Yazarlar NIH/NIGMS destek kabul (HJN R01GM084135) ve Glycoscience (hibe #110071 HJN) ve are minnettar Tom V. Lee için tartışma ve öneriler deneyleri, Mizutani Vakfı ve Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine ve Plazmidler ve hücre hatları için Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC).

1. Şems nakavt için çift telli RNA (dsRNA) hazırlanması
<ol>
	<li>PCR güçlendirme ürünleri
	<ol>
		<li>Vahşi tipi sarı beyaz (y w) genomik DNA ve pAc5.1-EGFP dsRNA sentezinde kullanılan DNA parçalarının yükseltmek için şablon ve aşağıdaki astar çiftleri kullanın. Aşağıdaki PCR termal profili kullan: denatürasyon (95 ° C, 30 s), tavlama (58 ° C, 30 s) ve uzantı (72 ° C, 1 dk.). 
		Yeşil flüoresan Protein gelişmiş (EGFP) dsRNA astar (5' - 3')- İleri astar-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG Astar GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG ters 
		Şems dsRNA astar (5' - 3')- İleri astar-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT Astar TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA ters Not: EGFP dsRNA negatif kontrol kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jel-arındırmak Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri üreticisinin protokolüne göre ticari jel arıtma seti kullanarak.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon ticari bir ürün üreticisinin protokolüne göre T7 organizatörü dan transkripsiyonu yetenekli kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir RNA arıtma seti üreticisinin protokolüne göre kullanarak dsRNA arındırmak ve-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>Şems nakavt verimliliğini (1.5.1-1.5.5) aşağıdaki adımları kullanarak değerlendirmek.
	<ol>
		<li>Fetal sığır Serum (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin plaka 1 mL/Schneider'ın ortamının iyi hemasitometre ve plaka 5 x 105 S2 hücreleri de 6 her kuyuya kullanarak el ile hücrelerin % 10 ile desteklenmiş sayısı.</li>
		<li>Her şey için EGFP- veya Şems dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Hasat (EGFP dsRNA tedavi) denetim ve Şems dsRNA tedavi S2 hücreleri nazik Santrifüjü 1000 x g için 25 ° c 5 min ve bir RNA ekstraksiyon kiti göre kullanarak RNA izolasyonu için işlem tarafından aşağı peletleme tarafından takip pipetting tarafından üreticinin iletişim kuralı.</li>
		<li>Spektrofotometre ve işlemi 100 kullanarak RNA ölçmek için 1-adım qRT-PCR ticari qPCR reaktifler ve astar/sonda ve aşağıdaki PCR termal profili kullanarak RNA'ın ng: denatürasyon (95 ° C, 15 s) ve TAV/uzantısı (60 ° C, 1 dk). Not: Lütfen astar/sonda setleri ve bu çalışmalarda shams , denetim qRT-PCR deneyleri için kullanılan alet Malzemeler tablo bilgi için bakınız.</li>
		<li>2-ΔΔCT yöntemi16kullanarak göreli shams mRNA düzeyleri hesaplayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. değerlendirme arasındaki çentik reseptörü ve Trans-ligandlar
<ol>
	<li>Sinyal alma hücreleri (çentik reseptör ifade S2) hazırlayın.
	<ol>
		<li>El ile bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve plaka 5 x 105 S2 ve her şey bir 6-şey plaka 1 ml/Schneider'ın ortamının de istikrarlı S2-çentik hücrelerde FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin % 10 ile desteklenmiştir. Not: Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) üzerinden kullanılabilir olan S2-çentik hücreler için 200 nM metotreksat medya ekleyin. 0,5 mM metotreksat hisse senedi çözüm hazırlamak için ilk 20 mM metotreksat çözümde 250 µL 1 M NaOH hazırlamak. Ardından, bu çözüm için 1 M fosfat tampon serum ve store-20 ° C'de 0,5 mM sulandırmak S2-çentik hücrelerde, çentik protein Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör kontrolü altında ifadesidir.</li>
		<li>Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>0.7 mM çentik ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO4 ekleyin. Not: CuSO4 metallothionein düzenleyici tarafından kontrollü proteinlerin ifade ikna etmek için kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sinyal gönderme hücreleri (Delta veya Serrate ligandlar ifade S2 hücre) hazırlayın.
