P. B., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+analysis+of+yeast+chromatin.">Immunological analysis of yeast chromatin.</a> Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines.">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, A., Rodr&#237;guez, M., C&#243;rdoba, J. J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods.">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li><li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes.">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li><li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast.">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yordamı immunoprecipitation tarafından değiştirilmiş Histon Maya hücreleri ile ilgili DNA'ın verimli kurtarma sağlar. Bu bölgelerde yerel zenginleştirme belirlemek ilgi veya belirli Histon değişiklikler tükenmesi yükseltmek primerler kullanılarak qPCR tarafından takip ediyor. Bir yöntem olarak varlık gelişmiş rağmen neredeyse 20 yıl önce çip Histon değişiklik durum farklı genomik bölgeler ve farklı koşullar altında soruşturma için belirleyici tahlil kalır. Her ne kadar yeni nesil sıralama teknolojileri Histon değişiklikler genom geniş ölçekli6,7sorguya çekebiliriz için çip birleştiğinde, maliyeti ve bu yaklaşımların gerekli veri analizi bazı laboratuar ortamlarında onların kullanımı sınırlayabilir. Ayrıca, bu epigenomic deneyler kez Histon değişiklik durum bazı genomik loci, gözlemleri doğrulamak için qPCR için birleştiğinde yonga tarafından takip edilmektedir. Fiziksel olarak bir Histon işareti (veya diğer protein) genom içindeki belirli bir konuma bağlantı ve bu etkileşim farklı çevresel veya biyolojik koşullar altında dinamiklerini analiz çip yarar sağlar birkaç benzer yöntem vardır . Her ne kadar Kromatin tanımlanmış genomik bölgelerden izole son başarılı olmuştur ve kütle spektrometresi8,9,10,11kullanarak yerel Histon işaretleri tanımlayan, bu yöntemler poz Teknik sorunlar ve onların yardımcı programı farklı laboratuar türleri arasında kütle spektrometresi araçları ve veri analizi kaynakları yeterli erişim sınırlı olabilir. Burada açıklanan protokol teknik olarak bir qPCR makineye erişim varlık birincil mümkün engel ile çeşitli laboratuvar ayarları için ve ekonomik olarak erişilemez. Çip değiştirilmiş Histon genomik yerelleştirme Maya ve diğer sistemleri tanımlamak için altın standart kalır.
Bu aynı anda birden fazla mutantlar veya çevresel koşullar testi dahil olmak üzere farklı deneysel koşullarına uygun hale getirilebilir adımları bir dizi ile çok yönlü bir protokoldür. Alternatif olarak, yeterli Kromatin genellikle bir lysate kadar en az dört farklı antikorlar ile çoklu IPS gerçekleştirmek için oluşturulur. Bu iletişim kuralı epitope öğesini veya antikor oluşturulmuş olan sigara Histon Kromatin proteinleri küçük parça için de kullanılabilir. Bu iletişim kuralı olmayan Histon proteinleri küçük parça için adapte için ise, fiksasyon süresi, dahil olmak üzere IP Kromatin konsantrasyon ve antikor konsantrasyon kez arka plan üzerinde zenginleştirme hedeflenen protein elde etmek için önemli parametreleridir. En sık 45 ve 60 dk arasında için formaldehit ile fiksasyon zamanı artırmak için ve IP (en fazla 200 µg toplam protein) kullanılan Kromatin miktarını artırmak için yararlıdır.
Kaliteye katkıda potansiyel değişkenlerin sayısını ve tekrarlanabilirlik Histon modifikasyon chIP deney vardır. Alt-optimal bir deney kez pozitif stark farklılıkları (örneğin, H3K4me2 şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi wildtype veya hücrede set1Δ, düzeyi) karşılaştırırken sonuçlar verebilir rağmen daha fazla ince farklar içinde maskeli olmak büyük olasılıkla bir uygun olmayan şekilde gerçekleştirilen deneme (H4K16ac, TEL07L şekil 3B' gösterildiği gibi wildtype veya sir2Δ olan hücrelerde farklı düzeyleri gibi). Deneysel parametreleri göz önünde bulundurulacak kullanılan Maya hücre, fiksasyon zaman, IP, sindirilmiş DNA-protein kompleksleri ve antikor kalite ve parça boyutu kullanılan Kromatin kesir konsantrasyon miktarı içerir. Bu yaklaşımın bir sınırlama olduğunu deneysel parametrelerinin optimizasyonu test edilen her Histon değişiklik ve mutant suşları ve/veya koşullar altında soruşturma için genellikle gerekli. Histon işareti düzeyleri veya yerelleştirme farklı koşullar altında ince farklılıklar olabilir ve yetenek bu farklılıkları algılamak için yukarıda açıklanan parametrelere bağlıdır. Biz bazı en hassas deneysel yaklaşımlar aşağıda geliştirmek için kritik noktalar tartışıyorlar.
