Bu eser NIH Grant Sharon E. Bickel için ödül GM59354 tarafından desteklenmiştir. Huy s. Nguyen floresan kol probları, Ann Lavanway confocal mikroskobu ile ilgili yardım ve J. Emiliano Reed teknik yardım için oluşturmak için protokol gelişmekte olan yardım için teşekkür. Ayrıca çok sayıda meslektaşları için yararlı tartışmalar ve tavsiye Drosophila toplumda teşekkür ediyoruz.

<ol>
	<li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sister+chromatid+cohesion.">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin.">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li><li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes.">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li><li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction.">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li><li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Down+Syndrome+Project:+design+and+implementation.">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes.">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li><li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes.">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).</li><li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes.">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced.">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes.">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li><li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2.">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age.">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li><li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes.">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-mediated+association+of+achiasmate+homologues+declines+with+age+when+cohesion+is+compromised.">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li><li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes.">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li><li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation.">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).</li><li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors.">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation.">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).</li><li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Securin,+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila.">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li><li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes.">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li><li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development.">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).</li><li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes.">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li><li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation.">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li><li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes.">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Balık kullanımını değerlendirmek için kol uyum içinde prometafaz durumunu ben ve metafaz probları ben Drosophila yumurta Drosophila mayoz alanında önemli bir gelişme olduğunu. Tarihsel olarak, Drosophila araştırmacılar erken kol uyum olgun yumurta11,18,19kaybı anlaması için genetik testler için sınırlı olmuştur. Şimdi, burada sunulan yöntemleri ile doğrudan balık kullanarak kol uyum durumunu denetlesinler. Yeteneği büyük ölçüde erken kol Kohezyon kaybı için fiziksel kanıt elde etmek için yaklaşımlar kol uyum ve kromozom missegregation Drosophila yumurta içinde erken kaybına yol açan mekanizmalar eğitim kullanılabilir repertuar genişletir.
Kritik adımlar Her ne kadar biz kritik parametreleri gerekli tek kopya sıralarını olgun Drosophila yumurta kromozom kolunda boyunca hybridizes bir floresan sonda başarılı görselleştirme için sistematik bir analizini yapmamış, sunduğumuz Aşağıdaki listede bu teknik başarısı için katkıda bulunan faktörler. Kol sonda üretmek için biz altı yaklaşık 0.8 Mb Xaralığını kapağı BAC probları örtüşen bir arada kullanılan-kromozom kol. Daha küçük bir bölge yayılmış daha az BACs kullanarak bizim ilk girişimi başarılı değildi. Buna ek olarak, parçalara ayırması ve sonunda etiketleme önce BAC DNA Alexa-647 ile yükseltmek için bir yöntemi kullandık. Etiketli kısıtlama parçaları çoğunluğu olan kalın doku21üzerinden verimli Difüzyon için gerekli de hedef boyutunu 150 nükleotit ile aynı fikirde 100-200 bp uzun (Şekil 2) vardı. Büyük Drosophila oosit morfolojisi korumak, ancak aynı zamanda sonda nüfuz izin fiksasyon koşullar gereklidir. Biz bizim önceden kullanılan fiksasyon yöntemi23 37 ° C'ye ısıtılmış bir düzeltme çözüm için oda sıcaklığında heptane ekleyerek değiştirdiniz Olası penetrasyon fiksasyon için indirdi sıcaklık yanı sıra vitelline membran aracılığıyla artırmak için heptane her iki yanı sıra kol uyum görselleştirme için başarılı fiksasyon koşullar katkıda düşünüyoruz.