	<ol>
		<li>El ile bir hemasitometre ve plaka ~ 5 x 106 istikrarlı S2-Delta veya S2 SerrateTom hücrelerde her şey 1 ml 6-şey plaka kullanarak hücreleri saymak/FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin iyi Schneider'ın orta % 10 ile desteklenmiştir. Not: S2-Delta hücreler için 200 nM metotreksat ve 100 µg/mL hygromycin S2 SerrateTom hücreler için medya ekleyin. Delta ve SerrateTomifadesi — Serrate12domates öğesini, işlevsel sürümü — Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör altındadır.</li>
		<li>0.7 mM ligandlar ifade teşvik ve 25 ° c 3 h için kuluçkaya CuSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama gerçekleştirmek.
	<ol>
		<li>DsRNA tedavi edilen S2 hasat (kontrol) ve S2-çentik hücreleri tarafından yumuşak pipetting ve hemasitometre tarafından elle sayım sonra hücreler/iyi bir 24-şey plaka plaka 2.5 x 105 .</li>
		<li>5 x 105 istikrarlı S2-Delta veya S2 SerrateTom hücre Schneider'ın orta 200 µL toplam bir birim içinde eklemek (% 10 ile desteklenmiş FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin). Not: tüm S2 hücreleri (kaplama, indüksiyon ve dsRNA tedavisi de dahil olmak üzere) işleme altında bir biyogüvenlik kabini yapıldı.</li>
		<li>Plaka bir orbital Çalkalayıcı 150 RPM (942.48 rad/dak) yerleştirin.</li>
		<li>1 dk sonra her şey içeriğini karıştırmak ve toplamları sayılması için 20 µL çıkar.<ol>
			<li>Aynı anda ters bileşik 10 x büyütme (PLL 10/0,25 amaç) kullanma mikroskop altında temsilcisi bir görüntü çekmek.</li>
			<li>El ile agrega saymak (&#62; 6 hücreler) bir hemasitometre kullanarak.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bir shaker tabakta bir yer.</li>
		<li>Resim alma ve 5 dk sonra ve 15 dak toplama sayma yineleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmiktar gerçekleştirmek-bağlama.
	<ol>
		<li>S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 SerrateTom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.</li>
		<li>S2-çentik ve S2-Delta veya S2 SerrateTom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını hesaplamak ( transbüyüklüğü-bağlama).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.Çentik ve Transarasında bağ inhibisyonu değerlendirilmesi- CIStarafından ligandlar-ligandlar
<ol>
	<li>Sinyal alma hücreleri hazırlayın.
	<ol>
		<li>Her şey bir 6-şey plaka 1 ml/de Schneider'ın orta plaka 5 x 105 S2 hücrelerde % 10 ile FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin desteklenmiştir.</li>
		<li>Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>DsRNA tedavi edilen hücreleri pBluescript ve Devresel ödeme-çentikile11 (DGRC) tek başına veya DEVRESEL_ÖDEME-çentik ve Devresel ödeme-Delta11 ile birlikte transfect (DGRC) veya DEVRESEL_ÖDEME Serrate17 toplam DNA toplama µg/iyi bir ticari transfection reaktif üreticisinin protokolüne göre kullanarak 2. Not: pBluescript bir denetim olarak kullanılır. Co transfected hücreleri S2-çentik adı verilecek &#38; Deltageçici veya S2-çentik &#38; Serrategeçici hücreleri bundan sonra.</li>
		<li>25 ° c 24 h için geçici transfected S2 hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>0.7 mM çentik ve ligandlar ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücreleri sinyal gönderme 2.2 içinde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama 2.3 bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirmek.</li>
	<li>Transinhibisyonu ölçmek- CIStarafından bağlama-ligandlar.