İletişim kuralında açıklandığı gibi birden çok tam çip deney gerçekleştirmeden önce en yüksek konsantrasyonu belirlemek için MNase konsantrasyonları test etmek için tavsiye edilir. IP içinde DNA yeterince parçalanmış sağlanması yüksek çözünürlüklü chIP sonuçları elde etmek için bir anahtardır. QPCR ürünleri amplicon boyutunu küçük olsa bile (genellikle 100 bp), DNA parçası boyutunu önemli ölçüde daha büyük, qPCR zenginleştirme belirli bir odağı, aslında, Histon işareti yerelleştirilmiş olabilir zaman göstermek yanlış ise basepairs uzakta yüzlerce. Kromatin mono - ve di-oluşturarlar içine, solubilize MNase bu protokole dayanan diğer çip iletişim kuralları da yaygın sonication Kromatin6,7yamultmak için kullanın. Sonication de kesme boyutları daha az uniform olma eğilimindedir ve denemeleri arasında tutarlı sonuçlar elde etmek daha zor olabilir, ancak Kromatin parçaları, Çözücü için güvenilir bir yöntemdir. Sonication için bazı sigara Histon proteinleri çip tercih olabilir, ancak Kromatin öncelikle mono-oluşturarlar sindirmek için MNase kullanımını Histon modifikasyon chIP deneyler çözünürlüğü artırabilir.
Bir başarılı çip deneme için benzersiz ve yüksek benzeşimli faiz Histon modifikasyonu tanıyan bir antikor gereksinimdir. Birincil çip Histon değişiklik algılama için bir yöntem olarak bir yüksek kaliteli, doğrulanmış antikor üzerindeki güven kısıtlamasıdır; Böyle bir reaktif, küçük parça--dan elde edilen sonuçlar biyolojik olarak alakalı olacak şekilde olası değildir. Kalite ve antikorlar geçerliliğini olmasına rağmen değişken piyasada bulunan antikorlar karşı Histon değişiklikler içinde mayası, buldum bir dizi vardır. Çabaları Bu antikorlar doğrulamak için verilen deney26en iyi kullanılabilir antikor belirlenmesi için yararlı kaynaklar doğurmuştur. Bu antikorlar küçük parça için kullanılan yöntemleri tarafından değiştirilmiş ve unmodified Histon peptidler problama dizileri de dahil olmak üzere, Batı lekesi içinde ve bütün hücre özleri ve arıtılmış Histon gerçekleştirme olmalarından için bir çeşitlilik ile doğrulanır önerilir silinmiş veya değiştirilmiş Histon kalıntı nokta mutasyon taşıyan değiştirme bir enzim suşları gibi uygun denetimler ile çip deneyler. Uncharacterized işaretleri tanımak yeni antikorlar veya laboratuvar tarafından üretilen antikorlar için bu özgüllüğü deneyler antikor çip için geçerli bir reaktif olabilir olup olmadığını belirlemek için önemlidir.Antikor özgüllük doğrulama ek olarak, bir wildtype yük ve bir negatif kontrol yük IP için bir antikor titrasyonu gerçekleştirme kez (bir küme Kromatin konsantrasyon göre) gerekli antikor miktarı için belirlemek için kullanışlıdır doğru zenginleştirme suşları veya bölgelerde genom kopyası arasındaki farkları tespit. Ayrıca, bazı veri işaretinin genomik dağıtım desenleri ile ilgili bilinen, pozitif ve negatif ise denetim astar kümeleri tüm qPCR deneylerde herhangi bir bireysel deneme doğrulamak ve deneyler arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için eklenmelidir.