Uyum Prematüre kaybı için raporlaması, bir miktar var olan kusurların sağlayan bir örnek boyutu gerektirir, orta düzeyde düşük. Çok sayıda olgun yumurta elde etmek için diğerleri yetişkin kadın 26,27eleme ile kombine bozulma blender kullandık. Burada biz bir yöntem hakkını tarif üzerinden 20-25 kadın yumurtalık incelemek, geç manuel ayırma ile yumurta pipetting tarafından aşama. Blender/Eleme yöntemi de bu iletişim kuralı ile çalışması gerekir iken, bir el diseksiyon eleme adım yumurta için harcadığı arabellek anafaz olasılığını azaltır fiksasyon önce daha kısa sürede ben başlangıçlı nedeniyle yapay yumurta avantajdır harekete geçirmek. Buna ek olarak, bu yöntem malzeme başlangıç olarak daha az sayıda kadın gerektirir, reaktifler daha küçük hacimli kullanır ve tüm bunların birden çok genotip işleme kolaylaştırmak daha basit bir iş akışı olan.
El diseksiyon ve manuel ayrılması olgun yumurta yumurta "almak için" yeterli miktarda koryon ve vitelline membran kaldırılması için sağlar ve yaklaşık 75-150 yumurta hibridizasyon yıkar, sonundaki sonuçları. Verimi en üst düzeye çıkarmak için bir numara yumurta tutuklandı metafaz bakire kadın erkek diseksiyon25önce yokluğunda mayalanarak şişeleri tutun etmektir. Chorions ve vitelline membran kaldırmak için haddeleme yumurta yumurta yok önlemek için nazik bir dokunuş ile gerçekleştirilmesi gerekir. Ancak, chorions ve vitelline membran yumurta % 100 çıkarmadan gerçekçi bir hedef değildir ve sadece aşırı haddeleme yumurta kaybına sonuçlanır. Bu nedenle, çalışırken her döngüsü ne zaman kesilmelidir yumurta olmaması chorions ve vitelline membran yaklaşık % 75-85.
Sınırlamaları Üreten ve uyum içinde olgun Drosophila yumurta durumunu izlemek için kol problar kullanarak bizim başarı rağmen yordamı sınırlamalar hala acı çekiyor. Biz nadiren bir sinyal pericentromeric sonda için algılamak başarısız olsa da, kol sonda sinyal zayıf veya yumurta yaklaşık % 15-20 biz görüntüsü yok. Bir katkıda faktör pericentric Oligonükleotid sonda (22-28 nukleotid) fark nüfuz büyük kol sonda (100-200 nukleotid) karşı olabilir. Buna ek olarak, bu kol sonda için daha parlak bir sinyal pericentric sonda sonuçlarında tarafından tanınan büyük yinelenen sıra. Imaging zaman yumurta ve yumurta içinde segregasyonun kromozomların yerleşim yönünü da bir sorun mevcut. Segregasyonun kromozomlar nispeten hücre korteks yakın olmakla birlikte, ne zaman coverslip üzerinde montaj oosit yönünü kontrol etmek mümkün değildir. Bu nedenle, bazı kısmını yumurta, segregasyonun kromozomlar 100-200 µm coverslip ve sinyal yoğunluğu olabilir ve kaliteli oosit toplu görüntü çalışırken olumsuz etkilenebilir. Bu sınırlamalar son kantitatif analize dahil yumurta sayısı iletişim kuralında işlenen yumurta sayısından önemli ölçüde daha düşük olduğu anlamına gelir. Kol uyum içinde 100 yumurta durumunu belirleyen iki bağımsız hazırlıklar büyük olasılıkla gerektirir. Bir lazer confocal mikroskobu tarama kullanarak uyum kusurları miktarının bir ek sınırlayıcı faktör tipik bir Z serisi (yaklaşık 5 dk), yakalamak için gerekli zamanı bile ne zaman yakalanan alan 1,024 x 512 piksel olarak sınırlı. Bu uyum kontrolü ve deneysel genotip (100 her yumurta) karşılaştırılması yaklaşık 16 h resim koleksiyonu zaman gerektiren anlamına gelir.