	<ol>
		<li>S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 Serrate hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.</li>
		<li>CIStarafından inhibisyon büyüklüğü ölçmek-ligandlar gibidir.<ol>
			<li>A toplamları S2-çentikgeçici ve S2-Delta hücreler arasındaki sayısını tanımlamak için kullanılır.</li>
			<li>Toplamları S2 hücreler arasında sayıda geçici çentik ve Delta ile birlikte transfected gibi B tanımlayın (S2-çentik &#38; Deltageçici) ve S2-Delta hücreleri.</li>
			<li>Göreli toplama C hesaplamak = (B x 100) /A</li>
			<li>BDT- ligand (Delta veya Serrate) 100-tarafından inhibisyon büyüklüğünü hesaplamak C. Not: göreli toplama ise % 45, o zaman CISbir örnek olarak-ligandlar transetkisizleştirmek için kabul edilir-55 oranında bağlama.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Kurallı sinyal çentik çentik reseptör ve onun ligandlar5arasındaki etkileşimler bağlıdır. Çentik yolu en çalışmaları, öncelikle çentik ve ligandlar komşu hücrelere (trans) bağlama dikkate rağmen çentik ve aynı hücre ligandlar etkileşim ve bu sözde CIS-etkileşimleri çentik bir inhibitör rol oynayabilir 3,4sinyal. Buna göre kurallı çentik sinyal üzerinde bir değiştirici etkileri altında yatan mekanizmaları deşifre etmek için genellikle çentik-ligand etkileşimleri (trans ve BDT) her iki tür incelemek uygun olur. Ancak, hayvan geliştirme sırasında pek çok bağlamlarda, in vivo çalışmalar1,6her ikisi de bu etkileşimler ve onların geri besleme yönetmelik katılımı zorlaştırmaktadır. Mevcut iletişim kuralında, biz Drosophila S2 hücreleri kullanarak bağlama ile trans- ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından - çentik reseptör değerlendir vitro hücre toplama deneyleri için detaylı bir metodoloji sağlamak ligandlar. Biz çentik genetik bir değiştirici etkisini değerlendirmek için bu yöntem kullanımı (xylosyltransferase Şems7,8) Reseptör-ligand bağlayıcı üzerinde sinyal sundu.
İlk olarak, istikrarlı S2-Delta ve EGFP veya Şems dsRNA tedavi istikrarlı S2-çentik hücreler arasındaki trans shams KD etkisini incelemek için toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir-bağlama. Toplama Şems dsRNA tedavi düz S2 hücreleri ile S2-Delta hücrelerinin arka plan denetimi olarak alınmıştır. Shams KD toplama S2-çentik ve denetimine göre S2-Delta hücreler arasındaki gelişmiş. Arka plan deneysel kontrol toplamalardan düz S2 hücreleri ve ligand taşıma S2 hücreleri arasında paralel transolarak gerçekleştirmek önemlidir-deneyler bağlama. Endojen çentik reseptör ve Delta ligand11 Drosophila S2 hücreleri ifade değil rağmen Serrate düşük seviyelerde ifadesidir S2 hücreleri13' te bildirilmektedir. Bu göz önüne alındığında, düz S2 hücreleri hücre toplama deneyleri içinde arka plan denetimi olarak kullanıldı; Bu hücreler herhangi bir toplama (şekil 5B) belli etmedi. Toplamları kullanarak el ile bir hemasitometre dikkate alınır. Toplam miktar tutarlılık sağlamak için 10-20 µL karma hücre nüfusun dışarı iyi sayımı için başına en az üç farklı alanlardan pipetted. Bu deneyleri sağlıklı büyüyen S2 hücrelerini gerektirir. S2 yarı yapisan doğası göz önüne alındığında hücreler, nazik hücreleri toplarken pipetting ve toplama tahlil sırasında sallayarak sabit önemlidir.
Daha önce biz ve diğerleri iyi kurulmuş, çözünür ligand-reseptör bağlama deneyleri trans17,18,19, Reseptör-ligand bağlayıcı nicel bir değerlendirme için kullandık 20. toplama deneyleri yarı kantitatif olduğundan, çözünür ligand bağlayıcı deneyleri de çentik-ligand trans shams KD etkisini incelemek için gerçekleştirilen-bağlama. Gözlemlenen sonuçları bu toplama deneyleri8' den elde edilen eğilim benzerdi. Bu çentik bağlama ile transsadık değerlendirilmesi tespit-hücre toplama deneyleri kullanarak ligandlar. Toplama oluşumu Reseptör-ligand bağlayıcı bir okuma olsa da, çentik reseptör veya onun ligandlar yüzey ifade tarafından belirtilen değiştiriciler etkileniyorsa karmaşık olabilir. Toplama oluşumu değişikliği değişmiş Reseptör-ligand taşıması nedeniyle veya yüzey ifade değişmiş ayırt edemez olarak bu hücre toplama deneyleri sınırlandırılması vurgulamaktadır. Bu nedenle, toplama deneyleri için paralel, çentik ve ligandlar yüzey ifadesi her değiştirici etkilerini gerekir S2 hücrelerde test edilecek. Çalışmalarımız bağlamında, yüzey düzeyde çentik ve Delta Şems dsRNA tedavi S2 hücre8' etkilenen değil.