Genel olarak, bu iş için araştırmacılar Histon değişiklik durumu mayası genomik herhangi bir bölgede, sorguya baktılar temel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ve onun uygulanabilirliği çeşitli deneysel sorulara çok yönlülük Kromatin dynamics moleküler seviyede dissekan için son derece yararlı bir araç yapar.

Histon dinamik translasyonel modifikasyon (PTM) transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2de dahil olmak üzere birçok DNA şablonu esas alan işlemler için anahtar yasal bir mekanizmadır. Bereket ve değiştirilmiş Histon bu işlemlerle eşlik eden hassas yerelleştirme belirlemek için bu nedenle onların yönetmelik hücrenin farklı koşullar altında anlamak için kritik yeteneğidir. Kromatin immunoprecipitation (çip) gelişimi büyük ölçüde protein etkileşimler DNA, biyokimyasal çalışmalar özellikle vitro yöntemleri kullanarak kimyasal crosslinkers kaynaklandığını bir yöntem olarak değerlendirmek için ihtiyaç ile birleştiğinde dinamik yapısı protein-DNA etkileşimleri vivo içinde ve özel bölgeler genom3,4,5. Kantitatif PCR (qPCR) ve sıralama teknolojileri gelişme da çip deneyler ile kantitatif karşılaştırmalar ve bütün genleri, DNA-protein etkileşimleri, anatomi için güçlü bir araç yapma arasında gerçekleştirme olanağı genişledi birden çok düzeyi.
Doğrudan bir değiştirilmiş Histon ve içinde belirli genomik locus arasındaki fiziksel bağlantıyı sorguya için karşılaştırılabilir hiçbir yöntem olduğundan şu anda, genom kopyası Kromatin aracılı yönetmelikte baktılar herhangi bir araştırma grubu için gerekli bir yöntem yongadır vivo. Histon değişiklikler genom6,7 boyunca eşlemek için sonraki nesil sıralama kullanma bu yöntem varyasyonları mevcut olmasına rağmen bu yaklaşımların adresi olabilir farklı bilimsel sorular ve ölçek, maliyet ve teknik kaynaklar için bazı araştırma grupları sınırlama. Buna ek olarak, hedeflenen chIP-qPCR bunlar tamamlayacak gereklidir yaklaşımlar yöntemleri her ikisine de sağlayarak en iyi duruma getirme çip protokol sıralama öncesinde ve epigenomic veri kümesinden gelen sonuçları doğrulamak için. Kütle spektrometresi dayalı yaklaşımlar genomik bölgeleri ile ilişkili işaretleri var Ayrıca Histon tam Kompleman belirlenmesi8,9,10,11, ancak, ortaya için bunlar yaklaşımlar ile ilgili hangi bölgelerinde genom probed ve teknik uzmanlık ve tüm araştırma gruplarına kullanılamaz araçları gerektirir bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Bu nedenle, çip bolluk ve dağıtım Histon değişiklikler tüm araştırma grupları epigenetik, Kromatin ve genomik fonksiyonları düzenleme ilgi için çeşitli koşullar altında analiz etmek için temel bir yöntem kalır.
Burada, mayası kullanarak çip Histon PTMs, Kromatin dağılımı araştırmaya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) model için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım bir dizi çekirdek bileşen Maya geliştirilen ve aynı zamanda çeşitli model sistemleri12,13için uygulanan çip iletişim kuralları kullanır. Değiştirilmiş Histon ve hücredeki DNA arasındaki etkileşimler crosslinking formaldehit ile tarafından korunur. Lysate hazırlık Kromatin parçaları sindirim micrococcal nükleaz ile eşit büyüklükte parçalara çözündürüldükten. Değiştirilmiş Histon Immunoprecipitation ticari veya laboratuvar tarafından üretilen antikorlar ile gerçekleştirilir ve ilişkili herhangi bir DNA izole ve zenginleştirme, qPCR (şekil 1) kullanarak belirli genomik bölge için analiz. Birçok Histon değişiklikler için bu protokolü elde edilen DNA miktarı 25'ten fazla farklı genomik loci qPCR tarafından test etmek için yeterlidir.