Değişiklikler ve sorun giderme Biz saytolojik pozisyon 6E-7B19 X kromozomu tanır bir sonda kullanarak kol uyum durumunu izlemek mümkün olmuştur. X kromozomu üzerindeki daha distal bir konuma hybridizes bir sonda chiasma bakım hatalarını algılama için daha çekici olabilir. Buna ek olarak, diğer araştırmacılar kol uyum diğer kromozom üzerinde analiz etmek isteyebilirsiniz. Biz autosomes araştırma girişiminde değil iken, ilk veri X kromozomu 2F - 3 C bölgesi de tanır bir sonda algılanabilir sinyal sonuçları gösterir. Ancak, sınırlı ön verilere dayanarak, 2F - 3C prob sinyal daha az "kompakt" 6E-7B sonda için bundan olabilir. Balık sinyallere sıkı ve bazı yumurta kromozomlar için net olmakla birlikte, diğer yumurta kromozomlar hibridizasyon İşaretimle önemli ölçüde kapatıyor. Kromozom morfolojisi hakiki farklılıkları iki saytolojik konum arasında sinyal bu farklılıkları yansıtmak, iki hibridizasyon etkinliğini değişkenlik probes veya farklı yumurtalar arasında sadece Stokastik değişkenlik olacak daha ayrıntılı bir analiz gerektirir.
Önemlisi, 6E-7B sonda için bile, biz bazı yumurtalar, diffüz kromozom sinyal gözlenen ve bu kez onların dışlama çözümlemesi gerektirdiği. Buna ek olarak, biz değişim sinyal kalitesi ve parlaklık 6E-7B sonda farklı hazırlıkları arasında fark ettim ve bu o görüntüleme gerekli parametreleri buna göre ayarlanmış. Hibridizasyon sıcaklığı 42 ° c yükselterek, diffüz sinyali ile yumurta sayısını değil, ama aşırı pericentric Oligonükleotid sonda işaretimi etkileyebilir. Bir çaba daha iyi kromozom morfolojisi24korumak için biz de daha düşük sıcaklıkta (80 ° C) daha uzun bir denatürasyon adım çalıştı, ama bu tedavi ne sinyal şiddeti artar ne de yumurta ile diffüz sayısı sınırlı olduğunu buldum Kromozom balık sinyal. Ayrıca parlak bir kol sinyal saytolojik bölge 5E-7B yayılmış bir yaklaşık 1,5 Mb aralığı için karşılık gelen 12 örtüşen BACs kullanarak elde etmek çalıştı. 12 bir BAC sonda kullanırken, varyasyon sinyal yoğunluk derecesini yanı sıra yumurta sinyal eksik yüzdesi ne zaman altı BACs kol sonda yapmak için kullanılan daha farklı değildi. Bu da daha fazla uyum kusurları için balık sinyallere daha büyük, daha zor bireysel chromatids için karşılık gelen noktalar gidermek yapım olduğu için 12 BAC sonda kullanırken puanı için zor oldu. Sinyal yok yeni hazırlanan bir sonda ile elde edilir durumda araştırmacılar güçlendirilmiş boyutunu kontrol etmelisiniz ve kısıtlama BAC son etiketleme için kullanılan parçaları öncelikle 100-200 bp aralığı içinde olduğunu doğrulamak için DNA sindirilir. Bu başarılı sonda hazırlanmasında en önemli faktörlerden biri olması muhtemeldir.