Transinhibisyonu incelemek için- CISeklenmesi tarafından bağlama-ligandlar, toplama deneyleri gerçekleştirilen S2-Delta hücreleri ve EGFP veya Şems dsRNA tedavi S2-çentik &#38; Deltageçici hücreleri . Bu hücreler arasında toplamları sayısı toplamları S2-Delta hücreleri ve S2-çentikgeçici hücreleri arasında oluşan sayı ile karşılaştırıldı. Toplamları sayısı göreli düşüş hesaplanır ve CIStarafından inhibisyon büyüklüğü için bir göstergesi olarak kullanılan-Delta. Kontrol deneyleri gösterdi o CIS-ligandlar göstermek çentik sağlam ve doz bağımlı inhibisyonu /trans-Delta bağlama üzerinde çentik bir oldukça geniş aralığı için CIS-ligand oranları (1:1 1:0. 1) (şekil 5A)8 . 1:1 oran CISen güçlü derecesini sonuçlandı-inhibisyonu ve CISgöreli düzeyine azalan-Delta zayıflamış CIS-inhibisyon. Buna göre bu dizi oranları üzerinden KD deneyler gerçekleştirilen. Not, çentik reseptör miktarı ve toplam transfected DNA'ın tüm deneyler sabit tutuldu. Bu toplama oluşumu öncelikle BDTetkinliği tarafından etkilenen sağlayacaktır-ligandlar ve çentik ifadesi hücreleri tarafından düzeyi tarafından değil değiştirilmiş.
Bu önceden çentik ve CISCo o ifade gösterildi-S2 hücrelerdeki ligandlar homotipik toplamalardan14oluşumuna neden olur. Benzer olup olmadığını incelemek için homotipik toplamalardan S2-çentik arasında &#38; Deltageçici veya S2-çentik &#38; Serrategeçici hücreleri CIStoplama quantifications bizim yorumlarını uzlaşma-ligand çalışmaları, Denetim toplama tahlil S2-çentik arasında gerçekleştirilen &#38; Deltageçici ve düz S2 hücreleri. Bu deneylerde kullanılan S2 hücre sayısı CISiçinde kullanılan S2-Delta hücre olduğu gibi-Delta deneyler. Bazı homotipik toplama gözlendi, ancak miktar gösterdi sonuç toplamları S2-çentik arasında heterotypic toplamları ile karşılaştırıldığında toplam toplamları düşük bir kısmını katkıda &#38; Deltageçici ve S2-Delta hücreleri () Şekil 5B).Biz değişiklikleri CIStoplamları sayısında gözlemlenen sonucuna-ligand deneyleri vardır öncelikle BDTinhibitör etkisi nedeniyle-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-Delta.
Özet olarak, bu protokol için sunulan toplama deneyleri trans- ve BDTyarı kantitatif değerlendirmesi için kolay ve basit bir metodoloji sağlamak-çentik reseptör ve onun ligandlar etkileşimler. Bu deneyleri çentik-ligand bağlayıcı vitro genetik veya farmakolojik çentik yol değiştirici etkilerini incelemek için kullanılan ve bu nedenle bu niteleyiciler vivo içinde etkileri üzerinde çentik temel mekanizmaları aydınlatmak yardımcı olabilir işaret.

Kurallı sinyal çentik çentik reseptörleri ve onların ligandlar1arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hücreler komşu fiziksel temas gerektiren bir kısa menzilli hücre-hücre iletişim mekanizmasıdır. Çentik reseptör (sinyal alma hücrelerinin yüzeyinde mevcut) etkileşim ligandlar (sinyal gönderme yüzeyinde mevcut hücreleri) çentik sinyal başlatır ve transbilinen-harekete geçirmek2. Öte yandan, çentik ve onun ligandlar aynı hücrede arasındaki etkileşimi çentik yolu inhibisyonu yol açar ve CISbilinmektedir-inhibisyon3. Trans- ve BDTarasındaki denge-etkileşimleri optimum ligand-bağımlı çentik4sinyal sağlamak için gereklidir. Drosophila vardır bir çentik reseptörü ve iki ligandlar (Delta ve Serrate) dört çentik reseptörleri ve beş ligandlar var memeliler aksine [1 (JAG1), JAG2, pürüzlü delta benzeri 1 (DLL1), DLL3 ve DLL4]5. Bu basitlik sahip, Drosophila model çentik-ligand etkileşimleri ve daha sonra üzerinde çentik sinyal yolu değiştirici etkilerini incelemek/çalışma için kolaylığı sağlar. (Kanat geliştirme Drosophiladahil olmak üzere), hayvan gelişimi sırasında belirli bağlamlarda CIS- ve trans-etkileşimleri çentik uygun sinyal elde etmek ve kader1,6 hücre için söz konusu . BDT- transkarşı çentik yolu değiştiriciler Bu içeriklerde etkilerini ayırt etmek önemlidir-çentik etkileşimleri ile onun ligandlar.