Bu çip yöntem çok yönlü bir tek Histon değişiklik dağıtımını birden fazla mutant suşları veya çevre koşulları üzerinde izlemek için veya birden fazla Histon değişiklik, genomik loci birkaç wildtype hücrelerinde test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, çok sayıda protokol ya da son derece - veya aşağı-bol Histon işaretleri tespiti en iyi duruma getirmek için kolayca ayarlanabilir bileşenleridir. Son olarak, değiştirilmiş Histon parçasının içinde mayası gerçekleştirmek büyük ölçüde diğer sistemlerde kullanılamaz antikor özgüllük için anahtar denetimlerini kullanmak için fırsat sağlar. Yani, Maya suşları değiştirilmesi için hedeflenir Histon artıkları nokta mutasyon taşıyan oluşturulabilir ve, bazı durumlarda, orada belirli Histon kalıntısı üzerinde değişiklik tromboksan yalnızca tek bir enzim (örn. Histon lizin methyltransferases). Bu nedenle, çip için non-spesifik antikor bağlanması olabilir meydana gelen ve yanlış pozitif sonuçlar üreten ölçüde tahlil için her iki Histon mutant veya enzim silme suşları içinde gerçekleştirilir. Bu denetim yeni geliştirilmiş antikorlar için özellikle değerlidir ve hatta antikor özgüllük bunların kullanımı öncesi korunmuş Histon değişiklikler için diğer sistemlerde doğrulamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım (mono-, di - ve gibi tri-metilasyonu), farklı değişiklik devletler arasında ayırt antikor özgüllük test etmek için diğer yöntemleri tamamlar sondalama değiştirilmiş peptidler dizileri ve Histon Batı lekesi gerçekleştirmek de dahil olmak üzere veya oluşturarlar tanımlanmış değişiklikler ile. Genel olarak, mayası yongasında Histon PTMs genom boyunca dinamikleri değerlendirilmesi ve onların yönetmelik yönetim mekanizmaları dissekan için güçlü bir yöntemdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">Y20025-1000.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Peptone</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">P20250-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Dextrose</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC12007-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Tris</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">74385</td>
			<td>Equivalent to NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">MgCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">CaCl2</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">20899-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">LiCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">AC413271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">M107-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">30970-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10190-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:301px;">VWR Life Science</td>
			<td>97064-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:301px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">100720-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycogen</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Proteinase K</td>
			<td>Research Products International (RPI)</td>
			<td>P50220-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">RNase A&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Bradford Assay Reagent</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;BSA Standard 2 mg/mL</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>04-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4K16ac</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABE532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3</td>
			<td style="width:301px;">Abcam</td>
			<td style="width:164px;">ab1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3K4me2</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;High Rox qPCR Mix</td>
			<td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td>
			<td>ACC-PR2000-L-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protein A/G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>88803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">magnetic stand for 1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI-21359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acid-Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Microtube Homogenizer</td>
			<td style="width:301px;">Benchmark</td>
			<td>D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z763837-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Gel loading tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cuvettes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">50-476-476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Parafilm</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">384-Well PCR Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-1384W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Gyratory Floor Shaker</td>
			<td style="width:301px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:164px;">Model G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">ND-2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">&#160;Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:301px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:164px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

Histon translasyonel modifikasyonlar (PTMs), metilasyon, fosforilasyon ve asetilasyon gibi dinamik olarak bir dizi hücre tarafından alınan sinyaller yanıt olarak bu işaretleri ekleyip enzimler tarafından düzenlenmektedir. Bu PTMS gibi işlemleri gen ifadesi denetim Yönetmeliği için önemli katkı kaynağı sağlamaktadır ve DNA tamir. Kromatin immunoprecipitation (çip) bolluk ve çeşitli tedirginlikler hücreye karşılık olarak genom boyunca birçok Histon PTMs lokalizasyonu dissekan için enstrümantal bir yaklaşım oldu. Burada, post-translationally değiştirilmiş Histon da tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem proteinler ve DNA formaldehit tedavi maya kültürleri kullanarak polietilenin dayanır mantar lysates yenerek, solubilization, Kromatin parçacıkları tarafından micrococcal nükleaz ve Histon DNA'ın immunoprecipitation boncuk tarafından nesil kompleksleri. Faiz Histon işareti ile ilgili DNA saflaştırılmış ve onun zenginleştirme genom boyunca birden çok loci, değerlendirmek için kantitatif PCR analize tabi. Histon işaretleri H3K4me2 ve H4K16ac wildtype ve mutant Maya lokalizasyonu sondalama temsilcisi deneyler veri analizi ve yorumu göstermek için ele alınmıştır. Bu yöntem Histon PTMs çeşitli için uygundur ve farklı mutant suşları ile veya değişiklikleri Kromatin dinamikleri farklı koşullar altında soruşturma için mükemmel bir araç yapma farklı çevresel stresleri varlığında yapılabilir.

