Moustafa Saleh ve Jay Tourigny&#39;ye el yazması ile Steven Hahn ve Steven Henikoff&#39;un eleştirel okumaları için ChEC-seq&#39;in gelişimi boyunca rehberlik ve destek için ve arabulucu kompleksine uygulanmasından dolayı teşekkür ediyoruz. SG, NIH bağışları R01GM053451 ve R01GM075114 tarafından desteklenmektedir ve GEZ, Indiana Üniversitesi başlangıç ​​fonlarıyla desteklenmektedir.

1. Maya Suşlarının Üretimi <ol><li> MNase ile işaretlenmiş ilgi faktörünü taşıyan bir maya suşu üretin. <ol><li> PCR belirtilen reaksiyon karışımını ( Tablo 2 ) ve bisiklet koşullarını ( Tablo 3 ) kullanarak MNase etiketleme kasetini istenen vektörden ( Tablo 1 ) yükseltin. 5 μL PCR reaksiyonu ve 1 μL 6X DNA yükleme boyası karıştırın. Her bir PCR alikotu,% 0.8 agaroz jeli üzerinde 120 V&#39;de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 2.3 kb&#39;dir. </li><li> Standart lityum asetat dönüşümü 22 kullanarak amplifiye edilmiş etiketleme kasetini seçme suyuna dönüştürün ve seçim yapın. </li><li> Etiketleme kasetinin koloni PCR ile doğru şekilde entegrasyonunu doğrulayın. <ol><li> Belirlenen reaksiyon karışımını ( Tablo 4 ), taranacak koloni sayısı için hazırlayın. Gerekirse buzda tutun. </li><li> Her bir koloni için tes için bir parça seçinSteril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak bir PCR tüpünün altına yerleştirildi. </li><li> Toplanan kolonileri 1 dakika yüksek güçte mikrodalga ile yıkayın. </li><li> Mikro dalgalı koloni ve pipet her biri için 50 μL PCR karışımı ( Tablo 4 ) ekleyin ve karıştırın. Belirtilen döngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin ( Tablo 5 ). </li><li> Her bir PCR tüpüne 50 μL PCR reaksiyonu ve 10 μL 6X DNA yükleme boya maddesi karıştırın. Her bir örnekten 10 uL,% 1 agaroz jeli üzerinde 120 V&#39;de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 700 bp&#39;dir. NOT: İstenirse, MNase füzyon proteininin uygun ekspresyonunu western blotting yoluyla doğrulayın. Etiketli proteinin moleküler ağırlığında ~ 20.6 kilodaltonluk bir kayma bekleniyor. </li></ol></li></ol></li><li> İlgi geninin promotörünün pGZ136&#39;ya (Tablo 1) homoloji bazlı klonlanması ve adım 1.1.2&#39;deki gibi transformasyon ve seleksiyon yoluyla serbest bir MNase suşu üretin. <ol><li> AlternatiAyrıca ilgi geninin promotörünü ve 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;yi bir plazmid vektörüne birleştirin, transformasyon yapın ve adım 1.1.2&#39;de olduğu gibi seçin ve plazmanın idame ettirilmesi için uygun seçici durumda streyni büyütün. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> ChEC deneyinden önceki günün öğleden sonra / akşamı, MNase etiketli faktörü taşıyan tek bir koloni bulunan 3 mL maya pepton-dekstroz (YPD) veya uygun seçici besiyerini aşılayın. Bu kültüre gece boyunca inkübe edin (180 RPM sallayarak, 30 ° C). </li><li> ChEC deneyinin sabahı sabah, gece kültürü 50 mL ortam içine 600 nm&#39;de (OD 600 ) 0,2-0,3 optik yoğunluğa kadar sulandırın. Bu kültürü kuluçkalayın (180 RPM sallayarak, 30 ° C), 0.5-0.7&#39;lik bir OD 600&#39;e ulaşıncaya kadar inkübe edin. Kültür uygun OD 600&#39;e yaklaştıkça, ısı bloğu veya su banyosu 30 ° C&#39;ye ayarlanır ve çözülmeye başlar Tampon A katkı maddeleri ( Ta6). </li><li> Kültür başına 5 mL Tampon A artı katkı maddeleri ( Tablo 6 ) hazırlayın. Prosedür sırasında tampon A&#39;yı RT olarak tutun. </li><li> Toplanan her zaman noktası için 90 μL durdurma çözeltisi ( Tablo 7 ) ve 10 μL% 10 SDS içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 s, 30 s, 1 dak, 2.5 dak, 5 dak ve 10 dakıktaki örnekleri alın. </li><li> 1 saat boyunca 1,500 xg ve oda sıcaklığında (RT) 50 mL konik tüp ve santrifüj içine boşaltılmış kültür. </li><li> Hücreleri 1 mL Tampon A&#39;ya iyice süspanse edin ve yeniden süspanse edilen hücreleri bir mikrofüzyon tüpüne aktarın. Pelet, hücreleri, 1.500 xg&#39;de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge&#39;de yeniden askıya aldı. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve yukarı ve aşağı pipetleme yapılarak hücreleri 1 mL Tampon A&#39;ya iyice süspansiyon haline getirin. Pelet, hücreleri, 1.500 xg&#39;de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge&#39;de yeniden askıya aldı. Bu adımı bir kez tekrarlayın. </li><li> Hücreleri, 570 μL Tampon A içinde iyice süspansiyon haline getirin. 