Bizim grup daha önce ksiloz Drosophila çentik için olumsuz olarak adlandırılan bir karbonhidrat kalıntı ilavesi çentik kanat geliştirme7de dahil olmak üzere belirli bağlamlarda sinyal düzenleyen bildirdi. Şems kaybı (enzim o xylosylates çentik) için bir "kayıp kanat damarın" fenotip7açar. Daha yakın zamanlarda, gen dozaj deneyler ve klonal analiz shams kaybı Delta-aracılı çentik singling geliştirir göstermek için kullanılmıştır. Gelişmiş çentik shams mutantlar sinyal azalmış CISbir sonucu olup ayırt etmek için-inhibisyon veya artmış trans-harekete geçirmek, içinde larva kanat Imaginal diskler ligandlar çentik Ektopik overexpression çalışmaları dpp-GAL4 sürücüyü kullanarak uygulandı. Bu deneyler Shams transdüzenleyen kanıt düşündüren sağlanan-harekete geçirmek-in Delta tarafından çentik çentik CISetkilemeden-inhibisyon ligandlar8tarafından. Ancak, düzenlemeler geri besleme ve endojen ligandlar etkileri Ektopik overexpression çalışmalar1,6,9yorumu karmaşık.
Drosophila S2 hücreleri10 kullanıldı, bu sorunu gidermek için hangi çentik-ligand etkileşim çalışmaları11,12için basit vitro sistem sağlamak. S2 hücreleri değil endojen çentik reseptör ve Delta ligand11 hızlı ve çentik-ligand toplama deneyler8etkilemez Serrate13, düşük düzeyde ifade eder. Bu nedenle, S2 hücreleri stabil veya geçici çentik ve/veya bireysel ligandlar (Delta veya Serrate) sadece çentik reseptör veya onun ligandlar biri hızlı hücre oluşturmak için veya bunların bir kombinasyon tarafından transfected. Çentik ifade S2 hücrelerinin ligand ifade S2 hücreleri sonuçlarında heterotypic toplamları Reseptör-ligand bağlayıcı11,12,14tarafından aracılı oluşumu ile karıştırma. Miktar toplam oluşumu sağlar bir ölçüsü trans-çentik ve onun ligandlar15 (şekil 1) bağlama. Benzer şekilde, S2 hücreler çentik ve Delta veya Serrate ligandlar ile ortak transfected olabilir (Yani CIS-ligandlar). BDT-bu çentik ifade S2 hücrelerde ligandlar iptal etmek çentik bağlama ile trans-ligandlar ve sonucu azalmıştır toplama oluşumu8,12,14. Toplama oluşumu CIStarafından neden göreli düşüş-ligandlar CISinhibitör etkisini ölçüsü sağlar-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-ligandlar (Şekil 2). Buna göre hücre toplama deneyleri xylosylation kaybı trans- ve BDTüzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır-çentik ve onun ligandlar arasındaki etkileşimler.