Gelecekteki yol tarifi Protokolü immunostaining içerecek şekilde adapte yanı sıra resim alma geliştirmek için yapılacak çalışmalar diğer araştırmacılar yararlanacak önemli gelişmeler olur. Görüntü toplama sırasında görüntüleri Aksiyel boyut hem de daha hızlı resim alma daha fazla sayıda toplama uyum kusurları miktarının için avantajlı olur. Confocal tarama lazer için görüntüleme parametrelerini optimize içinde bulduk 0.25 µm Z serisi için kayda değer balık ağartma önlemek için kullanılabilir en küçük adım boyu olduğunu bildirir. Ancak, daha az 0.25 µm Z yığını tarafından ayrılan balık sinyalleri için bu adım boyu başarısızlık resimde arasında "boşluk" yakalamak için neden olabilir ve bu nedenle uyum hatalarının sayısı hafife. Bir iplik disk confocal daha hızlı görüntü edinme hızını küçük adım boyutları ağartma sinyal kullanılmak üzere izin verebilir. Bu daha doğru görüntü imar Aksiyel boyut sağlamak gibi uyum kusurları için analiz edilecek yumurta daha büyük sayıda izin. Buna ek olarak, immunostaining kol uyum durumunu balık görselleştirme ile birleştirme olanağını protokol önemli ölçüde artıracak. Birkaç hazırlıkları için iğ immunostaining aşağıdaki hibridizasyon yordamı gerçekleştirmeye çalıştınız. Ancak, güçlü işmili boyama sadece yumurta küçük bir kısmını içinde görünür. Ayrıca, ne zaman balık ve immunostaining kombine edilmiştir net değildir nedeniyle, sahte balık sinyalleri yüksek düzeyde segregasyonun kromozomlar çevrili. İmmunostaining önce veya sonra balık yordamı iletişim kuralını optimize etmek için daha fazla çalışmalar büyük ölçüde bu teknik kapasitesini genişletmek.

Mitoz ve mayoz sırasında kromozomların uygun segregasyon gerektirir bu kardeş Kromatit uyum olmak kurulan, muhafaza ve bir eşgüdümlü moda1,2' serbest bırakmak. Uyum S aşamasında kurulur ve kız kardeşi tutun fiziksel bağlantıları oluşturan cohesin tarafından karmaşık, aracılık ettiği chromatids birlikte. Mayoz, uyum bir crossover için distal, aynı zamanda rekombinant homologs bir arada tutmak için çalışır ve bu fiziksel ilişki uygun yönlendirmeyi sağlamaya yardımcı olur, metafaz üzerinde bivalent (şekil 1)3,4, iğ 5. Serbest bırakmak-in kol uyum anafaz, ters iğ Polonyalılar için ayırmak homologs sağlar. Ancak, kol uyum ise zamanından önce kayıp rekombinant homologs onların fiziksel bağlantı kesilirse, rastgele, hangi aneuploid gametler (şekil 1) neden olabilir ayırmak.
İnsan yumurta, kromozom segregasyon hataları Düşükler ve doğum kusurları, Down sendromu6gibi önde gelen neden olan ve onların insidansı katlanarak maternal yaş7ile artar. Kardeş Kromatit uyum içinde fetal yumurta kurulur ve segregasyonun rekombinasyon doğumdan önce tamamlanır. Yumurta sonra tutuklama orta profaz ben yumurtlama kadar ve bu tutuklama sırasında rekombinant homologs devam eden fiziksel Derneği kardeş Kromatit uyum dayanır. Bu nedenle, mayoz ve normal gebelik sonuçları sırasında doğru segregasyon gerektirir uyum 50 yıl kadar olduğu gibi kalır.
Uyum insan yumurta uzun süreli segregasyonun tutuklanması sırasında erken kaybı maternal yaş etkisi katkıda bulunmak için önerilen ve kanıt birkaç satırlık bu hipotez8,9çekmek için. Ancak, insan yumurta segregasyonun uyum eğitim sorunları göz önüne alındığında, bu olayın bizim anlayış çok fazla model organizmalar5,10,11,12, kullanımına dayanıyor 13,14,15.