Bu iletişim kuralı bir anahtar bileşeni micrococcal nükleaz (MNase) adım 10 içinde özetlenen Kromatin çözünür parçaları sindirmek için kullanılan konsantrasyonu optimize ediyor. Bu ilgi Histon değişiklikler genomik bölgeler itibariyle dağılımı ile ilgili yüksek çözünürlüklü veri elde etmek için önemlidir. Bir MNase titrasyon öncelikle mono-oluşturarlar di-oluşturarlar çözünür Kromatin kesir daha küçük miktarda elde etmek için en uygun konsantrasyonu belirlemek için yapılmalıdır. Bu görüntülenmeyecektir DNA ayıklayarak Kromatin içeren Pelet MNase hazım takip ve özel performans Jel Elektroforez (Şekil 2). Burada kullanılan MNase hazırlanması, enzim, 20 adet/µL 2.5 µL ağırlıklı olarak mono-oluşturarlar üretilen ve bu nedenle bu miktar küçük parça için kullanıldı.
İki temsilcisi sonuçları kümesi bu çip yordamı (şekil 3) gösterilir. İlk örnekte bir Histon metil işareti wildtype hücreleri ya da bu işareti tromboksan metiltransferaz eksik hücrelerin içinde değerlendirilir. Özellikle, çip ile bir antikor H3K4me2 karşı yanı sıra Histon H3 karşı wildtype ve set1Δ hücrelerdeki bir denetim olarak gerçekleştirildi. H3K4me2 öncelikle yerelleştirir sadece aşağı, transkripsiyon site Kodlayıcı bölgeler 5' sonunda başlamak ve Set1 yokluğunda, hücreleri17,18,19' H3K4me2 tespit edilemez. Set1Δ zorlanma bu nedenle diğer Histon işaretleri veya DNA non-spesifik bağlamaya antikor ilişkilendirilebilir arka plan sinyal miktarını belirtmek için denetimi olarak hizmet vermektedir. Bu durumda, wildtype soy H3K4me2 sonunda 5' sinyal yok set1Δ gözlendi, ancak Set1, PMA1 ve ERG1120,21, doğrudan hedef olarak bilinen iki gen için açık zenginleştirme gösterdi hücreleri (şekil 3A). Beklendiği gibi hiçbir zenginleştirme telomer (TEL) 07 L, H3K4me2 işareti vardır. H3K4me2 sonunda 5' SPR3 ORF zenginlik gözlenen düzeyleri için en benzer olduğunu ancak orta sporulation gen SPR3 ifadesi de Set122,23tarafından düzenlenmiş olması bildirilmiştir TEL07L, ya PMA1 ya da ERG11ile karşılaştırıldığında. Bu metil işareti lokalizasyonu değerlendirilmesi Set1 aracılı, düzenleme, SPR3 tarafından daha önceden gözlenen22olarak farklı bir mekanizma PMA1 veya ERG11, oluşma olasılığı olduğunu gösterir.