Burada, çentik bağlama ile transdeğerlendirmek için hücre toplama deneyleri amaçlayan için detaylı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar Drosophila S2 hücreleri kullanarak. Örnek olarak, biz bize çentik ve transarasında bağ çentik xylosylation etkisini belirlemek izin verilen veri sağlar-Delta8. Bu basit deneyleri çentik-ligand etkileşimleri vitro yarı nicel bir değerlendirme sağlar ve çentik yolu değiştiriciler vivo içinde etkileri altında yatan moleküler mekanizmalar belirlemek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

Çentik sinyal geniş hayvan geliştirme ve yetişkin bakım ve kullanılan bir evrimsel korunmuş hücre-hücre iletişim sistemidir. Çentik reseptör hücreleri komşu gelen ligandlar ile etkileşimi sinyal aktivasyonu neden olmaktadır (trans-harekete geçirmek), sinyal ligandlar aynı hücreden ile etkileşim inhibe ederken (CIS-inhibisyon). Transarasındaki uygun dengeyi-harekete geçirmek ve BDT-inhibisyon yardımcı olur çentik bazı bağlamlarda hayvan geliştirme sırasında sinyal en uygun belirlemektedir. Üst üste gelen ifade etki alanları çentik ve birçok hücre tipleri içinde onun ligandlar ve geri bildirim mekanizmaları varlığı nedeniyle verilen translasyonel modifikasyon trans- CISkarşı üzerinde etkileri eğitimi-çentik etkileşimleri ve onun ligandlar vivo içinde zordur. Burada, Drosophila S2 hücrelerde hücre toplama deneyleri çentik bağlama trans ve CISher ligand için üzerinde bir çentik yol değiştirici aşağı vurma etkilerini değerlendirmek amacıyla kullanmak için bir iletişim kuralı açıklar. Stabil veya geçici bir çentik ifade vektör ile transfected S2 hücreleri her çentik ligand (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade hücreleri ile karıştırılır. Trans-reseptör ligandlar arasındaki bağı heterotypic hücre toplamları oluşumuna neden olur ve oluşan mL başına toplamları sayısı açısından ölçülür &#62; 6 hücreler. CISinhibitör etkisini incelemek için-ligandlar, çentik ve her ligand ortak ifade S2 hücreleri S2-Delta veya S2 Serrate hücreleri ile karıştırılır ve toplamları sayısı yukarıda açıklandığı gibi sayılabilir. CISvarlığı nedeniyle toplamları sayısı göreli düşüş-ligandlar CISölçüsü sağlar-ligand- transinhibisyonu aracılı-bağlama. Bu basit deneyleri genetik veya farmakolojik işlemler bağlama üzerinde çentik için onun ligandlar etkileri üzerinde yarı Nicel veri sağlayabilir ve in vivo etkileri altında yatan moleküler mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir Çentik sinyal üzerinde böyle manipülasyonlar.

Vivo gözlemlerimiz xylosyltransferase gen shams sonuçlarında çentik nedeniyle sinyal kazanç kaybı Delta-aracılı transartış önerdi- CISetkilemeden çentik aktivasyonu-inhibisyonu Çentik ligandlar8tarafından. Bu kavramı sınamak için vitro hücre toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, S2 hücre deyimde Şems Şems dsRNA kullanarak yere düştü. EGFP dsRNA denetimi olarak kullanıldı. Nakavt (KD) gerçek zamanlı PCR tarafından incelenmiş ve %808' den büyük olduğu gösterilmiştir. O zaman, çentik reseptör transile bağlama-Delta Şems KD muayene toplama deneyleri kullanarak üzerine. S2-çentik ve S2-Delta hücreler arasında toplama onları karıştırma sonra çeşitli zaman noktalarda incelenmiştir. Toplama düz S2 hücreleri ve S2-Delta hücreleri arasında arka plan denetimi olarak alınmıştır. Toplam sayısını gösteren grafik farklı oluşan şekil 3 gösterir karıştırdıktan sonra puan (1, 5, 15 ve 30 dk) zaman. Keskin bir artış göre daha yavaş 30 dk kadar artmaya devam toplamları sayısı toplamları arasında 1 ve 5 dk. daha sonra dizi gözlendi. Bu nedenle, toplama oluşumu 1, 5 ve 15 dk görüntüsü ve toplamları sayısı karıştırma 5 dk sonra sayılabilir.
Şekil 4A shams KD çentik reseptör ve transarasında bağ üzerinde etkilerini değerlendirmek için kararlı S2-çentik ve S2-Delta hücreler arasında toplama deneyleri hücre temsilcisi görüntüleri gösterir-Delta. Resimleri toplama üç kez puan (1, 5 ve 15 dk) göster. Arka plan denetimi için düz S2 hücreleri ( Şems dsRNA ile tedavi) S2-Delta hücreleri ile karıştırıldı. EGFP dsRNA tedavi S2-çentik hücreleri toplamları sayısı zamanla artış S2-Delta hücrelerle kurdu. Buna ek olarak, Şems dsRNA tedavi S2-çentik hücreleri toplamları daha hızlı oluşur ve agrega ve denetim olanlar (şekil 4B) sayısından daha büyük. Bu Shams seviyeleri azalan transgeliştirir belirtilen-çentiği Delta8ile bağlama.