Drosophila melanogaster yumurta segregasyonun uyum ve kromozom segregasyon çalışma için birçok avantaj sunar. Basit bir genetik tahlil bir döl aneuploid gamet kurtarmak ve Xkalitesini ölçmek sağlar-kromozom segregasyon büyük ölçekli11,16,17. Ayrıca, bir de ben kol uyum11,18, Prematüre kaybı ile tutarlı bir fenotip mayoz sırasında rekombinant homologs missegregate çünkü kromozom segregasyon hataları ortaya olup olmadığını belirlemek 19. Drosophila yumurta segregasyonun uyum durumunu gözlem yeri de Floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak doğrudan. Her ne kadar floresan oligonucleotides bu tekrarlayan uydu serileri melezlemek için bir on yıl içinde pericentromeric uyum olgun Drosophila yumurta4,20, kol analizini izlemek için kullanılmış uyum çok daha zor olmuştur. Görselleştirme kol uyum devleti tek kopya büyük bir bölgeye yayılan bir sonda dizileri ve kol uyum yok olduğunda görünür sinyaller bireysel kız kardeşi için chromatids neden yeterince parlak gerektirir. Buna ek olarak, oosit fiksasyon koşulları ve etiketli DNA'lar boyutunu penetrasyon21 büyük olgun Drosophila oosit (200 µm geniş 500 µm uzun tarafından) içine kolaylaştırmak gerekir. Son zamanlarda, bir kol başarıyla yoklamaydı kullanılan görselleştirmek için Drosophila oosit chromatids anafaz sırasında ben, ama yazarlar onlar bir sinyal içinde prometafaz-ebil değil bulmak olduğunu ifade veya metafaz yumurta22tutuklandı. Burada Xüretimi için detaylı bir protokol sağlar-kromozom kol balık probları ve bizi kardeş Prematüre kaybı için Kromatit uyum içinde prometafaz tahlil için ben ve metafaz sağladı oosit hazırlanması koşulları ben yumurta. Bize segregasyonun uyum bakımı için gerekli olan gen ürünleri tanımlamak etkinleştirdiyseniz, bu teknikler, kardeşi için tahlil başkalarına sağlayacak Kromatit uyum kusurları farklı genotip olgun Drosophila yumurta içinde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Prep BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2</td>
			<td>Amplify BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21676</td>
			<td>Label BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals &#38; Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Prepare 10% stock 
			Freeze aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C75-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100&#181;g/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 &#176;C. Prepare 1 &#181;g/ml solution in 2X SSCT before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite</td>
			<td>Drierite Company</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td>Prepare 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP (10 &#181;mol, 100 &#181;l)</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>1277049</td>
			<td>Prepare 1 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>Prepare 250 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (molecular grade, 200 proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>18505</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>901393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>737-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H350-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438227</td>
			<td>Prepare 3 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.9 M Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>104-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#376; 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 &#376; 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (0.1mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S209-500</td>
			<td>Prepare 3M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1131</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28320</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC (Saline Sodium Citrate)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 300 mM sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X cacodylate fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1X Hybridization buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSBTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction buffer (PBSTx + Rnase)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 &#181;g/mL RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 20% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 40% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 50% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0137S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaeIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0108S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MseI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0167S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuCI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0636S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NEB buffer #2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/&#181;l</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>3333566001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT buffer</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology Tools etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#5 INOX, Biologie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#8221; Disposable glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td>Autoclave to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass dissecting dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well dish (3 wells)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7223-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-104</td>