30 μL% 2&#39;lik digitonin ekleyin(% 0.1 son konsantrasyon) ilave edin ve karışımı tersine çevirin. </li><li> Isı blokunda veya su banyosunda 30 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hücrelerin geçirgen hale getirilmesi. </li><li> Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için reaksiyonu yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Durma çözeltisi ve SDS (adım 2.4) içeren bir mikrofuze tüpüne negatif bir kontrol olarak geçirgen hale getirilmiş hücrelerin 100 uL&#39;lik bir bölümünü çıkarın ve karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin. </li><li> MNase&#39;i aktive etmek için permeabilize hücrelere 1.1 uL 1 M CaCl 2 (2 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve birkaç kez çabucak ters çevirin veya karıştırmak için kısa sürede vorteksleyin. Karışık reaksiyonu hemen 30 ° C&#39;ye getirin ve bir zamanlayıcı başlatın. </li><li> Toplanacak her zaman noktada, hücrelerin eşit bir şekilde dağılımını sağlamak için tepkiyi pipetle aşağı ve yukarı doğru pipetleyin, daha sonra karışımı durdurmak için çözelti ve SDS ve vorteks içeren bir mikrofuge tüpüne 100μL&#39;lik bir alıkon sıvı atın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 saniye (CaCI 2 eklenmemiştir), 30 saniye, 1 dakika, 2.5 dakika, 5 dakika ve 10 dakika zaman noktaları. NOT: 30 ° C&#39;de DNA&#39;yı hızla bölen faktörlere sahip ChEC deneyleri, MNase bölünme kinetiğini yavaşlatmak için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir. </li><li> Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, her bir numuneye 4 mg&#39;lik 20 mg / mL proteinaz K ilave edin, karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin ve 30 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, iyice karıştırmak için girdapla çalkalayın ve 5 dakika boyunca bir mikrofuzudaki maksimum hızda ve RT&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her sulu fazı (~ 150 mcL) yeni bir tüp haline getirin. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika boyunca veya çözelti viskoz olana kadar karıştırmak ve çökelmek için şiddetle girdaplayın. </li><li> Pelet DNA&#39;yı maksimum hızla ve 4 ° C&#39;de bir mikrofüjde 10 dakika çöktürdü. </li><li> Süzüntü süpernatantları ve 1 mL RT% 70 etanol ile yıkanır peletler. </li><li> Kararsız etanol, geri kalan kısmınD kağıt havlu üzerindeki tüplere hafifçe vurarak. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk. </li><li> Pelletler kuruyorken, her biri 10 mg / mL RNaz A&#39;nın her biri pH 8,0 + 1 μL olan Tris 29 mcL&#39;de kurutulmuş peletleri tekrar süspanse etmek için bir ana karışım hazırlayın. RNA&#39;yı 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca sindirin. </li><li> Her bir örnekten 5 μL&#39;lik 6X DNA yükleme boyası ile 1 μL karıştırın ve 40 dakika süreyle 120 V&#39;de% 1.5 agaroz jeli üzerinde çalıştırın. </li></ol> 3. Boyut Seçimi NOT: Boyut seçiminin amacı, çok kilobarlı genomik DNA fragmanlarını örneklenecek örnekten çıkarmak ve yaklaşık 150 bp (yaklaşık olarak nükleozomal DNA boyutu) veya daha küçük fragmanlarını zenginleştirmektir. Sıralama verisinde, &lt;400 bp&#39;lik fragmanlar, nükleozomal DNA boyutu (yaklaşık 150 bp) çevresinde belirgin bir zirve ve subnükleozomal fragmanların doruğa veya geniş dağılımı ile zenginleştirilmiştir. &lt;ol&gt; <li> Her bir numuneye, bir polietilen glikol (PEG) çözeltisi içinde 75 μL katı faz reversible immobilizasyon (SPRI) boncuk ekleyin ve karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Boncuk: DNA karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> SPRI boncuk inkübasyonu sırasında, her örnek için 96 uL 10 mM Tris, pH 8.0 ve 4 uL 5 M NaCl içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın. </li><li> Tüpün yan tarafında boncuklar toplamak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukların tüpün yan tarafında 2 dakika boyunca toplanmasına izin verin. </li><li> Her süpernatanı, Tris ve NaCl içeren yeni bir tüpe aktarın (adım 3.2). </li><li> Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için girdapla ve maksimum hızda santrifüjleyin ve 5 dakika boyunca bir mikrofüjde RT edin. </li><li> Her sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika veya çözelti viskoz olana kadar DNA&#39;yı çöktürün. </li><li> Pellet preciKurutulmuş DNA en yüksek hızda ve 4 ° C mikrofüjde 10 dakika boyunca. </li><li> Süzüntü süpernatantları ve 1 mL% 70 etanol ile yıkanır peletler. </li><li> Çökmeyen etanol, kalanı ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerindeki tüplere yavaşça dokunarak çıkarın. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk. </li><li> Kurutulmuş pelletleri 25 μL Tris, pH 8.0 içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Yüksek hassasiyetli bir test kullanarak örnek konsantrasyonunu belirleyin. TF ChEC deneyleri için, boyut seçildikten sonra 10-100 ng DNA rutin olarak toparlanır. </li><li> Sıralama kütüphanelerini hazırlayın. Daha önce açıklandığı gibi, boyut seçimi özelliğine sahip olmayan kütüphane hazırlama protokolleri, geniş bir yelpazedeki parçacık boyutlarının sıralamasına (25-500 bp) izin vermek için arzu edilir. </li><li> Eşleştirilmiş bit modunda sıralama kitaplıkları. Her uçta en az 25 baz dizisi, yüksek kaliteli okuma için gereklidirharitalaması. 1 ila 2 milyon okuma, bir MEÖ örneği için yeterli kapsam sağlar. NOT: ChEC-seq verilerinin analizi karmaşık bir prosedürdür ve bu makalenin kapsamı dışındadır. Veri analizi ile ilgili ayrıntılı bilgi önceki yayın 1 , 21&#39;de bulunabilir ve analiz için kullanılan özel komut dosyaları GitHub&#39;da mevcuttur (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu), ChEC-seq verilerinin komut satırı analizi için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

ChEC&#39;in kromatin üzerinde çeşitli maya protein sınıflarını haritalayabileceğini ve bunun mayada farklı TF&#39;ler ailelerine ve diğer kromatin bağlayıcı faktörlere uygulanabileceğini öngörüyoruz. ChEC-seq, çapraz bağlanma, kromatin çözünürlüğü veya antikorları gerektirmediğinden avantajlıdır. Dolayısıyla, ChEC, X-ChIP-seq&#39;de potansiyel olarak mevcut hâllerde bulunan hiper-ChIPable eser 3 , 4 ve yerli ChIP gibi, eksik protein çözünürlüğü nedeniyle yanlış negatifler gibi nesneleri önler 14 . ChEC-seq&#39;in en büyük dezavantajı, tüm enzimatik füzyon yöntemlerinde olduğu gibi, bir füzyon proteini için şarttır. Bu maya tomurcuklanmasında hızlı bir şekilde başarılabilir, ancak metazenlerde daha zahmetlidir. ChEC-seq&#39;in bir başka kısıtlaması, histon değişikliklerinin profillemesi için olduğu gibi uygulanamamasıdır. Bununla birlikte, modifikasyon bağlayıcı bir alan MNase&#39;e birleştirilebilir ve ifade edilebilir; hChEC-seq ile istone modifikasyon haritası. Bu damarda, epitopla etiketlenmiş histon modifikasyon bağlanma alanları kullanan ChIP-seq, genom çapında histon modifikasyonu desenlerinin haritasını yapmak için kullanılmıştır. Ücretsiz bir MNase kontrolünün kullanılması, ChEC-seq sonuçlarının özgüllüğünün belirlenmesinde önemlidir. Serbest MNase suşu ilgi geni için endojen promotör kontrolü altında 3xFLAG ve simian virüs 40 nükleer lokalizasyon sinyali (SV40 NLS) ile işaretlenmiş MNase taşır. Kavramsal olarak DamID çalışmalarında kullanılan erimiş Baraj kontrolüne benzer 27 ve kromatin erişilebilirliğinden dolayı spesifik olmayan bölünme kontrolleri. TF ChEC-seq için ücretsiz bir MNase kontrolü olarak, ura3 lokus 1&#39;de REB1 hızlandırıcısı tarafından tahrik edilen 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;yi entegre ettik . Mediator ChEC-seq için, integrasyon yapmayan bir plazmadaki MED8 promoterinin kontrolü altındaki 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;yi ifade ettik.D vektörü seçici ortamda muhafaza edilmiştir 21 . Her iki durumda da, serbest MNaz ile çok az bölünme gözlenmiştir. Bu nedenle, 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;nin nispeten sağlam bir yükseltici tarafından yönlendirildiği tek bir kontrol suşu çoğu deney için uygun olmalıdır. ChEC deneyini planlarken, ilgi proteininin yapısal önemi önemli olabilir. Örneğin, MNase&#39;in Reb1&#39;in C terminusuna eklenmesinin Reb1 motifleri etrafında bir asimetrik bölünme paterni verdiğini, buna karşın N-terminal MNase&#39;li Reb1&#39;in ifadesi simetrik bir bölünme paterni 1 verdiğini bulduk. Bu farklı bölünme modellerini Reb1&#39;in yapısına bağlarız. Reb1&#39;in DNA bağlama alanı, C-ucunda bulunur; Dolayısıyla, C-terminusu DNA&#39;ya yakın yapıdadır ve MNase&#39;in hareket aralığını sınırlar ve sadece C-terminali bölünmeye izin verir. Aksine, Abf1&#39;in C-ucu, nispeten yapılandırılmamıştır ve dolayısıylaMNase&#39;ye ulaşır, Abf1 bağlanma alanlarının her iki tarafında yarılmaya izin verir. Bir başka maya GRF olan Rap1 durumunda, C terminali ve MNase arasındaki bağlayıcının 33 ila 8 aa arasında kısaltılmasının, muhtemelen Rap1&#39;in C terminali bölümünün önerilen uzaklığı nedeniyle bölünmeyi ciddi olarak azaltmaya yeterli olduğunu bulduk DNA 28 . Bu gibi yapısal bir düşünce, büyük komplekslerde bulunan proteinlerin bağlanmasını harekete geçirmeye çalışırken de büyük önem taşımaktadır. Mediator&#39;un maya genomuna 21 bağlanan ChEC-seq analizimiz için kompleks içinde gömülmek yerine yapısal olarak maruz kalacağı tahmin edilen C-termini altbirimleri seçtik. MNase ile kaynaştırılan üç alt birimden biri, DNA&#39;yı sağlam bir şekilde parçalamamıştı, bu da ya, ya diğer DNA bağlama faktörleri ile olan etkileşimler ya da sterik kısıtlamaların DNA bölünmesini zayıflattığını düşündürüyordu. ChEC-seq&#39;in, maya GRF&#39;leri Abf1, Rap1 ve Reb için 4-12 kat daha yüksek tepe tespit ettiğini bulduk1 tüm zaman noktaları birlikte değerlendirildiğinde, çeşitli ChIP yaklaşımlarına göre 1 . Bu alanlar, MNase bölünme kinetiğine dayalı olarak iki sınıfa ayrılabilir. Mayal GRF&#39;ler için ChEC-seq verilerinin analizi iki geçici olarak bağlanma bölgesi sınıflandırmasını ortaya koydu. &#39;Hızlı&#39; olarak adlandırılan ilk, kalsiyum ilavesinden sonra &lt;1 dakika maksimum bölünme göstermiş ve genel olarak bilinen konsensüs motifleri ile sağlam kibritler içermektedir. &quot;Yavaş&quot; olarak adlandırılan ikincisi, kayda değer derecede bölünme seviyelerine ulaşmak için birkaç dakika sürdü ve motif eşleşmeleri tükendi. Her iki site sınıfı da, ortalama olarak, ChIP veri setlerinde bağlanma açısından zenginleştiler, buna rağmen mutlaka bu ChIP çalışmalarında tepeler olarak adlandırılmadılar. Verilen bir faktör için sitelerin çoğunluğu yavaş sitelerdi. Hızlı alanların yüksek afiniteli transkripsiyon faktörü bağlanma alanlarını temsil ettiğini, yavaş bölgeler ise bağlanma bölgesi taramasında geçici olarak örneklenen lokusları temsil ettiğini düşünüyoruz. ObMNase bölünmesinin kinetiğiyle ayrılmış iki sınıf bağlanma alanının servizasyonu, birçok ChIP-seq veri setinde gözlemi açıklayabilir; bu da, iyi yerleşmiş bir DNA bağlama özgünlüğüne sahip belirli bir faktör için çok sayıda tepe noktası bir konsensüs motifi içermez 29 : Çoğu ChIP protokolünde 10-15 dakika boyunca gerçekleştirilen formaldehit çapraz bağlanması, art arda genom ile bir faktörün geçici veya fırsatçı etkileşimlerini yakalar ve sinyal enflasyonuna yol açar. Nitekim, ChIP-ekso ve canlı hücre görüntülemesinin karşılaştırılması, durumun 2 olduğunu göstermektedir. Özellikle, Aracı ChEC-seq sinyalinin nispeten 30 s&#39;den 20 dakikaya sabit olduğu Mediator ChEC-seq sinyalleri 21&#39;de dramatik zamana bağlı bir azalma gözlemledik. Bu gözlemler göz önüne alındığında, yüksek güven veren bağlayıcı siteleri kurtarmak için kısa süreli ChEC-seq gerçekleştirmenizi öneririz. ChEC-seq&#39;in maya yerine adapte olabileceğini tahmin ediyoruzsistemleri. Uyarılmamış memeli hücrelerindeki serbest kalsiyum konsantrasyonu, etkin MNase aktivasyonu için eşik değerin çok altında 50-300 nM 30 , 32&#39;dir. Metazoan sistemlerde ChEC-seq&#39;nin oluşturulması için sınırlayıcı adım, bu nedenle, metazoada maya hücrelerinden çok daha zahmetli olan füzyon proteinlerinin üretilmesidir. Bununla birlikte, metazoan genlerinin endojen etiketlenmesi, CRISPR tabanlı genom mühendisliği 33&#39;in ortaya çıkışı ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır ve bu yüzden bu sınırlamanın kolayca üstesinden gelinmelidir. Alternatif olarak, MNase füzyon proteinleri plasmidlerden düşük seviyelerde eksprese edilebilir. Bu yaklaşım Dodesophila 34 , 35 ve insan 36 hücrelerinde DamID için oldukça başarılı olmuştur ve bu nedenle metazoan hücrelerde ChEC-seq&#39;u kolaylaştırabilir.

Transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler), kromatin yeniden biçimlendiricilerin ve diğer kromatin ile ilişkili düzenleyici faktörlerin bağlanma yerlerinin haritalandırılması, tüm kromatin esaslı işlemleri anlamak için anahtardır. Kromatin immüno çökeltme ve yüksek verimli sekanslama (ChIP-seq) yaklaşımları, genom biyolojisine ilişkin birçok önemli bilgiler edinmek için kullanılmış olsa da, önemli sınırlamalara sahiptir. Kısa süre önce, bu dezavantajları ortadan kaldırmak için kromatin endojen bölünme ve yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) 1 olarak adlandırılan alternatif bir yöntem sunduk. ChIP-seq sıklıkla protein-DNA etkileşimlerini korumak için bir başlangıç ​​formaldehid çapraz bağlama basamağı (X-ChIP-seq) ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan bir dizi çalışma, X-ChIP-seq&#39;in geçici veya nonspesifik protein-DNA etkileşimleri 2 , 3 , 4 , 5 &lt;6 , 7 , 8 , yanlış pozitif bağlanma yerlerine neden olur. Ek olarak, X-ChIP-seq deneylerinde kromatin parçalanmak için yaygın olarak kullanılan sonikasyon, açık kromatin bölgelerini keser ve bu bölgelerdeki fragmanların önyargılı olarak geri kazanılmasına neden olur 9 , 10 . Sonikasyon ayrıca, bir eksonukleç sindirim adımı eklenmesiyle 11 , 12 çözünürlüğünü büyük ölçüde artırabilecek olsa da, sonuç olarak bağlanma yeri çözünürlüğünü sınırlayan bir parçacık uzunluğunun heterojen bir karışımını üretir. Afinite ile saflaştırılmış doğal olarak izole edilmiş kromatin (ORGANIC) 13 gen alanlarının işgal edilmiş bölgeleri gibi yerli ChIP yöntemleri, formaldehit çapraz bağlanma ve sonikasyon ile ilişkili potansiyel önyargıları hafifleterek mikrokakal nükleazla (MNase) çapraz bağlama ve fragman kromatin kullanmazlar. Ancak,Doğal kromatin ekstraksiyonu için gerekli nispeten ılımlı koşullardaki birçok kromatin bağlı proteininin çözünürlüğü zayıf olup, potansiyel olarak dinamik aralık ve / veya yanlış negatiflerin azalmasına neden olur14. ChIP-seq&#39;ün çeşitli yinelemeleri, genom çapında protein-DNA etkileşimlerinin haritalanması için en çok kullanılan yöntem olmasına rağmen, ilgilenilen proteinlerin çeşitli DNA modifıye eden enzimlere kaynaşmasına dayanan çeşitli haritalama teknikleri de uygulanmıştır. Bu tür bir yaklaşım DNA&#39;nın adenine metiltransferaz tanımlaması (DamID) 15&#39;dir, burada ilgilenilen bir kromatin-bağlayıcı protein Genetik olarak Baraja kaynaştırılır ve bu füzyon, hücrelerde veya hayvanlarda eksprese edilir ve böylece GATC dizilerinin protein için bağlanma bölgelerine yakın metillenmesine yol açar. DamID, immüno çökeltiye dayanmadığı ve dolayısıyla çapraz bağlanma, antikorlar veya kromatin çözünürlüğünden kaçınması bakımından avantajlıdır. Aynı zamanda in vivo da gerçekleştirilir. ancak, DamID&#39;in çözünürlüğü kilobaz ölçeği ile sınırlıdır ve Baraj füzyon proteininin metilasyon aktivitesi yapıcıdır. Enzimatik füzyona dayanan ikinci bir yöntem Call-Card-seq 16&#39;dır ; bu, bir transpozaza bir ilgi faktörünün füzyonunu uygular ve transposonların sahaya özgü entegrasyonunu yönlendirir. DamID gibi, Calling Card-seq, immüno çöktürmeye dayalı değildir ve dolayısıyla artan çözünürlüğün ilave yararı ile benzer avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, Calling Card-seq, transpozazların sekans yanlılıkları ile sınırlanabilir ve transposon ekleme bölgelerine yakın kısıtlama alanlarının varlığına da bağımlıdır. Laemmli laboratuvarında geliştirilen üçüncü bir enzimatik füzyon yöntemi, kromatin endojen bölünme (ChEC) 17 dir . ChEC&#39;de, bir kromatin ile ilişkili protein ve MNase arasındaki bir kaynaşma, hücrelerde eksprese edilir ve MNase&#39;i aktive etmek için kalsiyum ilave edildikten sonra, DNA, etiketlenen bağlanma yerlerine proksimal olarak bölünürFaktörü ( Şekil 1 ). Güney blot ile bağlantılı olarak, ChEC maya 17 , 18&#39;de bir dizi bireysel lokusta kromatin yapısını ve protein bağlanmasını karakterize etmek için kullanılmıştır ve nükleer gözenek bileşenlerinin maya ile etkileşimini araştırmak için düşük çözünürlüklü mikro-dizi analizi ile birleştirilmiştir Genom 19 . ChEC, DamID ve Calling Card-seq&#39;ye benzer fayda sunar ve çözünürlüğü, primer uzantısı 19 ile analiz edildiğinde neredeyse tek-bazlı çifti oluşturmaktadır. ChEC de kontrol edilebilir: MNase tarafından sağlam DNA bölünmesi, canlı maya hücrelerinde gözlemlenen düşük serbest kalsiyum konsantrasyonlarında MNase&#39;in inaktif olmasını sağlayan, milimolar kalsiyum ilavesi ile ilgilidir. Daha önce, ChEC&#39;yi yüksek verimli sıralama (ChEC-seq) ile birleştirmenin, TF bağlama alanlarının yüksek çözünürlüklü haritalarını sağlayacağını varsaydık. Nitekim ChEC-seq, genom boyunca tomurcuklanan maya genel düzenleyici faktörlerin (GRF&#39;ler) Abf1, Rap1 ve Reb1&#39;in yüksek çözünürlüklü haritalarını üretti. ChEC-seq&#39;u, doğrudan DNA&#39;ya temas etmeyen ve ChIP-seq ile eşlenmeyen megadalton-boyutlu komplekslere uygulanabilirliğini genişleten, korunmuş, önemli bir global transkripsiyonel koaktivatör 21 olan modüler Mediator kompleksine başarıyla uyguladık. Tabanlı yöntemler. ChEC-seq, ChIP-seq sonuçlarının bağımsız olarak doğrulanması ve kromatin yerleşik süreçlerin düzenlenmesine ilişkin yeni anlayışların oluşturulması için güçlü bir yöntemdir. Burada, mayalanma mayasında bu yöntemin uygulanması için bir adım adım protokol sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genom çapında protein-DNA etkileşim haritalama, gen regülasyonunu, kromatin yeniden şekillendirmeyi ve diğer kromatin yerleşik süreçleri anlamak için kritiktir. Genom biyolojisine birçok değerli bilgi kazandırmak için kromatin immüno çökeltme ve ardından yüksek verimli sekanslama (X-ChIP-seq) ile yapılan formaldehit çapraz bağlama işlemi kullanılmıştır. Bununla birlikte, X-ChIP-seq&#39;in çapraz bağlama ve sonikasyon ile bağlantılı önemli sınırlamalar vardır. Yerli ChIP, bu dezavantajları çapraz bağlama yapılmadan çıkarmaktan kaçınır, ancak sıklıkla kromatin bağlı proteinlerin iyileşmesinde zayıflamaya neden olur. Buna ek olarak, tüm ChIP tabanlı yöntemler antikor kalitesi hususlarına tabidir. Protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için ilgi konusu bir proteinin bir DNA modifiye eden enzime kaynaştırılmasını içeren enzimatik yöntemler protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için de kullanılmıştır. Son zamanlarda ChEC-seq olarak yüksek verimli sekanslama ile böyle bir metot olan kromatin endojen bölünmeyi (ChEC) kombine ettik. ChEC-seq, bir kromatin-assokun kaynaşmasına dayanıyorCanlı hücrelerde kalsiyum varlığında hedeflenmiş DNA bölünmesi üretmek için mikrokakal nükleaz (MNase) ile ilgilidir. ChEC-seq, bağışıklık çökmesine dayalı değildir ve çapraz bağlama, sonikasyon, kromatin çözünürlüğü ve antikor kalitesi ile potansiyel endişeleri ortadan kaldırırken, minimum arka plan sinyali ile yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar. ChEC-seq&#39;in ChIP için güçlü bir muadil olacağını ve ChIP-seq bulgularını doğrulamak ve genomik düzenlemeye yeni bakış açıları keşfetmek için bağımsız bir araç sağlayacağını düşünüyoruz.

Başarılı bir ChEC deneyinde, DNA&#39;nın agaroz jel elektroforezi ile analizi, genomik DNA&#39;nın bulaşması ve nihai olarak tamamen sindirilmesiyle gösterildiği gibi, DNA fragmentasyonunda zamanla kalsiyuma bağlı bir artış gösterecektir. Bazı durumlarda, geleneksel bir MNaz sindirimiyle görülen bantlara benzer bir bant merdiveni uzun süre sindirildikten sonra gözlemlenir. Nükleozom tükenmiş bölgelerini (NDR) bağlayan genel düzenleyici bir faktör olan Reb1&#39;in ChEC analizi için durum böyle ( Şekil 2 ). GRF&#39;lerde hızlı sindirim sisteminin hızla bölünmüş bağlanma bölgelerinde sinyal kaybına yol açtığını gördük 1 . İdeal olarak, zamana bağlı sinyal kaybını önlemek için, Reb1 ChEC için 30 ve 1 dakikalık zaman noktaları gibi yüksek molekül ağırlıklı bulaşıkları gösteren genomik DNA bandının boyutunda bir azalma bulunan bir örnek kullanılacaktır. . <p class="jove_content" fo:keep-togetHer bir Reb1 ChEC-seq deneyinden fragman bitimlerinin görselleştirilmesi, kalsiyum eklenmemiş Reb1-MNase suşundan ve serbest MNase suşundan eşit bir süre sonra türetilen arka plan üzerinde Reb1&#39;in sağlam zenginleşmesini ortaya koymaktadır Kalsiyum tedavisi (30 s) ( Şekil 3 ). Benzer şekilde, Ortamatör altbirim Med8&#39;in MNase ile füzyonuyla önemli bir DNA klivajını gözlemledik, ancak kalsiyum ilavesinden 1 dakika sonra MED8 yükselticisi tarafından yönlendirilen serbest MNaz değil ( Şekil 3 ). Reb1 ChEC-seq verilerini ChIP-seq ile karşılaştırmak için, ORGANIC 13 tarafından belirlenen 1,991 Reb1 tepelerinin bir listesini elde ettik. Bu pikler, motif orta noktası çevresinde 100 bp&#39;lik bir pencerede her bir taban pozisyonunda ortalama fragman biti sayımı ile motif merkezlidir. Parçacıkların çoğunluğu motifin yukarı tarafına haritalanarak, bölünme sırasında çarpıcı bir asimetri gözlemledik (Şekil 4 ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig1.jpg" /> Şekil 1 : ChEC-seq Metodunun Şeması. Bir kromatin ilişkili protein (CAP) -MNaz füzyonu maya hücrelerinde eksprese edilir. Protein DNA&#39;ya bağlanır ancak çekirdekte çok düşük serbest kalsiyum nedeniyle arka plan seviyelerinin üstünde yarılma oluşturmaz. Hücrelerin digitonin ile permeabilize edilmesi ve milimolar kalsiyum ilavesi üzerine CAP-MNase füzyonları genoma bağlanır ve DNA parçalanır ve küçük parçalar salınır. Bu fragmanlar daha sonra saflaştırılır, sekanslanır ve CAP-MNase füzyonu için bağlanma bölgelerine yakın prospektif parça uçlarının zirvelerini vermek üzere genoma geri eşlenir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55836/55836fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Şekil 2 : Reb1 ChEC Deneyinden DNA&#39;nın Agaroz Jel Elektroforezi. Her ChEC zaman noktasından alınan 5 uL&#39;lik DNA parçacığı, boyut seçiminden önce% 1.5 TAE agaroz jeli üzerinde analiz edildi. Bu, Reb1-MNase füzyonuyla genomik DNA&#39;nın ilerici sindirimini gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55836/55836fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig3.jpg" /> Şekil 3 : Reb1-MNase ve Free MNase ChEC-seq Denemelerinin Genom Tarayıcı Anlık Görüntüsü. IGV, Reb1 ve serbest MNase ChEC-seq 30 sn&#39;lik kalsiyum ilavesi sonrası ve Med8 ve serbest MNase ChEC-seq&#39;den 1 dakika sonra fragment son sinyali görüntülemiştir<html> Maya genomunun temsili bir parçası boyunca ter kalsiyum ilavesi. Veri kümeleri, her bir taban konumuna eşlenen parçacıkların sayısını, eşlenen toplam parçacık sayısıyla bölünerek ve eşlenen toplam taban sayısı ile çarpılarak normalize edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55836/55836fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig4.jpg" /> Şekil 4 : Reb1 ORGANİK Sitelerinde Reb1-MNase&#39;ten salınmış parçanın zenginleşmesi. ORGANIC tarafından belirlenen 1.991 Reb1 motifleri etrafında 30 saniye Reb1 ve serbest MNase ChEC-seq fragman son sinyalinin ortalama arsa. Veriler Şekil 3&#39;deki gibi normalize edilmiştir.Lank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> plazmid </td><td> Maya seçilebilir işaretleyici </td><td> notlar </td><td> Addgene plazmid numarası </td></tr><tr><td> pGZ108 </td><td> kanMX6 </td><td> 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker </td><td> 70231 </td></tr><tr><td> pGZ109 </td><td> HIS3MX6 </td><td> 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker </td><td> 70232 </td></tr><tr><td> pGZ110 </td><td> TRP1 </td><td> 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker </td><td> 70233 </td></tr><tr><td> pGZ136 </td><td> URA3 </td><td> REB1 promotörünün kontrolü altındaki 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;sini ifade eder </td><td> 72273 </td></tr><tr><td> pGZ173 </td><td> kanMX6 </td><td> MNase tagging, 8 aa linker </td><td> 70234 </td></tr></tbody></table>Tablo 1: ChEC Plazmidlerinin Ayrıntıları. Tüm etiketleme vektörleri pFA6a vektörlerine dayalıdır ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan F2 / R1 etiketleme primer çiftleri ile uyumludur. Etiketleme kaseti, belirtilen uzunluğa sahip bir bağlayıcı, batı blotlaması ile algılanmayı kolaylaştırmak için 3xFLAG epitopundan (linker 3xFLAG etiketini çıkarmak için kısaltılmış pGZ173 hariç), MNaz&#39;ın olgun zincirini (GenBank P00644 , Aa 83 - 231) ve belirtilen seçilebilir işaretleyici. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> hacim </td><td> [Son] </td></tr><tr><td> 5x PCR tamponu </td><td> 10 mL </td><td> 1x (2 mM MgCl2) </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı (2.5 mM her bir dNTP) </td><td> 1 mL </td><td> 200 mM (50 mM her dNTP) </td></tr><tr><td> 10 mM F2 primeri </td><td> 2.5 mL </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM R1 pRimer </td><td> 2.5 mL </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) </td><td> 1 mL </td><td></td></tr><tr><td> 2 U / μL sıcak başlangıç ​​yüksek doğruluk polimeraz </td><td> 0.5 mL </td><td> 1 U </td></tr><tr><td> DdH20 </td><td> 32.5 mL </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2: 3xFLAG-MNase Etiketleme Kasetlerinin PCR Amplifikasyonu İçin Reaksiyon Karışımı. F2 / R1 primer sekansları http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt adresinde bulunabilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman </td><td> döngüleri </td></tr><tr><td> 98 </td><td> 30 s </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 98 </td><td> 10 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 30 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 72 </td&gt; <td> 1 dak. 15 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 2 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> Sonsuza dek </td><td> Ambar </td></tr></tbody></table> Tablo 3: 3xFLAG-MNase Etiketleme Kasetlerinin PCR ile Amplifikasyonu İçin Termal Çevrim Koşulları. Kuluçka sıcaklığı ve uzatma süresinin, kullanılan DNA polimerazına göre ayarlanması gerekebilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> hacim </td><td> [Son] </td></tr><tr><td> 10x Taq tamponu </td><td> 5 mL </td><td> 1x (1.5 mM MgCl2) </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı (2.5 mM her bir dNTP) </td><td> 1 mL </td><td> 200 mM (50 mM her dNTP) </td></tr><tr><td> 10 mM Kontrol primeri </td><td> 1 mL </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> 10 mM MNase-R veya negatif kontrol primeri </td><td> 1 mL </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> 5 U / mL Taq polimeraz </td><td> 0.5 mL </td><td> 2.5 U </td></tr><tr><td> DdH20 </td><td> 41.5 mL </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 4: MNase Etiketlemenin Koloni PCR Onaylama İçin Reaksiyon Karışımı. Kontrol primer sekansları http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt adresinde bulunabilir. Kontrol primeri, MNase (5&#39;-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 &#39;) içindeki bir ters primer ve bir negatif kontrol olarak ilgili genin ~ 500 baz çiftinden (bp) ters primer ile birlikte ileri primer olarak kullanılır. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman </td><td> döngüleri </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 5 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 30 s </td><td> 35 </td&gt; </tr><tr><td> 55 </td><td> 30 s </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 68 </td><td> 1 dakika </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 68 </td><td> 5 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> Sonsuza dek </td><td> Ambar </td></tr></tbody></table> Tablo 5: MNase Etiketlemenin Koloni PCR Onaylama İçin Isıl Çevrim Koşulları. Kuluçka sıcaklığı ve uzatma süresinin, kullanılan DNA polimerazına göre ayarlanması gerekebilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> hacim </td><td> [Son] </td></tr><tr><td> 1 M Tris, pH 7.5 </td><td> 1.5 mL </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 8 mL </td><td> 80 mM </td></tr><tr><td> 0,2 M EGTA </td><td> 50 mL </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> DdH20 </td><td> 100&#39;e kadar doldurmL </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 6: Tampon A için reçete. Kullanımdan önce, bir proteaz inhibitör tabletinin yarısı, 50 mcL 100 mM PMSF (1 mM nihai), 5 uL 200 mM spermin (0.2 mM nihai) ve 2.5 uL 1 M 5 mL solüsyon başına spermidin (0.5 mM son). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> hacim </td><td> [Son] </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 8 mL </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 4 mL </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> 0,2 M EGTA </td><td> 2 mL </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> DdH20 </td><td> 100 mL&#39;ye kadar doldurun </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 7: 2x Durdurma Çözümü için Reçete. 90 uL sto birleştirinP çözeltisi ile 10 μL% 10 SDS ile bir mikrofuge tüp içerisinde alınacaktır (bkz. Adım 2.4).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Görüntüleme.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz. 

Video: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...