İncelemek için olup Şems düzenleyen CISinhibitör etkisi-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-Delta, biz ilk kurulan çentik ve Delta eş o ifadesi içinde sinyal alma hücre hücre toplama azaltmak Çentik ve transtarafından aracılık-Delta. Şekil 5A gösterir S2-Delta ile S2-çentik arasında oluşan toplam sayısını gösteren grafik &#38; Delta CISfarklı miktardageçici hücrelerle-Delta. Çentik ve Delta ifade yapıları eşit miktarda S2 hücrelere önemli ölçüde transfecting bu hücreleri ve S2-Delta hücreleri arasında oluşan toplam sayısını azaltır. Ayrıca, CISmiktarı azalan-Delta sonuçları toplamları, sayısındaki bir artış girinti aralığını gösteren /BDT-Delta oranları bu deneyleri, CISkullanılan-Delta çentik arasındaki inhibe ve Trans-Delta bir doz bağımlı şekilde. S2-çentik beri &#38; çentik ve Delta Deltageçici hücreleri hızlı, onlar bağımsız olarak S2-Delta hücreleri homotipik toplamları formu. S2-çentik arasında homotipik oluşumu toplar Eğer incelemek için &#38; Deltageçici hücreleri CISkarıştırıcı bir faktör olabilir-inhibisyon deneyleri, şekil 5A' gösterilen bu hücreler S2 hücreleri ile karışık ve sayısal toplar. Şekil 5B S2 hücreleri S2-çentik ile karıştırdıktan sonra oluşan toplam sayısını gösterir &#38; Deltageçici hücreler çeşitli çentik ifade /BDT-Delta oranları. Homotipik toplamları heterotypic toplamları için şekil 5A ' gösterildiği gibi karşılaştırıldığında oldukça az sayıda gözlendi. Biz bu toplama deneyleri sadakatle CISetkisini ölçmek sonucuna-Delta üzerinde çentik ve transarasında bağ-Delta.
Biz sonraki shams KD CISinhibitör yeteneği üzerinde etkisi incelenmiştir-Delta. Bu son, S2-Delta ve S2-çentik arasında toplama &#38; Deltageçici hücreleri inceledi. Şekil 6A gösterir temsilcisi toplama S2-Delta hücreleri ile S2-çentikgeçici (kontrol) veya S2-çentik arasında görüntülerini &#38; Deltageçici hücreleri. S2-Delta ve EGFP dsRNA tedavi S2-çentikgeçici hücre sayısı zamanla toplama S2-Delta ve istikrarlı S2-çentik hücreler (şekil 4) arasındaki benzer artırmak toplamları kurdu. Özellikle, S2-Delta ve S2-çentik karıştırma &#38; Deltageçici hücreler eşit miktarda çentik ve Delta ifade Plasmid'ler ile birlikte transfected daha az toplamları EGFP KD ve Şems KD, o azalan düşündüren üzerine kurulan Shams düzeyini CISyeteneğini etkilemez-çentik engellemek için Delta /trans-Delta bağlama. Daha iyi shams KD etkinlikte, CISetkilerini değerlendirmek için-Delta, inhibisyon CIStarafından büyüklüğü-Delta ölçülen bir çentik aralığı içinde göreli toplama yüzde hesaplayarak /BDT-Delta 3.4.2 bölümünde açıklandığı gibi oranları. Miktar göreli toplama toplama üzerine EGFP ve Şems dsRNA tedavi (şekil 6B) karşılaştırılabilir inhibisyonu gösterdi. Birlikte, bu gözlemler xylosylation kaybı transteşvik öneririz- CISetkilemeden bağlama-inhibisyon8ve shams gözlenen kanat ven kaybı fenotip moleküler mekanizması sağlamak mutantlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig1.jpg"> 
Resim 1: Şematik gösterimi hücre toplama tahlil için Trans-bağlama. Reseptörü (S2-çentik) ve ligand indüksiyon (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade S2 hücre 0.7 mM CuSO4gösteren diyagram. Her iki S2 hücre indüksiyon karıştırılarak, hangi toplamları hale eğilimi izliyor. Bu toplamları (&#62; 6 hücreler) görüntüsü ve sayılabilir.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig2.jpg"> 
Resim 2: CISdeğerlendirmek için hücre toplama tahlil şematik gösterimi-inhibisyon. S2 hücreleri geçici DEVRESEL_ÖDEME-çentik (S2-Ngeçici), DEVRESEL_ÖDEME-çentik ve Devresel ödeme-Delta ile transfected (S2-çentik &#38; Deltageçici), veya DEVRESEL_ÖDEME-çentik ve Devresel ödeme Serrate (S2-çentik &#38; Serrategeçici). 0.7 mM CuSO4 ve S2-Delta hücreleri ile karıştırma indüksiyon sonra toplar (&#62; 6 hücreler) sayısal. İnhibisyon CIStarafından-ligandlar göreli toplama yüzde olarak ölçülen her CISde -ligand. CISetkileri-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-Serrate geçici transfected hücreleri (gösterilmez)Tom S2 Serrate hücreleri ile karıştırılarak belirlenebilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig3.jpg"> 
Şekil 3: S2-çentik ve S2 veya farklı zaman noktalarda S2-Delta hücreleri arasında toplama. Grafik hücreleri belirtilen tür arasındaki (1, 5, 15 ve 30 dk) farklı zaman noktalarında toplamları mL başına sayısını gösterir. Hata çubukları üç çoğaltır ortalaması (SEM) standart hatasını gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig4.jpg"> 
Şekil 4: Hücre toplama aracılı çentik ve trans-Delta. (A)resimleri göster toplama farklı zaman noktalarda (1, 5 ve 15 dk). Toplama Şems dsRNA tedavi düz S2 hücreleri ve S2-Delta hücreleri arasında arka plan denetimi olarak alınmıştır. Shams- dsRNA tedavi S2-çentik hücre sayısında bir artış gösteriyor ve toplamları boyutunu EGFP dsRNA tedavi (Denetim için) S2-çentik hücreleri S2-Delta hücreleri ile karıştırdıktan sonra karşılaştırılır. Ölçek çubuğu = 100 µm. hücre sayısı (B) miktar toplar daha 6 hücre büyük toplama 5 dakika sonra. Hata Çubuklarõn SEM * P &#60; 0,01 (One-way Varyans analizi (ANOVA)). Üç çoğaltır üç bağımsız tekrarlar ile gerçekleştirilmiştir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig5.jpg"> 
Şekil 5: CIS-Delta engeller hücre toplama oluşumu aracılı çentik ve trans-Delta bir doz bağımlı şekilde. (A) grafik gösterir (açısından sayısı toplamları/mL) toplama S2-Delta hücreleri ve geçici çentik ve BDTiçin ifade vektörel çizimler farklı oranları ile transfected S2 hücreler arasındaki-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 ve 1:0. 1). Hata Çubuklarõn SEM * P &#60; 0,01 (One-way ANOVA). Üç çoğaltır üç bağımsız tekrarlar ile gerçekleştirilmiştir. CISdüzeyini azalan unutmayın-Delta sonuçlar toplama, büyük olasılıkla azaltılmış CISnedeniyle bir artış-inhibisyon. (B) grafik homotipik toplama (açısından mL başına toplamları sayısı) geçici S2 hücrelerde gösterilen çentik ve Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 ve 1:0. 1) farklı oranları ile transfected ve düz S2 hücreleri ile karışık. Hata çubuklarını göstermek SEM toplamları sayısıdır S2-Delta ile S2-çentik arasında oluşan heterotypic toplamları sayısından daha küçük &#38; Deltageçici hücreleri. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56919/56919fig6.jpg"> 
Şekil 6: Şems nakavt CISinhibitör etkinliği etkilemez-Delta. (A)gösterildi temsilcisi görüntüler shams KD CISüzerinde etkisi vardır-Delta-çentik tarafından aracılı hücre toplama inhibisyonu aracılı /trans-Delta bağlama. Resimleri toplama farklı zaman noktalarda (1, 5 ve 15 dk) göster. Toplama Şems dsRNA tedavi düz S2 hücreleri ve S2-Delta hücreleri arasında arka plan denetimi olarak alınmıştır. Stabil transfected Barcelona'da S2-çentik hücreleri, Şems KD toplamları S2-Delta ve denetim (EGFP dsRNA tedavi) karşılaştırıldığında S2-çentikgeçici hücreler arasındaki sayısı arttı. CISortak ifade-Delta 1:1 oran çentik ile sonuçlandı kontrol (EGFP dsRNA tedavi) toplamları sayısı karşılaştırılabilir bir düşüş de shams tedavi dsRNA hücreler olduğu gibi. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) grafik gösterir S2-Delta hücreleri ve geçici işbirliği ile belirtilen oranları çentik ve CIS(1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 ve 1:0. 1) transfected S2 hücreler arasındaki göreli toplama-Delta. EGFP ve Şems dsRNA tedavi göstermek toplama karşılaştırılabilir bir düşüş her çentik /BDT-Delta oranı. Burada sunulan veri üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56919/56919fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands at JoVE.com

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans- ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

7.4K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans- ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Video: Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Gelişim Biyolojisi

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...