			<td>Used to cover deep well dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted glass slides, 25 x 75 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48312-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong GOLD mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed-air in can</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at room temperature</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at 4 &#176;C</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven or incubator with rotator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSi laser scanning confoal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;l microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l PCR tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container with tight fitting lid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>To hold Drierite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>disposable wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC purified 5&#39;-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes

İnsanlarda kromozom segregasyon hataları yumurta Düşükler ve doğum kusurları çoğunluğu için sorumlu olan. Ayrıca, kadınların yaşlandıkça, hamile kalma aneuploid bir fetus önemli ölçüde artırır ve bu olay riskini maternal yaş etkisi bilinir. Doğru kromozom ayrışma sırasında segregasyonun bölümler için bir gereklilik olduğunu bakım kardeş Kromatit uyum yumurta deneyim genişletilmiş profaz döneminde. Hem insanlar hem de model organizmalar saytolojik kanıtlar segregasyonun uyum süreci yaşlanma sırasında bozulur gösteriyor. Buna ek olarak, insan yumurta segregasyon hataları mayoz sırasında en yaygın olan ben, kol uyum Prematüre kaybı ile tutarlı. Model organizmalar uyum yaş bağımlı kaybı altında yatan mekanizmaları çözülüyor için kritik kullanımıdır. Drosophila melanogaster segregasyonun uyum içinde yumurta Yönetmeliği çalışmak için birçok avantaj sunar. Ancak, yakın zamana kadar sadece genetik testler kol uyum içinde yumurta farklı genotip veya farklı deneysel koşullar altında kaybı için tahlil mevcut idi. Floresans in situ kullanmak için hibridizasyon (balık) doğrudan görselleştirmek için kusurları kol uyum içinde prometafaz içinde ben ve metafaz Drosophila yumurta tutuklandı, detaylı bir iletişim kuralı sağlanmıştır. X kromozomu distal koluna hybridizes bir balık sonda üreten ve confocal Z yığınları toplama, bir araştırmacı, birçok bireysel balık sinyalini üç boyutlu görselleştirme ve kardeş olup olmadığını belirlemek Kromatit kolları ayrılmış. Özetlenen yordamı kol uyum kusurları Drosophila yumurtalar yüzlerce ölçmek olanak sağlar. Bu nedenle, bu yöntem uyum bakım yanı sıra onun ölümü için yaşlanma sürecinde yol açan faktörler katkıda mekanizmaları araştıran için önemli bir araç sağlar.

Şekil 5 saytolojik bölge 6E-7B X kromozomu üzerinde hybridizes bir kol sonda ile elde edilen görüntüler sunar. Bu araştırma sonuçlarında DAPI Bununla birlikte yerelleştirir, arka plandan kolayca ayırt edilebilir ve başarıyla kol uyum kusurları farklı genotip19ölçmek için kullanılan bir sinyal. Miktar uyum kusurların kısıtlı prometafaz için ben ve metafaz ben aşamaları; Yumurtalar önce nükleer zarf arıza analizi19dışlandı. Sağlam bir nükleer zarf oosit kromozomlar çevreleyen sitoplazma koyu bir ayrık dairesel alan tarafından çevrili olacak çünkü DAPI kanalda tararken belirgindir.
Şekil 5B maksimum yoğunluk projeksiyon bireysel Z serisi deconvolution ve kontrast geliştirme sonra gösterir. Miktar uyum kusurların balık sayısı bu çakışma DAPI sinyal ile sinyalleri için her sonda belirlenmesi gerekir. Böyle bir analiz için üç boyutlu olarak birleştirilen görüntülerin görselleştirme zorunludur. Yalnızca açıkça tüm üç boyutlu DAPI sinyal ile ilişkili olan balık noktalar analize dahil edilmelidir.
Bozulmamış kız kardeş Kromatit uyum için kol ve pericentric sondalar (şekil 5B, sol) iki balık noktalar olarak kanıtlandığı. Ya sonda için üç ya da dört ayrı balık noktalar içeren yumurta uyum kusurları (şekil 5B, sağ) için kabul edilir. Tek tek noktalar sınıflandırılmış için iki balık sinyal minimal bütün üç boyutlu en küçük spot çapı için karşılık gelen bir mesafeye göre ayrılması gerekir. İki balık noktalar bağlayan ince zayıf konu nadir değildir. Böyle sinyalleri tamamen ayrılmış dikkate alınmaz ve bu nedenle uyum kusurların örnekler olarak sayılmaz.
6E-7B kol hibridizasyon sonda ile yaklaşık 15-%20 yansıma yumurtalar tamamen yoksun sinyal veya sinyal güvenle puanı için çok zayıftı. Buna ek olarak, kabaca görüntüsü yumurta % 5 diffüz kromozom sinyal geniş bir alanda sergilendi ve bunlar analiz çıkarıldı. Buna ek olarak, pericentric hibridizasyon sinyal eksik veya skoru çok yaygın olduğu yumurta karşılaşmaya nadir.
