Vorremmo ringraziare Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, dottorato di ricerca per lo sviluppo del protocollo. Supporto globale per l'International materno pediatrica adolescenziale AIDS clinico prove gruppo (IMPAACT) è stato fornito dal National Institute of Allergy e Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) sotto numeri del premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), con il co-finanziamento il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) e l'Istituto nazionale di salute mentale (NIMH). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Per tutti i passaggi di protocollo, dispositivi di protezione personale (PPE) devono essere indossati e approcci di prevenzione contaminazione rigorosi devono essere prese. Osservare il flusso di lavoro da pre-amplificazione aree di aree di lavoro di post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dei campioni di lavoro. Tutte le forniture utilizzate sono sterili, libero della RNasi, DNasi, DNA e pirogeni. Tutti i puntali vengono filtrati. Un diagramma di flusso dei passaggi del protocollo è fornito (Figura 1).
1. lisi del campione
Nota: Lisi del campione ed estrazione di acidi nucleici vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione di DNA/RNA in un ambiente pulito dove sia procedurali che ingegneria dei controlli sono in atto per ridurre al minimo l'introduzione di batteri ambientali ai campioni.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire l'armadio di sicurezza biologica (BSC) lavora zona con detergente appropriato superficie per eliminare eventuali contaminazioni di acido nucleico.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostarlo a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il tampone di lisi tiocianato di guanidinium (Vedi tabella materiali)
	<ol>
<li>Controllare il buffer di lisi per precipitati. Ri-sciogliere precipitati dal riscaldamento a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare 600 µ l di tampone di lisi con 6 µ l β-mercaptoetanolo (β-ME) per ogni campione. Si consideri un volume di 20% supplementare per campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Se il latte intero è congelato, scongelare su ghiaccio. Aliquotare 5ml di intero latte in un 15 mL o in una provetta sterile 5 mL in BSC e tenerlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Girare il latte 5 mL aliquota per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
		<li>Rimuovere lo strato di grasso, ora lo strato superiore del tubo, con una spatola di plastica o grande foro punta della pipetta.</li>
		<li>Senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il supernatante ad eccezione di 100 µ l.</li>
		<li>Lavare la pallina di risospensione in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
		<li>Preparare 1 controllo negativo aggiungendo 1 mL di PBS sterile in una provetta 5 mL.</li>
		<li>Trasferire la sospensione in una provetta pulita 1,5 mL centrifuga e spin in una microcentrifuga per 1 min (a temperatura ambiente (TA) fino a 5.000 x g).</li>
		<li>Per scartare l'intero livello di surnatante/grassi, usare una punta di pipetta sterile filtrata 1.000 µ l.</li>
		<li>Se non estraendo lo stesso giorno, snap congela la cella a pellet inserendolo in un etanolo/a secco ghiaccio semiliquido e trasferire immediatamente al congelatore-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rottura del campione e l'omogeneizzazione (tallone-battente)
	<ol>
<li>Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi contenente β-ME al pellet e trasferire la sospensione in una provetta di tallone.</li>
		<li>Ogni lotto di estrazione di 12 contiene 10 campioni, 1 controllo negativo (preparata al punto 3.7 sopra) e 1 controllo positivo (preparato nel passaggio successivo).<ol>
<li>Preparare 1 controllo positivo con buffer di lisi e 20 µ l del campione finto batterico (la comunità finta utilizzata ha una concentrazione, una volta estratta, di circa 0,2 ng / µ l di DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortice tutti perlina tubi energicamente per 15 s.</li>
		<li>Riscaldare i campioni sul Vortex termostatato a 37 ° C per 10 min, con agitazione a 700-800 giri/min.</li>
		<li>Caricare il set di adattatori di apparecchiature automatiche disruptor tubi.</li>
		<li>Tallone battere per 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Smontare il set di adattatori e passare manualmente la scheda impostata con le piastre di campione dal braccio robotico di sinistra del braccio robotico destra dello strumento.</li>
		<li>Tallone battere per un altro 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Provette per centrifuga a 17.200 x g, per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Rimuovere tutti il surnatante con una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a non ottenere qualsiasi dello strato di grasso nella parte superiore del campione o il tallone residua nella parte inferiore del campione e si applicano a una colonna di omogeneizzatore.</li>
		<li>Colonne di omogeneizzatore centrifuga alla massima velocità, 17.200 x g per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Trasferire 350 µ l di eluato microcentrifuga di un produttore di 2 mL per uso con lo strumento automatizzato per la purificazione di DNA e RNA (non usare qualsiasi altro tubo). Fare attenzione a non trasferire qualsiasi strato residuo di grasso.</li>
		<li>Se il volume di flusso continuo è a meno di 350 µ l, aggiungere tampone di lisi con β-ME ad un volume finale di 350 µ l.</li>
		<li>I campioni di lasciare RT per fino a 2 h prima di procedere all'isolamento dell'acido nucleico utilizzando lo strumento di purificazione automatizzato del DNA, o congelare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Area di lavoro di pulizia
	<ol>
<li>Pulire tutte le superfici in utilizzano con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min, poi spruzzare con etanolo al 70% e pulire la superficie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolare il DNA/RNA
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Attivare il blocco di calore e regolare la temperatura di 70 ° C.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostare la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Scaldare il buffer di eluizione (EB) contenente 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, in un tubo da 50 mL a 70 ° C.</li>
		<li>Scaldare 350 µ l di campione congelato lisati in provette da 2 mL a 37 ° C fino a quando completamente scongelato senza alcun precipitato (circa 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione del DNA
	<ol>
<li>Vortex e centrifugare le provette 2 mL con campione brevemente (3000 x g per 10 s).</li>
		<li>Inserire 2 mL provette nello shaker seguendo il grafico del carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA, secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Ottenere i rotore adattatori e impostarle sul vassoio in base al numero di campioni.</li>
		<li>Etichettare ogni adattatore rotore basata sull'identificazione del campione (ID).</li>
		<li>Tagliare i coperchi e lisciare i bordi delle colonne singole spin per DNA e RNA.</li>
		<li>Inserire la colonna di spin di DNA senza il tubo di raccolta nell'adattatore del rotore. Gettare la provetta di raccolta.</li>
		<li>Etichetta 1,5 mL provette per la raccolta e inserire gli adattatori del rotore.</li>
		<li>Set adattatori per rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Inserire 1.000 µ l-puntali del produttore con filtro in rack di punta.</li>
		<li>Aggiungere acqua RNAsi-libera al tubo del microcentrifuge del costruttore 2 mL dipenda dal numero di campioni (per istruzioni di macchina specifico protocollo).</li>
		<li>Inserire il tubo nella fessura del tubo "A" di slot di tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Scartare qualsiasi reagente che è rimasto in flaconi di reagente e riempire con un volume minimo di 10 mL.</li>
		<li>Il portabottiglie di reagente (tranne bottiglia EB), inserire i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Aggiungere EB caldo da un tubo da 50 mL per la posizione di bottiglia del Reagente 6.</li>
		<li>Verifica provette da 1,5 mL sono collocate strettamente negli adattatori del rotore.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "estrazione kit" → "Animale, tessuti e cellule" → "del kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" → modificare Volume di eluizione per 100 µ l (impostazione predefinita) o 50 µ l per biomassa basso campioni → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna di spin di DNA dalla posizione del rotore adattatore 3.</li>
		<li>Non gettare gli adattatori del rotore, il RNA è in posizione 2.</li>
		<li>Rimuovere i tubi di raccolta 1,5 mL contenente DNA eluito nella posizione 3 e memorizzare in − 20 ° C.</li>
		<li>Raccogliere campione contenente tubi da shaker e negozio a − 20 ° C, se qualsiasi campione è lasciato sopra, altrimenti scartare.</li>
		<li>Continuare con il protocollo "del kit nome 350 µ l parte B RNA" per ulteriore purificazione del RNA.</li>
		<li>Purificazione RNA sarà fatto dai circa 350 µ l flusso continuo che è in posizione centrale di adattatori del rotore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione di RNA
	<ol>
<li>Inserire la colonna di spin di RNA privo di coperchio e tubo di raccolta nell'adattatore del rotore.</li>
		<li>Etichetta del nuovo 1,5 mL provette per la raccolta e inserirli nell'adattatore del rotore, come indicato nel manuale.</li>
		<li>Impostare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "Kit del produttore" → "Animale, tessuti e cellule" → "Standard parte B RNA" → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna spin RNA dalla posizione 3.</li>
		<li>Provette da 1,5 mL contenente 30 µ l eluiti RNA alla posizione 3 di rimuovere e conservare a − 80 ° C.</li>
		<li>Rimuovere i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Smaltire i contenuti di adattatore di rotore attraverso i canali appropriati rifiuti pericolosi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Postazione di lavoro pulita
