Helty Adisetiyo, doktora ve Shangxin Yang, doktora Protokolü gelişimi için teşekkür etmek istiyorum. Genel destek için uluslararası anne çocuk ergen AIDS klinik denemeler grubu (IMPAACT) tarafından Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) ulusal kurumları, Sağlık (NIH) Ödülü numaraları altında sağlanan UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) ve UM1AI106716 (IMPAACT LC), Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (NIMH) ortak fon ile. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Tüm iletişim kuralı adımlar için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır ve sıkı kirlilik önleme yaklaşımlar alınması gerekir. Kirlenme örneklerin en aza indirmek için sonrası amplifikasyon çalışma alanları için alanları iş akışını öncesi amplifikasyon işten gözlemlemek. Kullanılan tüm malzemeler steril, ücretsiz RNase, Dnaz, DNA ve pyrogen. Tüm pipet ipuçları süzülür. Bir akış protokolü adımlardan (şekil 1) sağlanır.
1. örnek lizis
Not: Örnek lizis ve nükleik asit ayıklama mühendislik ve yordam denetimleri yerine çevre bakteri giriş örnekleri en aza indirmek için nerede bir temiz oda ortamında bir DNA/RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>Temiz Biyogüvenlik Kabini (BSC) çalışma alanı herhangi bir nükleik asit kirlenme ortadan kaldırmak için uygun yüzey temizleyici ile.</li>
		<li>Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° C'ye ayarlayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium thiocyanate lizis arabellek hazırlamak (tablo malzemeleri görmek)
	<ol>
<li>Lizis arabellek precipitates için kontrol edin. Precipitates 37 ° C'de ısınma tarafından yeniden dağıtılması</li>
		<li>6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) ile lizis tamponunun 600 µL her örnek için hazırlayın. Bir ekstra % 20 birim başına örnek göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune hazırlama
	<ol>
<li>Tam yağlı süt donmuş, buz çözme. Aliquot 5 mL bütünün 15 mL veya BSC bir 5 mL steril tüp içine süt ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>5-mL süt aliquot 5000 x g 4 ° C'de hücreler cips için de 10 min için spin.</li>
		<li>Yağ katman kaldırmak için şimdi tüp, plastik spatula ile veya büyük üst katmanda pipet ucu delik.</li>
		<li>Pelet bozmadan, tüm süpernatant 100 µL dışında kaldırın.</li>
		<li>Pelet 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspending tarafından yıkayın.</li>
		<li>1 negatif kontrol steril PBS 1 mL 5 mL tüp ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Süspansiyon temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarmak ve bir microcentrifuge 1 dk (oda sıcaklığında (RT) 5000 x g) için spin.</li>
		<li>1000 µL steril süzülmüş pipet ucu tüm süpernatant/yağ katmanı iptal etmek için kullanın.</li>
		<li>Ayıklama aynı gün kendine değil dondurursanız hücre bir etanol/kuru buz Bulamaç koyarak cips ve hemen-80 ° C dondurucu transfer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Örnek bozulma ve homojenizasyon (Boncuk atan)
	<ol>
<li>β-ME için Pelet içeren lizis arabelleği 600 µL ekleyin ve süspansiyon bir boncuk tüp aktarın.</li>
		<li>Her ayıklama toplu 12 10 örnekler, 1 negatif kontrol (3.7 yukarıdaki hazır) ve (bir sonraki adımda hazırlanan) 1 olumlu denetim içerir.<ol>
<li>1 pozitif kontrol lizis arabellek ve bakteriyel sahte örneği (kullanılan sahte bir kez hulâsa, bir konsantrasyon, DNA'ın yaklaşık 0.2 ng/µL kuran) 20 µL hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Girdap tüm tüpler 15 için şiddetle boncuk s.</li>
		<li>700-800 rpm'de sallayarak ile ısı kontrollü vortexer 10 dk, 37 ° C'de ısı örnekleri.</li>
		<li>Tüpler otomatik örnek topu bağdaştırıcı kümesi yükleyin.</li>
		<li>Boncuk 30 Hz değerinde 1 dk. için yendi.</li>
		<li>Adaptör seti sökmeye ve el ile geçiş adaptörü ile örnek plakalar sol robotik kol araç şu robot kol için ayarla.</li>
		<li>Boncuk için başka bir 1 dk 30 Hz'de yendi.</li>
		<li>Santrifüj tüpleri için 25 ° C'de 3 dk 17,200 x g de</li>
		<li>Tüm süpernatant değil almak birisi örnek veya boncuk üstündeki yağ tabakasının örnek dibinde kalan ve bir homogenizer sütun için geçerli için dikkatli olmak bir 200 µL pipet ile kaldırmak.</li>
		<li>Homogenizer sütun maksimum hızda, 17,200 x g, 25 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi</li>
		<li>DNA ve RNA (herhangi bir diğer tüp kullanmayın) arıtma için otomatik araç ile kullanmak için bir 2 mL üreticinin microcentrifuge tüp eluate 350 µL aktarın. Herhangi bir kalıntı yağlı katman aktarmak için dikkatli olun.</li>
		<li>Akış yoluyla birim daha az 350 µL ise, β-ME ile lizis tampon 350 µL son bir hacim için ekleyin.</li>
		<li>Örnekleri RT için en fazla 2 saat devam etmeden önce otomatik DNA arıtma aleti kullanarak nükleik asit yalıtım için terk veya-80 ° C'de dondurmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çalışma alanını Temizleme
	<ol>