İkinci örnekte, acetylated H4K16 da H4K16ac işaretleri kaldırır Histon göre H4 wildtype hücreleri ve hücre Histon deacetylase Sir2, eksik gösterilir. H4K16ac heterochromatic benzeri Kromatin telomer yakın tükenmiş ve telomer24,25, distal euchromatin içinde TEL07L ve TEL15L (şekil için gösterildiği zenginleştirilmiş 3B). Denetim gen PMA1nerede Sir2 bilinmemektedir yerelleştirmek için herhangi bir değişiklik görülmektedir, ancak buna ek olarak, Sir2 kaybı artış belirli bölgelerde, telomeric ve subtelomeric, H4K16ac neden olur. Çip parametreleri ise bu veri sir2Δ hücrelerdeki H4K16ac seviyelerinde net bir artış gösterirken, H3K4me2 içinde değişiklik set1Δ hücreleri karşı wildtype olarak önemli olması beklenen değil, H4K16ac tespit edilen değişiklik görünmeyebilir düzgün bir şekilde en iyi duruma getirilmiş. Optimizasyonu için öneriler tartışmaya açıklanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57080/57080fig1.jpg"> 
Şekil 1: Çip yordamı kronolojisi. Normal zamanlama çipi protokolü için gösterilir. Olası değişimler metinde belirtilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57080/57080fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57080/57080fig2.jpg"> 
Resim 2: Test MNase sindirim için mono-oluşturarlar solubilization. Özel Jel Elektroforez Kromatin Pelet MNase değişen miktarlarda ile sindirim ardından izole DNA'ın (20 adet/µL). Mononucleosomes DNA'dan geçirir yaklaşık 150 bp, polynucleosomes üzerinden yaklaşık 300 bp ve DNA dinucleosomes üzerinden giderek daha yüksek moleküler ağırlık vasıl bulundu. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57080/57080fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57080/57080fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Cips, H3K4me2 ve H4K16ac wildtype ve mutant Maya suşları. H3K4me2 ve H3 karşı antikor kullanarak(a)ChIP wildtype ve set1Δ hücrelerde gerçekleştirilen. Yüzde giriş her astar çifti için H3K4me2 ve H3 IP adresleri için hesaplanır ve oranı H3K4me2 belirtilen loci, göreceli zenginlik belirtmek için grafiği çizilecek. TEL07L astar çift kromozom 7 Sol kolundaki telomer bitişik ise PMA1, ERG11 ve SPR3 için astar amplicons sonunda 5' her ORF oluşturmak. Üç biyolojik çoğaltır ortalaması gösterilir ve standart hata ortalamaya hata çubukları temsil eder. (B) çip H4K16ac ve wildtype ve sir2Δ hücrelerdeki H4 tanıma antikorlar ile gerçekleştirilen ve çizilen şekil 3Aiçin açıklandığı gibi. Astar çiftleri yükseltmek dizileri telomerlerin (TEL07L ve TEL15L) bitişik ve aşağı akım içinde önceden tanımlanmış her subtelomere euchromatic bölgelerinde (21 kb ve 5 kb telomer, distal sırasıyla).<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57080/57080fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zorlanma numarası</td>
			<td>Genotip</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yEG230</td>
			<td>MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yEG223</td>
			<td>MATα sir2Δ::NATMX</td>
			<td>Bu çalışmada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yEG232</td>
			<td>MATa set1Δ::KANMX</td>
			<td>23</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Maya suşları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligo numarası</td>
			<td>Konumu</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG141</td>
			<td>TELVIIL F</td>
			<td>AGCCCGAGCCTGTACTAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG142</td>
			<td>TELVIIL R</td>
			<td>CAAAAGAAACTTTTCATGGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG153</td>
			<td>5' PMA1 F</td>
			<td>TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG154</td>
			<td>5' PMA1 R</td>
			<td>CGTCGACACCGTGATTAGATTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG220</td>
			<td>TELVIIL + 21KB F</td>
			<td>AAACAATGGGACCCTTCTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG221</td>
			<td>TELVIIL + 21KB R</td>
			<td>AACACCTTGCAAAACACAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG280</td>
			<td>TELXVL F</td>
			<td>ATCCTGCAATTGGGCCACTAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG281</td>
			<td>TELXVL R</td>
			<td>AGCGGAAGGCATATTAACGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG282</td>
			<td>TELXVL + 5KB F</td>
			<td>AGGCGATGTAATCTCACCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG283</td>
			<td>TELXVL + 5KB R</td>
			<td>CATTCACACATCCTGCTACCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG568</td>
			<td>ERG11 F</td>
			<td>CCTCTTATTCCGTCGGTGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG569</td>
			<td>ERG11 R</td>
			<td>TGTGTCTACCACCACCGAAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG963</td>
			<td>SPR3 F</td>
			<td>TCTGGATTCGCTGAGGAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oEG964</td>
			<td>SPR3 R</td>
			<td>TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan astar.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K Görüntüleme.  University of Maryland. Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...