	<ol>
<li>Spray accessori tutti automatizzato del DNA/RNA purificazione dello strumento, quali cremagliere del reagente, vassoio e qualsiasi altra superficie in uso con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min e risciacquare con acqua deionizzata (DI), poi lasciarli asciugare.</li>
		<li>Spruzzo strumento automatizzato con solo produttore approvato soluzione di decontaminazione non enzimatici, pulire l'interno della centrifuga insieme a tutte le superfici in uso, lasciare per 10 min e poi pulire con etanolo al 70%. Non utilizzare altri tipi di soluzioni di decontaminazione, poichè possono danneggiare lo strumento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mirati 16S PCR set-up
Nota: Il set-up per la PCR 16S avviene in un'area di lavoro pre-amplificazione designato che si trova all'interno della camera bianca. I reagenti ed i campioni sono preparati e quindi caricati su un gestore liquido per eseguire la PCR per ciascun campione in triplice copia (30 campioni, sono veri campioni e controlli positivi e negativi di estrazione, più 2 PCR acqua controlli in triplice copia, per un totale di 96 combinato di campioni e controlli). Una volta che le reazioni di PCR sono assemblate e sigillate, piatto del campione viene trasferito un termociclatore situato in una zona di post-amplificazione per il ciclismo.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation PCR. Spruzzo che tutte le superfici in uso con un DNA di RNasi, DNasi, decontaminante, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Preparare il foglio di lavoro di PCR 16S (vedere il foglio di lavoro di Targeted 16S PCR) con un elenco di esempi precisi e primer con codici a barre diversi assegna a ciascun campione9. Stampare il foglio di lavoro e le mappe di piastra (Vedi Tavola 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della master mix PCR Nota: selezione dell'iniettore 16S si basa sulla regione di interesse per lo studio particolare e può cambiare dal tipo studio o campione. Pertanto, prima di ordinare il primer, è importante confermare quale area del rRNA 16S migliori amplifica i microbi di interesse per lo studio particolare. Questo protocollo come scritto è per l'amplificazione della regione 16S V4. Se vengono selezionata diversa primer/regione, quindi la temperatura di annealing nel ciclismo termica potrebbe richiedere la modifica.<ol>
<li>Lavorare nella workstation PCR per preparare tutto.</li>
		<li>Prendere 50-100 µ l di campioni di DNA da-20 ° C e tutti i reagenti necessari e li scongelare su ghiaccio. Vortice e brevemente rotazione verso il basso.</li>
		<li>I primers sono pre-diluiti alla concentrazione di lavoro di 5 µM in un volume minimo di 20 µ l.</li>
		<li>Preparare il mix master di PCR nel tubo 5ml specifici con solo il primer in avanti secondo il calcolo del foglio di lavoro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando il manipolatore robotizzato liquido per l'installazione automatica di PCR
	<ol>
<li>Per i campioni, prendere fuori adattatore campione di uno strumento di 32-pozzo e caricare 50-100 µ l di campioni di DNA secondo la mappa di piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Per ogni piatto PCR, impostare 2 controlli negativi inserendo 30 µ l di acqua PCR in una provetta pulita.</li>
			<li>Posto tutti i campioni su adattatore campione dello strumento 32-pozzo con tappi bloccati in posizione aperta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per iniettori d'inversione9<ol>
<li>Rimuovere il tappo di ogni primer reverse con codice a barre specifico # s uno alla volta (cambiare i guanti in mezzo per evitare la contaminazione incrociata).</li>
			<li>Inserire un massimo di 32 primer sull'adattatore Reagente dello strumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendete una piastra PCR a 96 pozzetti ed etichettarlo con Studio nome, numero di campioni, data e le iniziali del tecnico.</li>
		<li>Il gestore di liquido robotico di caricamento<ol>
<li>Posizionare l'adattatore reagente B1. Al fine di evitare un effetto contorno, posizionare un bordo dell'adattatore contro il lato di presa e portare lentamente l'altro bordo. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Inserire l'adattatore di campione in posizione C1. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Vortice il mix master 5 mL, aprire il tappo e inserirlo nella posizione al blocco dello strumento matrice mix e reagente.</li>
			<li>Posizionare la piastra PCR su adattatore 96 pozzetti dello strumento che è destinato a contenere metà costeggiava piastre PCR.</li>
			<li>Avviare l'esecuzione e salvare come nuovo file.</li>
			<li>Seguire le istruzioni e spunta ogni prompt: uno, i consigli sono disponibili, due, scatola degli scarti è disponibile, e tre, iniziare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, verificare che non siano presenti errori controllando la macchina per i messaggi di errore.</li>
		<li>Sigillare la piastra con i 12 o strip 8 tappi, vortice vigorosamente e spin giù per 1 min utilizzando un filatore piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul ghiaccio o in frigorifero.</li>
		<li>Rimuovere le provette contenenti i campioni e iniettori d'inversione.</li>
		<li>Prendere la piastra a 96 pozzetti per la camera di post-amplificazione e caricare la piastra sul termociclatore e ciclo in base alla tabella delle condizioni termiche-ciclismo (Vedi tabella 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. controllo di qualità Post-PCR 16S mirate utilizzando la piattaforma basata su nastro per elettroforesi del Gel
Nota: Post-PCR (controllo qualità) e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una determinata area di post-amplificazione del laboratorio. Il DNA viene analizzato in un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation spruzzando che decontaminante tutte le superfici in uso con RNAsi, DNasi, DNA, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Raccogliere tutte le forniture e le attrezzature necessarie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare i reagenti
	<ol>
<li>Tampone del campione posto e scaletta nel Vortex a temperatura controllata a 25 ° C per un minimo di 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mentre i reagenti si scaldano, preparazione di campioni PCR mettendo in comune i 3 repliche PCR per ogni campione in un singolo tubo</li>
	<li>Caricare i campioni sullo strumento.</li>
	<li>Brevemente vortex e centrifugare tubi con pool prodotto di PCR.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti dello strumento su una cremagliera a RT ed etichettarlo.</li>
	<li>Brevemente vortice e spin giù il buffer del campione e la scaletta.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di tampone di campione in ciascun pozzetto della piastra ben 96 (necessità almeno 53 µ l/schermo nastro).</li>
	<li>Eseguire un numero pari di campioni; Se c'è un numero dispari di campioni, è possibile aggiungere 4 µ l di sample buffer in un pozzetto vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di scaletta per una scaletta ben.</li>
	<li>Seguendo la mappa, aggiungere 1 µ l di prodotto PCR riunita al suo designato bene.</li>
	<li>Piastra di copertura con sigillo</li>
	<li>Vortice la piastra utilizzando lo strumento Vortex e adattatore a 2.000 giri/min per 1 min.</li>
	<li>Girare fino a posizione l'esempio nella parte inferiore del tubo, se ci sono bolle spin giù di nuovo.</li>
	<li>Avviare il software.</li>
	<li>Caricare la schermata di caricamento e nastro suggerimenti nello strumento.</li>
	<li>Caricare i campioni nell'analizzatore frammento con un adattatore di 96 pozzetti.</li>
	<li>Impostare una corsa con il software del controller.</li>
	<li>Assicurarsi di selezionare anche numerati pozzi.</li>
	<li>Scrivere ID campione.</li>
	<li>Verifica che tutti i pozzi del nastro schermo sono evidenziati in grigio.</li>
	<li>Assicurarsi che l'analizzatore riconosce tutte le punte di pipetta.</li>
	<li>Selezionare avvia e specificare un nome file per salvare i risultati (Studio nome, numero del campione e data).</li>
	<li>Riferimento alle istruzioni del produttore per maggiori dettagli.</li>
	<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, scartare punta, nastro schermo e tubi.</li>
	<li>Analizzare i dati per nM picco 16S (tra 315-450 bp per V4). Questo picco variano a seconda i primers selezionati.</li>
</ol>5. Biblioteca calcolo, pool, Clean-up e QC
<ol><li>Dopo aver determinato la dimensione amplicone e molarità di tutti i campioni, le librerie per raggiungere il volume desiderato finale e nM per la libreria di pool della piscina (Vedi esempio di calcolo).</li>
	<li>Clean-up e concentrato la libreria pool utilizzando una purificazione basati su silice-membrana kit per i prodotti PCR, secondo il produttore di protocollo (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Eluire il DNA con un volume finale di 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione della biblioteca pulita immediatamente utilizzando un kit di alta sensibilità DNA incagliato doppio per un fluorimetro, secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Diluire 2 µ l della biblioteca in pool e pulita con 198 µ l di tampone di diluizione plus tintura (diluizione 1: 100).</li>
		<li>Registrare il valore misurato dal dispositivo fluorometrica e convertirlo secondo il fattore di diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando la concentrazione (ng / µ l) di lettura per la libreria di pool, calcolare la molarità di biblioteca in nM. Utilizzare 1 µ l non diluito libreria per misurare la OD260/280 su uno spettrofotometro di microvolume. Nota: Un valore di 1.8-2.0 indica purezza adeguata della biblioteca.</li>
	<li>Archiviare la libreria finale a-20 ° C fino al momento per il sequenziamento di nuova generazione.</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione18. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione7,19 , 20. per meglio facilitare 16S robust...

Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia1, 2. gli sforzi per comprendere l'influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l'identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all'interno questi scomparti3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l'analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli5,6,7,8.
Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione9 per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa10, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori15,16 in estratti dell'acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">80204</td>
			<td style="width:395px;">DNA/RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eliminase</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">435532</td>
			<td>RNase, DNase, DNA decontaminant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Thermo Mixer</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>temperature-controlled vortexer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Buffer RLT plus</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>1053393</td>
			<td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#223;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td>&#223;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LME Beads</td>
			<td style="width:115px;">MP Biomedicals</td>
			<td>116914050</td>
			<td>bead tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen TissueLyzer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>automated sample disruptor adapter set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAshredder column</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>&#160;79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen RB tube</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
			<td>manufacturer&#39;s microcentrifuge tube in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAcube and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001292</td>
			<td>automated DNA/RNA purification instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA exitus plus</td>
			<td style="width:115px;">Applichem</td>
			<td>A7089</td>
			<td>non-enzymatic decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">EB Buffer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">19086</td>
			<td>elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAgility and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001532</td>
			<td>robotic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR water</td>
			<td style="width:115px;">MO BIO</td>
			<td>17000-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5PRIME HotMasterMix</td>
			<td style="width:115px;">Quantabio</td>
			<td>2200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Barcoded reverse primers</td>
			<td style="width:115px;">Eurofin</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>designed and ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">&#160;96 well PCR plate</td>
			<td style="width:115px;">USA scientific</td>
			<td style="width:153px;">1402-9708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tapestation 2200 and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D1000 reagents for Tapestation&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneStep PCR Inhibitor Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:153px;">50444470</td>
			<td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">28104</td>
			<td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;">Q32854</td>
			<td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq 300 V2 kit</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td>15033624/15033626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>next generation sequencer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso - medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D'importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l'analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.

Il protocollo presentato qui include passaggi importante controllo qualità (QC) per assicurarsi che il soddisfare di dati generati i valori di riferimento per il controllo di sensibilità, specificità e contaminazione di protocollo. Primo passo QC del protocollo segue l'amplificazione di PCR della regione 16S V4 (Figura 2). Un µ l del prodotto PCR di ogni campione è stato analizzato tramite l'elettroforesi per confermare che era all'interno della gamma di...

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A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Views.  University of California at Los Angeles. Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Video: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ rilevamento di batteri all&#39;interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Metodo dell&#39;agitatore magnetico per la rilevazione di<em&gt; Trichinella</em&gt; Le larve in campioni di muscolo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most biological materials do not contain dense elements capable of scattering electrons to create an image; therefore, a negative stain, which places dense heavy metal salts around the sample, is required. In order to visualize viruses in suspension under the TEM they must be applied to small grids coated with a transparent surface only nanometers thick. Due to their small size and fragility, these grids are difficult to handle and easily moved by air currents. The thin surface is easily damaged, leaving the sample difficult or impossible to image. Infectious viruses must be handled in a biosafety cabinet (BSC) and some require a biocontainment laboratory environment. Staining viruses in biosafety levels (BSL)-3 and -4 is especially challenging because these environments are more turbulent and technicians are required to wear personal protective equipment (PPE), which decreases dexterity. 
In this study, we evaluated a new device to assist in negative staining viruses in biocontainment. The device is a capsule that works as a specialized pipette tip. Once grids are loaded into the capsule, the user simply aspirates reagents into the capsule to deliver the virus and stains to the encapsulated grid, thus eliminating user handling of grids. Although this technique was designed specifically for use in BSL-3 or -4 biocontainment, it can ease sample preparation in any lab environment by enabling easy negative staining of virus. This same method can also be applied to prepare negative stained TEM specimens of nanoparticles, macromolecules and similar specimens.

This protocol provides instruction for negative staining virus samples which can easily be used in BSL-2, -3, or -4 laboratories. It includes the use of an innovative processing capsule, which protects the transmission electron microscopy grid and provides the user easier handling in the more turbulent environments within biocontainment.

Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all&#39;interno del Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...