<li>Temiz tüm yüzeylerde enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın sonra % 70 etanol ile sprey ve yüzey silin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izole DNA/RNA
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>Isı blokta açın ve 70 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>10 mM Tris-Cl, pH 8,5, 50 mL tüp ile 70 ° c içeren elüsyon arabellek (EB) sıcak</li>
		<li>350 ısınmak donmuş örnek lysates 2 mL tüpler 37 ° c kadar tamamen µL çözdürülen herhangi bir çökelti (yaklaşık 10 dakika).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA arıtma
	<ol>
<li>Girdap ve 2 mL tüpler ile örnek kısaca santrifüj (3000 x g 10 için s).</li>
		<li>2 mL tüpler otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik, üreticinin yönergelerini başına takip shaker içine yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptörleri almak ve onları örnek sayısına göre tepsi kurmak.</li>
		<li>Örnek'ın kimliği (ID) göre her rotor adaptör etiketleyin.</li>
		<li>Kapakları kesme ve DNA ve RNA için bireysel spin sütunları kenarlarını düzeltmek.</li>
		<li>DNA spin sütun koleksiyon tüp olmadan rotor adaptör yerleştirin. Toplama tüp atmak.</li>
		<li>Koleksiyon tüpler 1,5 mL etiketleyip rotor adaptör yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.</li>
		<li>Üretici 1000 µL filtre-ipuçları ipucu raflar yerleştirin.</li>
		<li>2-mL üreticinin microcentrifuge Tube (başına belirli makine Protokolü yönergeleri) örnek sayısını temel alan RNase free su ekleyin.</li>
		<li>Tüp boru yuvaya microcentrifuge tüp Slots "A" takın.</li>
		<li>Reaktif şişeleri ve 10 mL minimum hacmi ile doldurun kalan herhangi bir reaktif atmak.</li>
		<li>Reaktif şişe raf (hariç EB şişe) Reaktif şişe takın.</li>
		<li>Sıcak EB reaktif şişe pozisyon 6 50 mL tüp sizden ekleyin.</li>
		<li>Onay 1,5 mL tüpler rotor adaptörleri sıkıca yerleştirilir.</li>
		<li>Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "ekstraksiyon kiti" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Kit'in adı 350 µL bölümü A özel DNA" → düzenlemek elüsyon birime 100 µL (varsayılan) veya düşük biyokütle örnekleri → için 50 µL "Start."</li>
		<li>Tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarın ve onları tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Rotor adaptör pozisyon 3 DNA spin sütundan atmak.</li>
		<li>Rotor adaptörleri atmayın, RNA pozisyonu 2.</li>
		<li>Pozisyon 3 eluted DNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −20 ° C.</li>
		<li>Herhangi bir örnek üzerinde aksi takdirde atma bırakılırsa örnek içeren tüpler shaker ve −20 ° C, deposunda toplamak.</li>
		<li>Protokolü "Kit'in adı 350 µL Bölüm B RNA" RNA'ın daha fazla arıtma ile devam edin.</li>
		<li>RNA arıtma yaklaşık 350 µL akışı-rotor adaptörleri orta konumda olan aracılığıyla üzerinden yapılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA arıtma
	<ol>
<li>RNA spin sütun koleksiyon tüp ve kapak olmadan rotor adaptör yerleştirin.</li>
		<li>Yeni 1,5 mL tüpler koleksiyonu etiket ve el kitabında belirtildiği gibi rotor adaptör ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.</li>
		<li>Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "Üretici Kit" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Standart bölümü B RNA" → "Başlangıç."</li>
		<li>Rapor tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarmak ve tepsiye koyun.</li>
		<li>RNA spin sütun 3 konumdan atmak.</li>
		<li>3 konumundaki 30 eluted µL RNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −80 ° C.</li>
		<li>Reaktif şişe kaldırın.</li>
		<li>Rotor adaptör içeriği uygun tehlikeli atık kanallar aracılığıyla atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Temiz iş istasyonu
	<ol>
<li>Tüm otomatik DNA/RNA arıtma gerecin aksesuarları, reaktif raflar, tepsi ve diğer herhangi bir yüzey gibi enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın ve ile durulayın sprey (DI) su deiyonize sonra koyup kuruyuncaya kadar bırakın.</li>
		<li>Enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm sprey otomatik araç ile sadece üretici onaylanmış, santrifüj ile birlikte kullanılan tüm yüzeyler içini silin, 10 dakikadır bırakın ve % 70 etanol ile silin. Araç zarar verebilir dekontaminasyon çözümlerin diğer türleri kullanmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hedeflenen 16S PCR Set-up
Not: Kurulum 16S PCR için belirlenen ön amplifikasyon çalışma alanı temiz oda içinde bulunan gerçekleştirilir. Reaktifler ve örnekleri hazırlanan ve PCR nüsha (96 toplam nüsha gerçek örnekleri ve ayıklama pozitif ve negatif kontrolleri artı 2 PCR su kontrol dahil 30 örnekleri, her örnek için gerçekleştirmek için sıvı işleyicisi üzerine yüklenen kombine örnekleri ve denetimleri). PCR reaksiyonları toplandı ve kapalı sonra örnek plaka bisiklet için bir sonrası amplifikasyon bölgesinde yer alan bir termal cycler transfer edilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>PCR iş istasyonunuzu temizledikten. Sprey bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, takip ve sonunda % 70 etanol.</li>
		<li>16S PCR çalışma hazırlama (bkz: hedefli 16S PCR çalışma) bir doğru örnek liste ve ata farklı barkodlu astar her örnek9. Çalışma sayfası ve (bkz: plaka 1) plaka haritalar yazdırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR ana karışım hazırlama Not: 16S astar seçimi belirli çalışma için ilgi bölge dayanır ve çalışma veya örnek türüne göre değişebilir. Bu nedenle, astar siparişi vermeden önce bu 16S rRNA en iyi hangi alanda ilgi belirli çalışma için mikropların yükselterek onaylamak önemlidir. Yazılı olarak bu 16S V4 bölge amplifikasyon için iletişim kuralıdır. Farklı astar/bölge seçilmişse, termal Bisiklet tavlama sıcaklığı ayar gerektirebilir.<ol>
<li>Her şeyi hazırlamak için PCR iş istasyonu içinde çalışmak.</li>
		<li>50-100 µL DNA örnekleri-20 ° c ve gerekli tüm Kimyasalları almak ve onları buz çözme. Girdap ve kısa bir süre spin aşağı.</li>
		<li>Astar 5 mikron 20 µL en küçük bir birim içinde çalışma konsantrasyonu için önceden seyreltilmiş.</li>
		<li>Yalnızca çalışma sayfasında hesaplama göre ileri astar ile belirli 5 mL tüp ana PCR karışımında hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Robot sıvı işleyicisi otomatik PCR kurulum için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Örnekleri, 32-şey gerecin örnek adaptörü almak ve 50-100 µL üretici yönergelerine göre 96-şey plaka haritaya göre DNA örnekleri yükleyin.<ol>
<li>Her PCR plaka için temiz örnek tüpte 30 µL PCR su koyarak 2 negatif denetimlerini ayarlayın.</li>
			<li>Tüm örnekleri açık konumda kilitli kapaklar ile 32-şey gerecin örnek bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ters astar9 için<ol>
<li>Belirli Bar kod içeren her ters astar kapağını çıkarın #'tek bir seferde (değişiklik eldiven arasında çapraz bulaşma önlemek için).</li>
			<li>En fazla 32 astar gerecin reaktif bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96-şey PCR tabak almak ve çalışma adı, örnek numarası, Tarih ve teknisyen baş harfleri ile etiketleyin.</li>
		<li>Robot sıvı işleyicisi yükleme<ol>
<li>Reaktif adaptör B1 bulunduğu yer. Bir kenar efekti önlemek için dikkatli bir şekilde bağdaştırıcı kavrama tarafına karşı bir kenarına yerleştirin ve yavaş yavaş diğer kenarına getirmek. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.</li>
			<li>Yer konum C1 örnek adaptör. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.</li>
			<li>Girdap 5 mL ana mix, kapağı açın ve pozisyon a cihazın ana mix ve reaktif blok üzerine yerleştirin.</li>
			<li>PCR plaka yarı etekli PCR plakaları tutma amaçlı 96-şey gerecin bağdaştırıcısında yerleştirin.</li>
			<li>Çalıştır başlatın ve yeni bir dosya olarak kaydedin.</li>
			<li>Yönergeleri izleyin ve onay işaretini her sorulduğunda: bir, ipuçları vardır, iki, atık kutusu kullanılabilir ve üç, başla.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çalışma tamamlandıktan sonra hata iletileri için makine kontrol ederek hiçbir hataları olduğunu doğrulayın.</li>
		<li>12 veya 8 şerit kapaklar, girdap ile plaka şiddetle, mühür ve bir 96-şey plaka spinner kullanarak 1dk için spin aşağı ve buz üzerinde veya buzdolabında yerleştirin.</li>
		<li>Ters astar ve örnekleri içeren tüpler kaldırın.</li>
		<li>96-şey plaka sonrası amplifikasyon odasına götürün ve termal cycler ve döngüsü (bkz. Tablo 1) termal Bisiklete binme koşullardan tabloya göre tabağa yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hedeflenen 16S Post-PCR kalite kontrol Jel Elektroforez için teyp tabanlı platformu kullanarak
Not: Post-PCR kalite kontrol (QC) ve tüm sonraki adımları laboratuar bir belirlenmiş sonrası amplifikasyon alanda yapılmaktadır. DNA otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisinde analiz edilir.
<ol><li>
Çalışma alanı hazırlama
	<ol>
<li>İş istasyonu bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, ardından püskürtme ve % 70 etanol tarafından nihayet temiz.</li>
		<li>Tüm malzeme ve ekipman gerekli toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktifler hazırlamak
	<ol>
<li>Örnek arabellek ve merdiven 30 dk en az 25 ° c ısı kontrollü vortexer yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reaktifleri ısınma iken, PCR örnekleri 3 PCR çoğaltır her örnek için bir tek tüp havuzu tarafından hazırlamak</li>
	<li>Cihazda örnekleri yükleyin.</li>
	<li>Kısaca girdap ve tüpler havuza alınan PCR ürünü ile aşağı spin.</li>
	<li>Cihazın 96-şey plaka RT bir raf yerleştirin ve etiketleyin.</li>
	<li>Kısaca girdap ve spin örnek arabellek ve merdiven aşağı.</li>
	<li>3 µL örnek arabellek 96 iyi plaka (ihtiyacı en az 53 µL/ekran teyp) her şey için ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri çift sayıda çalıştırın; Tek sayıda örnekleri, örnek arabelleği 4 µL boş bir kuyuya ekleyin.</li>
	<li>Merdivenin 1 µL bir merdiven için de ekleyin.</li>
	<li>Harita ekleyin 1 µL havuza alınan PCR ürününün belirlenen için de.</li>
	<li>Kapak plakasını folyo mühür ile</li>
	<li>Girdap gerecin vortexer ve adaptör 2.000 devir / dakikada 1 dakika kullanarak plaka.</li>
	<li>Örnek varsa tüp alt aşağı spin kabarcıklar konum aşağı tekrar çevir.</li>
	<li>Yazılımını başlatın.</li>
	<li>Ekran teyp ve yükleniyor İpuçları araç yükleyin.</li>
	<li>96-şey adaptörle parçası analyzer içine örnekleri yükleyin.</li>
	<li>Koşuya denetleyicisi yazılımıyla ayarlayın.</li>
	<li>Hatta numaralı kuyu seçtiğinizden emin olun.</li>
	<li>Örnek kimliklerini yazın.</li>
	<li>Kontrol edin tüm kuyu ekran teyp gri renkle vurgulanır.</li>
	<li>Pipet ipuçları analyzer tanır emin olun.</li>
	<li>Başlat'ı seçin ve (ad, örnek numaraları ve Tarih çalışma) sonuçları kaydetmek için bir dosya adı belirtin.</li>
	<li>Daha fazla bilgi için üreticinin yönerge bakın.</li>
	<li>Çalışma tamamlandıktan sonra ipucu, ekran teyp ve tüpleri atmak.</li>
	<li>16S tepe nM (315-450 bp V4 için arasında) verileri analiz. Bu zirve seçilen astar bağlı olarak değişir.</li>
</ol>5. Kütüphane hesaplama, Havuzu, temizlik ve QC
<ol><li>Amplicon boyutu ve Derişim tüm örneklerinin belirledikten sonra havuz son istenen hacim ve nM havuza alınan kitaplığı için elde etmek için kitaplıklarına (bkz. örnek hesaplama).</li>
	<li>Temizlik ve silis-zar bazlı bir saflaştırma kullanarak havuza alınan kitaplığı kit PCR ürünlerinin, üretici göre konsantresi ( Tablo malzemelerigörmek) iletişim kuralı.<ol>
<li>DNA 50 µL son hacmi ile elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizlenmiş Kütüphane konsantrasyonu hemen bir yer için bir çift telli DNA yüksek hassasiyet kit kullanarak üreticinin protokole göre ölçmek.<ol>
<li>Havuza alınmış ve temizlenmiş Kütüphane 2 µL 198 µL seyreltme arabellek artı boya (1: 100 seyreltme) ile sulandırmak.</li>
		<li>Fluorometrik aygıttan ölçülen değeri kaydedin ve seyreltme faktörü göre dönüştürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Havuza alınan kitaplığının (ng/µL) okuma konsantrasyon kullanarak, Kütüphane Derişim nm hesaplayın. 1 µL su katılmamış Kütüphane OD260/280 microvolume Spektrofotometre üzerinde ölçmek için kullanın. Not: Yeterli saflık kütüphanesinin 1.8-2.0 değeri gösterir.</li>
	<li>Sonraki nesil sıralama için hazır kadar son Kütüphane-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

16S rRNA, hedeflenen yeni nesil sıralama microbiome karakterizasyonu18için yaygın olarak kullanılan, hızlı bir tekniktir. Ancak, toplu iş etkileri, çevresel kirlenme, örnek Çapraz bulaşma, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere birçok faktör, olumsuz deneysel sonuçlar etkiler ve onların yorumu7,19 yıkmak , 20. en iyi sağlam 16S analizleri kolaylaştırmak için microbiome iş akışları birleştirmek gerekir iyi deneysel tasarım, uygun kontrollerin kullanımı, iş akışı adımlarını kayma ayrılığı ve en iyi yöntemler uygulanması. Burada açıklanan protokolü her biri bu parametreleri içerir ve yukarıdaki zorlukları ve çeşitli örnekleri için 16S iş akışı uygulamak için önemli deneysel araçları sunar.
İyi deneysel tasarım 16S microbiome analizleri için önemlidir. Bu uygun toplama ve depolama örneklerinin yanı sıra 16S faiz bölge için uygun astar yelpazesi içerir. Örneğin, iyi yenidoğan gut microbiome21gelişiminde önemli bir rol oynar Bifidobacterium, amplifikasyon olduğundan V4 bölge (515F/806R) insan sütü için seçilir. Diğer astar kümelerini (örneğin, 27F/338R, 515F/926R) mikrobiyal diğer topluluklar çalışmalar için daha uygun olabilir. Önemli bir Not Bu tavlama sıcaklığı hedeflenen 16S için PCR ve beklenen amplicon boyutuna göre astar seçimi değişebilir.
İletişim kuralı değiştirilebilir başka yerlerde iş akışı dahil QC adımların sonuçlarını temel alır. Ya hiç veya çok az DNA hedeflenen 16S PCR güçlendirme adım takip algılandığında sorun giderme için birkaç seçenek vardır. 1) örnek bir PCR inhibitörü kaldırma adım koymak mümkün olabilir. Bir tek adım kit kullanarak aşağıdaki PCR inhibitörü kaldırma gerçekleştirilen her üreticinin Protokolü amplifikasyon zaman, 2 yaklaşık yüzde kırkı başarılı) daha çıkarılan DNA için hedeflenen 16S eklenebilir PCR, ya da 3) yeni ve potansiyel olarak daha büyük bir aliquot süt varsa işlenebilir. Kütüphanede silis-zar bazlı arıtma takip beklenen boyutu aralık dışında PCR ürünleri hakkında bir endişe ise, bir jel arıtma adım eklenebilir. Son olarak, QC adımları aşağıda ayrıntılı olarak anlatılan kirlenme kanıtı olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Önemli kirlilik tespit edilirse, o zaman nerede kontaminasyon tanıttı bağlı olarak, her iki PCR tekrar edilebilir veya gerekirse, örnek yeniden ayıklanan olabilir. Neyse ki, iyi laboratuar uygulamaları ile nadir olaylar bunlar. Son olarak, bu iletişim kuralını uyarılar düşük biyokütle örnekleri ve özellikle insan sütü amplifikasyon içinde vurgulamak için bulunmakta iken, protokol kolayca oral, Anal, vajinal ve cilt temizleme bezi veya sünger gibi dışkı amplifikasyon için değiştirilebilir. Diğer örnek türleri seçilir, dikkate hangi ayıklama kitleri belirli örnek türü için en uygun olan verilir.
Toplu iş etkileri kitleri, reaktifler veya sıralama ishal nedeniyle değişkenlik microbiome çalışmalarda önemli kaynaklarıdır. DNA ekstraksiyon kitleri, diğer reaktifler, birlikte çok20,22,23,24ile önemli ölçüde değişebilir bakteriyel DNA'ın düşük seviyelerde sahip. Kitleri, reaktifler, tek bir sürü kullanarak büyük bir proje için kiti kirlenme en aza indirmek için tasarlanmış kitleri seçerek analiz7basitleştirmek. Konular ve denetimleri örnekleri yan yana işlenir. En iyisi tüm örnekleri için tek bir çalışma, her ikisi de konu ve kontrol, çalışan tek bir sıralama içine dahil edilebilir. Eğer çok sayıda örnekleri toplu olarak işlenmek üzere, temsilcisi konular ve denetimleri örnekleri her toplu iş iş işlemde dahil ve birlikte işlenebilir. Toplu iş işleme kirlenme (Yani, insan sütü) düşük-biyokütle örneklerin en aza indirmek için yüksek biyokütle (Yani, dışkı) olan örnekleri tarafından organize etmek önemlidir. Bu gibi durumlarda, düşük biyokütle örnek türleri ilk ve o zaman yüksek biyokütle örnekleri aynı çalışma için işlem.
Düşük biyokütle örnekleri benzersiz sorunlar için microbiome çalışmaları, çevre, reaktifler, aletleri kirlenme olarak teşkil ve araştırmacı otantik topluluk üyeleri düşük bereket7 ' mevcut birbirinden ayırt etmek zor yapabilirsiniz , 25 , 26 ve bu da yapay olarak örnek deneysel işlem19ile tanıtılmaktadır. Burada açıklanan iş akışı önemli deneysel negatif denetimleri hem örnek hazırlama adım (salt arabellek lizis denetimi), hem de PCR adım (PCR su kontrolü) içermektedir (bkz: şekil 4). Bu denetimler kirlenme kaynakları tanımlamak ve tezgah veya silico27,28,29,30etkili düzeltici önlemler kolaylaştırmak yardımcı olur. Negatif denetimleri dikkatle değerlendirilir ve çalışma sonuçları7ile bildirdi.
Kirlenme en aza indirmek için temiz pre-PCR güçlendirme alanı ve sonrası amplifikasyon alanı deneysel etkinliklerine kayma ayrım önemlidir. En iyi şekilde, temiz oda için PCR ana mix hazırlık ve Master bir örnek hazırlama/ek alan mix ve bir ayrı ölü hava kutusu veya adanmış sarf malzemeleri konut bir biyolojik güvenlik kabini dahil olabilir ve küçük donanımları gerekli için hem bir alana sahip Ana karışım hazırlama. Temiz oda tasarım yüksek verimlilik partikül hava (HEPA) filtreleme olumlu hava akımı sistemiyle içermektedir. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı kontrollü, düşük-mikrobiyal çevre bakımı için önemlidir ve saç, laboratuvar mont, eldiven, içerir ve ayakkabı kapsar. İdeal olarak kitleri/reaktifler ve örnekleri ayrı özel buzdolabı/dondurucu içinde depolanır. PCR Kur aynı zamanda belirlenen iş istasyonlarında temiz oda içinde yürütülen; örnekleri otomatik pipetting platformu üzerinde yüklenen kadar açık ayrılması ayıklanan DNA astar stokları ve reaktifler korunur. PCR kurulum tamamlandıktan sonra plaka sonrası amplifikasyon alanına transfer ve termal cycler yüklendi.
Sonrası güçlendirme alanlarına temiz alanlarda çalışma etkinliğini akışını kısıtlamak önemlidir; reaktifler, aletleri veya sonrası amplifikasyon bölgelerden gelen malzemeleri temiz alanına retrograd bir harekettir yok. Herhangi bir sonrası amplifikasyon alanları girdiğiniz personel girişinden (kadar ertesi gün) 24 saat temiz alan çubuklu. Yukarıdaki iş akışı ek konuları protokolleri temizlik temiz ve sonrası amplifikasyon alanlarda çalışma yüzeyleri ve enstrümantasyon nükleik asit kirlenme en aza indirmek için uygulanması gerekir. Eğer mümkün olmayan fiziksel engeller veya ayrı Odalar, tüm çabaları kadar ayrı alanlarda yukarıya belgili tanımlık iş ayarlamak için alınması gerekir.
Kontaminasyon ek olarak, microbiome çalışmalar duyarlılık, değişkenlik ve tekrarlanabilirlik31tarafından zorlanmaktadır. Bu iletişim kuralı adreslerini elde edilir, tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleşmeyle tarafından bu sorunları ve güçlendirilmiş her toplu örnekleri (bkz. şekil 4b) ile birlikte sıralı. Bu denetim oluşturulan deneysel sonuçların tekrarlanabilirlik değerlendirir sürekli bir iç başvuru sağlar ve ortaya çıkan sorunları gidermek için kullanılabilir. Örneğin, kalite ayıklanan sahte DNA'ın etkili örnek lizis ve DNA ekstraksiyon, hangi genomik DNA denetimlerin özledim için bir ölçü sağlayabilir. PCR amplicons sahte örnek için kalite kontrolünü de PCR verimliliği ve özgüllük belirtebilirsiniz. Ayrıca, sahte birden çok bakteri türleri oluşur çünkü takson sahte örnek için sıralama sonuçlarında gösterimi tarafından işlenen toplu örnekleri için göreli duyarlılık varılabilir. İdeal bir sahte topluluk anahtar bakteriyel türler analiz ediliyor kompartımanda algılama yeteneğini değerlendirir ve bu nedenle sahte topluluk bileşimi tarafından çalışma değişir gerekebilir. Şekil 4agörüldüğü gibi örnek sıralama sonuçları arasında önemli ölçüde değişkenlik, ama sıra sonuçları bakteriyel sahte toplum için son derece tekrarlanabilir (bakınız şekil 4b).
Şekil 4 sahte toplumda 33 suşların klinik yalıtır ticari olarak kullanılabilir ve yerel bir arada eşsiz bir karışımı olmakla birlikte, piyasada bulunan bir sahte topluluk son zamanlarda gelişmiş32oldu.
Burada açıklanan iş akışı farklı microbiome çalışmalar arasında genel olarak adres tekrarlanabilirlik için onun yetenek sınırlı olmasına rağmen araştırmacılar dahil etmek uygun deneysel sağlayan önemli bir deneysel yaklaşım sağlayın denetimleri ve monitör tekrarlanabilirlik kendi sonuçları içinde.

İnsanlar kolonize mikrobiyal toplulukların insan sağlığı ve hastalığı etkileyen metabolizma, bağışıklık geliştirme, duyarlılık hastalık ve aşı ve ilaç tedavisi1, yanıt için önemli olduğuna inanılan 2. microbiota insan sağlığı üzerindeki etkisi şu anda anlamak için çaba vurgulamak ile tanımlanmış anatomik bölmeleri (Yani, deri, bağırsak, oral, vb), yanı sıra yerelleştirilmiş sitelerle ilişkili mikroplar tanımlaması Bu bölmeler3,4. Araştırmacı bu çabalarına destek hızlı ortaya çıkması ve mikrobiyal genetik içeriği (microbiome) analiz için bir örnek kitlesel paralel bir platform sağlayan yeni nesil sıralama (NGS) teknolojilerin artan erişilebilirlik olduğunu. Pek çok fizyolojik örnekleri için karmaşık ve bol ilişkili microbiome (Yani, dışkı), ancak, bazı örnekler için microbiome tarafından düşük mikrobiyal biyokütle (Yani, insan sütü, alt solunum yolu) nerede temsil edilir duyarlılık, deneysel eserlerin ve olası bulaşma önemli konular haline. Microbiome çalışmaları ve uygun deneysel tasarım ortak sorunları birden çok gözden makaleler5,6,7,8konu oldu.
Burada sunulan sağlam bir NGS deneysel boru hattı insan sütü microbiome karakterize rRNA 16S V4 bölge9 hedeflenen sıralama üzerinde temel alır. İnsan sütü Microbiome analizi değil karmaşık sadece bir doğal olarak düşük mikrobiyal biyokütle10, ama Ayrıca tarafından yüksek düzeyde insan DNA'sı11,12,13,14 arka plan ve potansiyel ertelenmiş ayıklanan nükleik asit PCR inhibitörleri15,16 . Piyasada bulunan ayıklama kitleri ve örnek hazırlama toplu işlemleri arasında değişkenlik en aza indirmeye yardımcı yarı otomatik platformlar bu protokolü kullanır. O örnekleri protokol her adımda doğrulamak ve boru hattı sağlamlık'bağımsız bir ölçü sağlamak için kalite kontrol işlenir iyi tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleştirmek. İletişim kuralı olarak açıklanan insan sütü örnekleri özgü olsa da, bu tabure, rektal, vajinal, Cilt, areolar ve sözlü temizleme bezi10,17de dahil olmak üzere diğer örnek türleri kolayca uyarlanabilir ve için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir microbiome analizleri gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">80204</td>
			<td style="width:395px;">DNA/RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eliminase</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">435532</td>
			<td>RNase, DNase, DNA decontaminant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Thermo Mixer</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>temperature-controlled vortexer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Buffer RLT plus</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>1053393</td>
			<td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#223;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td>&#223;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LME Beads</td>
			<td style="width:115px;">MP Biomedicals</td>
			<td>116914050</td>
			<td>bead tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen TissueLyzer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>automated sample disruptor adapter set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAshredder column</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>&#160;79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen RB tube</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
			<td>manufacturer&#39;s microcentrifuge tube in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAcube and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001292</td>
			<td>automated DNA/RNA purification instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA exitus plus</td>
			<td style="width:115px;">Applichem</td>
			<td>A7089</td>
			<td>non-enzymatic decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">EB Buffer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">19086</td>
			<td>elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAgility and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001532</td>
			<td>robotic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR water</td>
			<td style="width:115px;">MO BIO</td>
			<td>17000-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5PRIME HotMasterMix</td>
			<td style="width:115px;">Quantabio</td>
			<td>2200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Barcoded reverse primers</td>
			<td style="width:115px;">Eurofin</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>designed and ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">&#160;96 well PCR plate</td>
			<td style="width:115px;">USA scientific</td>
			<td style="width:153px;">1402-9708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tapestation 2200 and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D1000 reagents for Tapestation&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneStep PCR Inhibitor Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:153px;">50444470</td>
			<td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">28104</td>
			<td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;">Q32854</td>
			<td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq 300 V2 kit</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td>15033624/15033626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>next generation sequencer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Çalışmalar mikrobiyal toplulukların nispeten ucuz, hızlı ve yüksek işlem hacmi sıralama gelişimi ile yaygın hale gelmiştir. Ancak, tüm bu teknolojileri ile gibi tekrarlanabilir sonuçlar birleştirmek uygun önlemler ve denetimleri bir laboratuvar iş akışı üzerinde bağlıdır. Bu özellikle düşük-biyokütle örnekleri ile nerede bakteriyel DNA kirletici yanıltıcı sonuçlar üretebilir önemlidir. Bu makalede mikroplar insan meme süt örneklerinden bir düşük - için orta - throughput ölçekte 16S ribozomal RNA (rRNA) V4 bölgesinin hedeflenen sıralama kullanarak tanımlamak için yarı otomatik bir iş akışı ayrıntıları. Tam yağlı süt de dahil olmak üzere gelen numune hazırlama protokolünü açıklar: örnek lizis, nükleik asit ayıklama, amplifikasyon 16S rRNA gen ve Kütüphane hazırlık kalite kontrol önlemleri ile V4 bölgesinin. Önemlisi, protokol ve tartışma belirgin hazırlama ve analiz düşük-biyokütle örnekleri de dahil olmak üzere çevre, reaktif tarafından uygun pozitif ve negatif kontrol eder, PCR inhibitörü kaldırma, örnek kirlenme konuları göz önünde bulundurun veya deneysel kaynakları ve tekrarlanabilirlik sağlamak amacıyla tasarlanan deneysel en iyi yöntemler. Açıklandığı gibi protokol insan sütü örnekleri için belirli ise, harika veya koruma arabellekte stabilize donmuş temizleme bezi, toplanan örnekleri de dahil olmak üzere çok sayıda düşük ve yüksek biyokütle örnek türleri için uyarlanabilir.

Burada sunulan Protokolü oluşturulan veri buluşma Protokolü duyarlılık, özgüllük ve kirlenme kontrolü için kriterler emin olmak için önemli kalite kontrol (QC) adımları içerir. Protokolün ilk QC adım PCR güçlendirme 16S V4 bölgesinin (Şekil 2) izler. Bir µL PCR ürününün her örnekten 315-450 bp (Şekil 2, kırmızı ok) beklenen boyut aralığı içinde olduğunu onaylamak için Elektroforez tarafından analiz edildi. Bazı insan sütü örnekleri belirli ürün daha düşük miktarda üretilen (şekil 2A, Karşılaştır yolları 3 ve 9-11 şerit ile 4-8), ya düşük seviyelerde öne çıkarma sırasında bu örnekleri veya PCR inhibitörleri etkilenmişimdir mikrobiyal DNA çıkarılan. Daha az 2.0 üretmek örnekleri için nM aralığında 315-450 bp (şekil 2A, lane 7), PCR inhibitörü Temizleme ürün taşınan-dışarı bir tek adım kit kullanarak ve yeniden güçlendirilmiş örneğidir. Başarı oranı yaklaşık % 40 temizlenmesidir sonra örnek amplifikasyon kurtarılması için. Nefelometri için her örnek (şekil 2B) belirli ürün örnekleri sıralama için eşit molar havuzu için gerekli hacmi belirlemek için önemlidir. Havuza alınan bir kütüphane hedeflenen sıralama için genellikle belirli bir PCR ürünü (şekil 3) tarafından hakimdir. Non-spesifik ürün kütüphanede önemli miktarda ise, bir jel-arıtma adım akışına eklenmelidir.
Şekil 2Asunulan örnekte belli belirsiz bantları arabellek denetimlerinde gözlenir (BC; yolları 2 ve 12) ve negatif kontrol (PC; lane 1), su PCR olası çevresel veya reaktif kirlenme gösteren. Böyle grup nadir değildir ve genellikle düşük miktarda PCR ürünü temsil (örneğin, < 1 nM) ve sıralama sırasında kaç okuma sayar üretin (< 1000). Bu örnekler gerçekten çok düşük sıralama sayıları (4A rakam, şerit 1 ve 11; okumak var mı temsilcisi sıralama sonuçları (şekil 4) onaylamak Şekil 4B, tampon ve PCR su yolları) ve önemlisi, kontrol örnekleri için takson kompozisyon insan sütü örneklerinden farklıdır (şekil 4A; yolları ile karşılaştır şerit 1 ve 11 2-10). Negatif denetimler, denetimleri ve örnekleri, arasındaki takson bileşiminde önemli örtüşme ile birlikte yüksek okuma sayıları Çapraz bulaşma ve geliştirilmiş kontaminasyon kontrolü için ihtiyaç göstermektedir.
Sıralama sonuçlar (şekil 4) insan sütü microbiome ile ilişkili özellikleri yüksek çeşitlilik göstermek ve her örnek (şekil 4A, yolları 2-10) için sayıları sıralama sayısı değişkenlik okuyun. Buna ek olarak, insan sütü örnekleri ile birlikte işlendiği sıralama sonuçları için sahte bakteriyel takson kompozisyon gösterdi ve sahte önceki iş akışı ishal ( şekil 4A karşılaştırmak için elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir sayar okuyun , lane 12 rakam 4B, sahte şerit ile). Sahte şerit için tutarlı sonuçlar insan sütü örnekleri için gözlenen değişkenliğin otantik bir deneysel sonuç ve içsel iş akışının değişkenliği olmayan bir işlev olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig1.jpg"> Şekil 1: akış şeması hedefli 16S ardışık sıralama düzeninin. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56974/56974fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig2.jpg"> Şekil 2: kalite kontrol analizi 16S V4 amplicons. (A)16S V4 amplicons görüntüsünü Jel Elektroforez tarafından bir otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisi'ni kullanarak çözüldü. 16s V4 amplicons Caporaso vd göre oluşturulan 9ve bir µL PCR ürünleri analiz üreticinin esaslarına göre yüksek hassasiyet DNA reaktifler kullanarak. En insani süt örnekleri (şerit 3-6 ve 8-11) ve bakteriyel sahte (lane 13) üretilen bir birincil PCR ürünü beklenen boyutu yaklaşık 400 bp (kırmızı ok). Şeritte 7 insan sütü örnek belirli ürün önemli miktarda üretmek için başarısız ve temizleme ve yeniden güçlendirme tabidir. Minimum ürün PCR negatif kontrol (PC, lane 1) için algılandı ve lizis arabellek negatif denetimleri (M.Ö., yolları 2 ve 12) en az kirlenme analiz örnekleri mevcut belirtti. MW, molekül ağırlığı işaretleri: üst alt ve kırmızı yeşil çubuklar tanımlamak 1.500 bp ve 25 bp boyutu işaretleri, sırasıyla, içinde her lane. Lane 3 jel üzerinden (a) (B) üst Electropherogram. Birincil PCR ürünü kırmızı dikey çubuklar tarafından tanımlanan en yüksek bölgesi içinde düşer ve bir ortalama PCR ürün boyutunu 396 sonuçlanan 299-497 bp büyüklükleri arasında değişen parçaları oluşur bp. Gating beklenen amplicon boyutundan (i biraz daha geniş bir tarih yapılır n bu durumda 315-450 bp) tüm örnek tepe eklediğinizden emin olmak. Alt ve üst tepeleri 25 parça boyutlarıyla ilişkilendirmek bp ve 1.500 bp, anılan sıraya göre. Alt: tepe bölgesi, konsantrasyon ng/µL PCR ürününün tepe bölgesi içinde ve Derişim nm belirli PCR ürününün boyutu parametreleri özetleme grafik. Bu bilgiler ne kadar hesaplamak için kullanılır her örneği sıralama için eşit bir molar kütüphanede havuza alınmış (bkz. örnek hesaplama). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56974/56974fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig3.jpg"> Resim 3: bir havuza alınmış ve konsantre sıralama kitaplığı Electropherogram. Sıralı için bireysel örnekleri eşit molar miktarda havuza alınan bir kitaplığa kombine edilmiştir. Kütüphane yapıldı sonra temizlenmiş ve toplam hacmiyle 50 µL silis-zar bazlı bir PCR kiti kadar temiz kullanarak yoğunlaşmıştır. Son hazırlık ve sunuş Kütüphane sonraki nesil Sekanslama üzerinde sıralama için üreticinin protokole göre yapılmıştır. Bu kitaplığı başarıyla ek bantları varlığı rağmen sıralı. Beklenen boyutu aralık dışında PCR ürünleri hakkında bir endişe ise üreticinin iletişim kuralı bir jel boyutu seçimi adım eklenmesi önerir. Genellikle bu QC adım gerçekleştirilir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56974/56974fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig4.jpg"> Şekil 4: negatif ve pozitif denetimleri değerlendirilmesi. (A)göreli zenginliği ile hakim olmak ve insan sütü örnekleri bir ayıklama toplu bakteriyel özellikleri. Bir QC tedbir olarak, hemen ardından bir sıralama çalışma besteleri otomatik DNA/RNA arıtma araç üzerinde yüklü olarak her ayıklama toplu oluşturulur. Sayılar her örnek çubuğunun altındaki ilgili örnek için filtre uygulanmış okuma sayısı gösterir. Arabellek denetimleri besteleri insan sütü örnekleri farklı vardır. (B) göreli zenginliği arabellek, sahte ve PCR denetimleri bakteriyel özellikleri. Okuma ve kompozisyon tüm olumsuz (arabellek ve PCR su) ve pozitif (bakteriyel sahte) denetimleri için değerlendirilir. Arabellek ve su değişir, ancak sahte topluluk oldukça kararlı kalır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56974/56974fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Görüntüleme.  University of California at Los Angeles. Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Video: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most biological materials do not contain dense elements capable of scattering electrons to create an image; therefore, a negative stain, which places dense heavy metal salts around the sample, is required. In order to visualize viruses in suspension under the TEM they must be applied to small grids coated with a transparent surface only nanometers thick. Due to their small size and fragility, these grids are difficult to handle and easily moved by air currents. The thin surface is easily damaged, leaving the sample difficult or impossible to image. Infectious viruses must be handled in a biosafety cabinet (BSC) and some require a biocontainment laboratory environment. Staining viruses in biosafety levels (BSL)-3 and -4 is especially challenging because these environments are more turbulent and technicians are required to wear personal protective equipment (PPE), which decreases dexterity. 
In this study, we evaluated a new device to assist in negative staining viruses in biocontainment. The device is a capsule that works as a specialized pipette tip. Once grids are loaded into the capsule, the user simply aspirates reagents into the capsule to deliver the virus and stains to the encapsulated grid, thus eliminating user handling of grids. Although this technique was designed specifically for use in BSL-3 or -4 biocontainment, it can ease sample preparation in any lab environment by enabling easy negative staining of virus. This same method can also be applied to prepare negative stained TEM specimens of nanoparticles, macromolecules and similar specimens.

This protocol provides instruction for negative staining virus samples which can easily be used in BSL-2, -3, or -4 laboratories. It includes the use of an innovative processing capsule, which protects the transmission electron microscopy grid and provides the user easier handling in the more turbulent environments within biocontainment.

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...