6E-7B kol sonda yoğun prometafaz kol uyum hataları ölçmek için kullanılan ve metafaz, Drosophila yumurta tutuklandı farklı genotip19. Ne zaman cohesin alt birim SMC3 orta profaz, 16,3 bulunan yüzde analiz olgun yumurta sırasında iki noktalar, kol uyum Prematüre kaybı gösterge kol daha büyük yerlere saçılmıştı. Buna ek olarak, biz ayrı kol noktalar SMC319normal düzeyde bulunan yumurta sadece % 5.1 gözlenen. Kol uyum sıklığını kusurları rağmen ilginçtir, birden fazla devirme genotip, chromatids nadiren kendi pericentric bölgeler19ayrı kaldık kardeş olarak yükseltilmiş oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig1.jpg"> Şekil 1: uyum tutukluyorum genişletilmiş profaz sırasında kaybı yaş bağımlı kadın mayoz kromozom segregasyon hataları ve anöploidi yumurta içinde sonuçlanabilir. Uyum kardeş arasında siyah çubuklar tarafından temsil chromatids. Kol uyum rekombinant homologs bir arada tutmak için işlev görür ve anafaz, doğru ayrımı gereklidir ben. Kol uyum zamanından önce kaybolursa, aneuploid yumurta kaynaklanan kromozom missegregation oluşabilir. Bu rakam başvuru19adapte oldu. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig2.jpg"> Şekil 2: Boyut DNA moleküllerinin BAC parçalanma ve amplifikasyon (solda) ve sonra sonra restriksiyon enzimi sindirim (sağda) üç farklı BACs için. 400 ng güçlendirilmiş DNA ürünlerin ilk üç şerit gösterilir. Son üç şerit DNA parçalarının gecede kısıtlama "denemeler" den sonra göster. Güçlendirilmiş DNA ürün aralığı 200 den bp 3 kb. Kısıtlama Özet, 100-200 bp arasında değişiyordu çoğu parçaları, ama daha büyük parçaları sonra (en çok 500 bp) görünür idi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig3.jpg"> Şekil 3: Sitoloji araçları. İletişim kuralında kullanılan araçlar: (1) çift forseps (#5 Dumont); (2) tungsten iğne; (3) Derin kuyu çanak kapağı; (4) sığ cam tabak dissekan; (5) çekti Pasteur pipet. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig4.jpg"> Şekil 4. Düzenleme ve hareket yumurta haddeleme için slaytların. (A) diyagramı slayt iletişim kuralında tanımlandığı gibi yumurta haddeleme için ayarlayın. Daha koyu alan slayt buzlu cam parçası gösterir. Hareket vektörel çizimler için slayt #2 (B) yönünü haddeleme yumurta sırasında. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig5.jpg"> Şekil 5. Balık tahlil sonuçları. (A) şematik Drosophila X kromozomu ve nerede iki problar (6 her BACs) kol ve iletişim kuralında tanımlanan 22 Oligonükleotid pericentromeric sonda melezlemek gösteriyor. İçin kolaylık, 6E-7B sonda 7B etiketlenir ve 2F - 3C sonda 3 C. etiketlenir (B) balık sonuçları (6E-7B sonda) sağlam kol uyum (iki kol sonda lekeler, homolog başına bir adet) ve kesintiye kol uyum (3-4 kol sonda lekeler) temsilcisi görüntülerini. DNA mavi, kol sonda sinyal sarı ve pericentric sonda sinyal kırmızıdır. Görüntüleri maksimum yoğunluk projeksiyonlar Z serisi deconvolution ve kontrast geliştirme sonra karşılık gelir. Ölçek çubuğu 2 µm =. Bu rakam başvuru19adapte oldu. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes at JoVE.com

Prometafaz ve Metafaz I Drosophila Oositlerinde Kol Uyum Durumunu İzlemek İçin Floresan Yerinde Hibridizasyon FISH Kullanımı | Gelişimsel | Biyoloji | Video

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K Görüntüleme.  Dartmouth College. Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Video: Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Gelişim Biyolojisi

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj