Diese Arbeit wurde von NIH Grant GM59354 an Sharon E. Bickel vergeben unterstützt. Wir danken für die Unterstützung bei der Ausarbeitung des Protokolls für die Erzeugung von fluoreszierenden Arm Sonden, Ann Lavanway Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie und J. Emiliano Reed für technische Hilfe Huy Nguyen q. Wir danken auch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen in der Drosophila-Community für hilfreiche Gespräche und Beratung.

<ol>
	<li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sister+chromatid+cohesion.">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin.">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li><li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes.">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li><li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction.">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li><li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Down+Syndrome+Project:+design+and+implementation.">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes.">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li><li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes.">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).</li><li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes.">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced.">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes.">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li><li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2.">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age.">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li><li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes.">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li><li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-mediated+association+of+achiasmate+homologues+declines+with+age+when+cohesion+is+compromised.">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li><li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes.">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li><li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation.">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).</li><li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors.">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation.">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li><li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).</li><li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Securin,+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila.">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li><li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes.">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li><li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development.">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).</li><li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes.">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li><li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation.">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li><li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes.">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Verwendung von Fisch-Sonden zur Bewertung des Zustands der Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen ist eine deutliche Weiterentwicklung im Bereich der Drosophila Meiose. In der Vergangenheit wurden Drosophila Forscher zu Gentests zu vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt in reifen Eizellen11,18,19folgern beschränkt. Nun kann mit der hier vorgestellten Methoden der Zustand der Arm Zusammenhalt untersucht werden direkt mit Fisch. Die Fähigkeit, physische Beweise für den vorzeitigen Verlust von Arm Zusammenhalt stark erhalten erweitert das Repertoire der Ansätze zur Verfügung, um die Mechanismen, die zum vorzeitigen Verlust der Kohäsion und Chromosom Missegregation Arm in Drosophila Eizellen führen zu studieren.
Wichtige Schritte Obwohl wir keine systematische Analyse der kritischen Parameter für erfolgreiche Visualisierung von fluoreszierende Sonden, die auf einzelne Kopie Sequenzen entlang dem Chromosom Arm in reifen Eizellen Drosophila hybridisiert durchgeführt haben, bieten wir die folgende Liste von Faktoren, die für den Erfolg dieser Technik beigetragen haben könnten. Um die Arm-Sonde zu erzeugen, verwendet wir eine Kombination aus sechs überlappende BAC-Sonden, die decken ein Intervall von ca. 0,8 Mb auf dem X-Chromosom Arm. Unsere ersten Versuche mit weniger BACs, die eine kleinere Region erstreckten, waren nicht erfolgreich. Darüber hinaus haben wir eine Methode verwendet, zu fragmentieren und verstärken die BAC-DNA vor Ende-Beschriftung mit Alexa-647. Die Mehrheit der Einschränkung Fragmente, die etikettiert wurden, waren 100-200 bp lange (Abbildung 2), das stimmt gut mit der Zielgröße von 150 Nukleotiden, die notwendig ist für eine effiziente Diffusion durch dicke Gewebe21. Fixierung-Bedingungen, die Morphologie der große Drosophila Eizelle erhalten, sondern ermöglichen auch Sonde eindringen sind unerlässlich. Wir haben unsere bisher verwendeten Fixierung Methode23 verändert, indem Sie eine Lösung, die auf 37 ° c vorgewärmt Raumtemperatur Heptan hinzufügen Wir halten es für möglich, dass sowohl die Zugabe von Heptan, Eindringen durch die Dotterhäutchen Membran sowie die Absenktemperatur für Fixierung zu erhöhen, erfolgreiche Fixierung Bedingungen zur Visualisierung der Arm Zusammenhalt beigetragen.
Wenn für den vorzeitigen Verlust der Kohäsion prüfen, benötigt man eine Stichprobe, die Quantifizierung der Mängel ermöglicht, die anwesend sind bei niedrigen bis moderaten Niveau. Um große Zahlen von reifen Eizellen zu erhalten, haben andere Mixer Störung der adulten Weibchen gepaart mit 26,27Siebung verwendet. Hier beschreiben wir eine Methode zur hand sezieren Eierstöcke von 20-25 Frauen, mit manuelle Trennung des späten Stadium Eizellen durch pipettieren. Während die Mixer/Siebung-Methode auch mit diesem Protokoll arbeiten sollte, ist ein Vorteil der Hand Dissektion, dass ohne den siebenden Schritt Eizellen verbringen weniger Zeit im Puffer vor Fixierung, die die Chance der Anaphase abnimmt ich Beginn durch künstliche Ei Aktivierung. Darüber hinaus diese Methode erfordert weniger Frauen als Ausgangsmaterial, kleinere Mengen von Reagenzien verwendet, und hat einen einfacheren Workflow, der die Verarbeitung mehrerer Genotypen erleichtern.
Hand-Dissektion und manuelle Trennung von reifen Eizellen Chorion und Feuersbrunst Membran Entfernung Eizellen zu "Rollen" in ausreichender Menge vorsieht und führt in ca. 75-150 Eizellen am Ende der Hybridisierung wäscht. Ein Trick, um den Ertrag zu maximieren Metaphase ich verhaftet Eizellen jungfräuliche Weibchen in yeasted Fläschchen in Abwesenheit der Männer vor Dissektion25halten soll. Eizelle Rollen um Chorions und Dotterhäutchen Membranen entfernen muss mit einem sanften Hauch durchgeführt werden, um nicht zu zerstören Eizellen. Jedoch entfernen Chorions und Dotterhäutchen Membranen aus 100 % der Eizellen ist kein realistisches Ziel und übermäßige Rollen nur führt zu Verlust von Eizellen. Daher sollte jedem rollenden Zyklus gestoppt werden bei ca. 75-85 % der Eizellen fehlen Chorions und Dotterhäutchen Membranen.
Einschränkungen Trotz unseres Erfolges zu generieren und mit Arm Sonden überwachen den Zustand des Zusammenhalts in der reife Eizellen von Drosophila leidet das Verfahren noch Einschränkungen. Während wir nicht selten ein Signal für die Chromosomenregion Sonde zu erkennen, war das Arm-Sonde-Signal schwach oder nicht vorhanden in ca. 15-20 % der Eizellen, dass wir ein Image erstellt. Ein beitragender Faktor möglicherweise differenziellen Durchdringung des Prüfpunkts Pericentric Oligonukleotid (22-28 Nukleotide) im Vergleich zu den größeren Arm-Sonde (100-200 Nukleotide). Darüber hinaus ist die große repetitiven Sequenz von der Pericentric Sonde resultiert ein Signal, das heller ist als die für die Arm-Sonde erkannt. Die Ausrichtung der Eizelle und der Platzierung von meiotischen Chromosomen in der Eizelle sind auch eine Herausforderung beim abbilden. Obwohl die meiotischen Chromosomen relativ in der Nähe der Zelle Kortex sind, ist es unmöglich, die Ausrichtung der Eizelle zu steuern, bei der Montage auf das Deckglas. Daher in einigen Bruchteil der Eizellen, die meiotischen Chromosomen möglicherweise 100-200 µm aus dem Deckglas und die Signalstärke und Qualität kann negativ beeinflusst werden, wenn Sie versuchen, durch den Großteil der Eizelle Bild. Diese Einschränkungen bedeuten, dass die Anzahl der Eizellen enthalten in der abschließenden Quantitative Analyse deutlich geringer als die Anzahl der Eizellen, die in das Protokoll verarbeitet. Ermitteln des Status des Arm Zusammenhalt in 100 Eizellen wird höchstwahrscheinlich zwei unabhängige Vorbereitungen erfordern. Ein zusätzliche limitierender Faktor bei der Quantifizierung Zusammenhalt Mängel mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop ist der Zeitaufwand für eine typische Z-Serie (ca. 5 min), erfassen Wenn der erfasste Bereich auf 1.024 x 512 Pixel beschränkt ist. Dies bedeutet, dass der Vergleich des Zusammenhalts in Kontrolle und experimentelle Genotypen (100 Eizellen) ca. 16 h Bild Sammlungsuhrzeit erfordern wird.
Modifikationen und Fehlerbehebung Wir konnten den Zustand des Zusammenhalts der Arm mit einer Sonde, die das x-Chromosom bei zytologischen Position 6E-7 b19 erkennt. Eine Sonde, die an eine mehr distalen Position auf dem x-Chromosom hybridisiert kann zur Erkennung von dem Scheitern des Chiasma Wartung mehr wünschenswert. Darüber hinaus können andere Forscher Arm Zusammenhalt auf anderen Chromosomen analysieren möchten. Während wir nicht versucht haben, die Autosomen Sonde, zufolge die vorläufigen Daten eine Sonde, die die 2F - 3 C-Region des x-Chromosoms auch erkennt ein nachweisbares Signal führt. Jedoch kann basierend auf begrenzte vorläufige Daten, das Signal des Prüfpunkts 2F - 3 C weniger als die für die 6E-7 b-Sonde "kompakt" sein. Obwohl die Fische Signale fest und knackig für einige Eizelle Chromosomen sind, ist das Hybridisierung Signal auf den Chromosomen der anderen Eizellen wesentlich diffuser. Ob diese Unterschiede im Signal echte Unterschiede bei Chromosom Morphologie zwischen den beiden Standorten zytologischen widerspiegeln, Variabilität der Hybridisierung Effizienz der beiden Sonden oder nur stochastische Variabilität zwischen verschiedenen Eizellen wird erfordern Sie eine tiefer gehende Analyse.
Wichtig ist, auch für die 6E-7 b-Sonde, beobachteten wir eine diffuse chromosomale Signal in einige Eizellen, und dies erforderte häufig ihren Ausschluss aus der Analyse. Darüber hinaus wir unterschiedliche Signalqualität und Helligkeit zwischen verschiedenen Zubereitungen der 6E-7 b-Sonde bemerkt haben und dies erforderte, dass Bildgebung Parameter entsprechend angepasst werden. Die Hybridisierung bis 42 ° C Temperaturerhöhung nicht reduzieren die Anzahl der Eizellen mit diffusen Signal, aber es das Signal für die Pericentric-Oligonukleotid-Sonde erheblich beeinträchtigen. In dem Bemühen, Chromosom Morphologie24besser zu bewahren wir auch versucht einen längeren Denaturierung Schritt bei einer niedrigeren Temperatur (80 ° C), aber festgestellt, dass diese Behandlung die Signalintensität erhöht weder die Anzahl der Eizellen mit diffusen reduziert chromosomale Fisch Signal. Auch versuchten wir mit 12 überlappenden BACs entspricht ein ca. 1,5 Mb-Intervall, das zytologische Region 5E-7 b überspannt ein heller Arm-Signal erhalten. Bei der Verwendung von einer 12 BAC-Sonde war der Grad der Variation Signalintensität sowie der Anteil der Eizellen Signal fehlt nichts anderes als wenn sechs BACs verwendet wurden, um die Arm-Sonde zu machen. Es war auch schwieriger, für Zusammenhalt Mängel zu erzielen, wenn die 12 BAC-Sonde zu verwenden, da die Fisch-Signale größer, so dass es schwieriger zu Flecken, die einzelnen Chromatiden entsprechend zu lösen waren. In Fällen, in denen kein Signal mit einer neu vorzubereitenden Sonde erhalten ist, Forscher sollten überprüfen Sie die Größe von der verstärkten und Einschränkung verdaut BAC DNA zu bestätigen, dass die Fragmente für Ende Kennzeichnung verwendet in erster Linie im Bereich 100-200 bp sind. Dies ist wahrscheinlich einer der wichtigsten Faktoren für erfolgreiche Sonde Vorbereitung.
Zukünftige Richtungen Zukünftige Arbeit, Bildaufnahme sowie die Anpassung des Protokolls um Immunostaining gehören zu verbessern wäre Hauptverbesserungen, die andere Forscher profitieren würden. Während Bildersammlung wäre sammeln eine größere Anzahl von Bildern in der axialen Dimension sowie schnellere Bildaufnahme zur Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel vorteilhaft. Bei der Optimierung der bildgebenden Parameter für die konfokale Laserscanning, fanden wir, dass 0,25 µm war die kleinste Schrittweite, die für die Z-Serie verwendet werden könnten, zur Vermeidung von nennenswerten bleichen des Fisches signalisiert. Jedoch für Fisch-Signale, die von weniger als 0,25 µm in der Z-Stapel getrennt sind, kann dieser Schrittgröße scheitern, den "Raum" zwischen die Herde zu erfassen und kann daher die Anzahl der Zusammenhalt Defekte unterschätzen. Die schnellere Bildgeschwindigkeit Erwerb einer drehenden Scheibe konfokale können kleinere Schrittweiten ohne Signal bleichen verwendet werden. Dies würde eine genauere Bildrekonstruktion in der axialen Dimension sowie ermöglichen größere Anzahl von Eizellen für Zusammenhalt Mängel analysiert werden. Darüber hinaus würde die Fähigkeit, mit Fisch-Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt Immunostaining kombinieren das Protokoll erheblich verbessern. Für eine Reihe von Vorbereitungen haben wir versucht, Spindel Immunostaining nach der Hybridisierung-Verfahren durchführen. Allerdings war die robuste Spindel Färbung sichtbar in nur ein Bruchteil der Eizellen. Darüber hinaus aus Gründen, die nicht klar sind, umgeben höhere Fisch Störsignale die meiotischen Chromosomen als Fisch und Immunostaining kombiniert wurden. Weitere Arbeiten zur Optimierung des Protokolls um Immunostaining entweder vor oder nach dem Fisch-Verfahren erlauben würde die Fähigkeit, diese Technik erheblich erweitern.

Angemessene Trennung der Chromosomen während der Mitose und Meiose erfordert, dass Schwester Chromatids Zusammenhalt werden eingerichtet, gepflegt und veröffentlicht in koordinierter Form1,2. Zusammenhalt ist in S Phase etabliert und wird durch die Cohesin komplexe, die physischen Verbindungen bildet, die die Schwester halten vermittelt Chromatiden zusammen. In Meiose, Zusammenhalt distal zu einer Überschneidung auch Funktionen zum rekombinanten homologe zusammen zu halten und diese körperliche Vereinigung gewährleistet korrekte Ausrichtung der Bivalent auf der Metaphase ich Spindel (Abbildung 1)3,4, 5. Freisetzung von Arm Zusammenhalt auf Anaphase ich ermöglicht die homologe zu den entgegengesetzten Polen der Spindel zu trennen. Jedoch wenn Arm Zusammenhalt ist verloren vorzeitig, rekombinante homologe verlieren ihre physische Verbindung und zufällig, zu trennen, was aneuploiden Keimzellen (Abbildung 1) führen kann.
In der menschlichen Eizellen Fehler im Chromosom Trennung sind die häufigste Ursache für Fehlschläge und Geburtsschäden, wie z. B. Down-Syndrom-6, und ihre Häufigkeit steigt exponentiell mit der mütterlichen Alter7. Schwester Chromatids Zusammenhalt entsteht in der fetalen Eizellen und meiotischen Rekombination erfolgt vor der Geburt. Eizellen dann verhaften in Mitte Prophase ich bis zum Eisprung und während dieser Festnahme, die weiterhin körperliche Vereinigung der rekombinanten homologe setzt auf Schwester Chromatids Zusammenhalt. Daher genaue Trennung während der Meiose und normale Schwangerschaft Ergebnisse erfordern, dass Zusammenhalt für bis zu fünf Jahrzehnte intakt bleiben.
Vorzeitiger Verlust der Zusammenhalt während der verlängerten meiotische Festnahme von menschlichen Eizellen zu der mütterlichen Alter Wirkung beitragen soll und mehrere Textzeilen Beweise unterstützen diese Hypothese8,9. Jedoch angesichts der Herausforderungen des Studiums meiotische Zusammenhalt in der menschlichen Eizellen, viel von unserem Verständnis für dieses Phänomen beruht auf der Verwendung von Modell Organismen5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila Melanogaster Eizellen bieten zahlreiche Vorteile für die Studie der meiotischen Zusammenhalt und Chromosom Segregation. Eine einfache genetische Test erlaubt es, Nachkommen von aneuploiden Keimzellen erholen und messen die Treue des X-Chromosom Segregation auf einer großen Skala11,16,17. Darüber hinaus kann man auch bestimmen, ob Chromosom Abtrennung Fehler entstehen, weil rekombinante homologe missegregate während der Meiose I, einem Phänotyp, der vorzeitige Verlust der Arm Zusammenhalt11,18, entspricht 19. direkte Beobachtung des Bundesstaates meiotische Zusammenhalt in Drosophila Eizellen ist auch möglich mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH). Obwohl fluoreszierende Oligonukleotiden, die sich wiederholende Sat-Sequenzen hybridisieren wurden für mehr als ein Jahrzehnt zur Chromosomenregion Zusammenhalt in Reife Drosophila Eizellen4,20, Analyse der Arm überwachen Zusammenhalt ist viel schwieriger gewesen. Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt erfordert eine Sonde, die ein großes Gebiet der Urschrift umfasst Sequenzen und ist hell genug, um sichtbare Signale für einzelne Schwester Chromatiden entstehen, wenn Arm Zusammenhalt fehlt. Darüber hinaus müssen die Eizelle Fixierung Bedingungen und Größe der beschrifteten DNA eindringen21 in der großen Reifen Drosophila Eizelle (200 µm Breite von 500 µm lang) erleichtern. Vor kurzem wurde eine Arm-Sonde erfolgreich genutzt, Drosophila Eizelle Chromatiden während Anaphase zu visualisieren, ich, aber die Autoren erklärt, dass sie nicht ein Signal im prometaphase erkennen könnte oder Metaphase ich verhaftet Eizellen22. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Generation von X-Chromosom Arm FISH-Sonden und Eizelle Herstellungsbedingungen, die uns für den vorzeitigen Verlust der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase assay ich und Metaphase erlaubt haben, ich Eizellen. Diese Techniken, die es uns ermöglicht haben, Genprodukte zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der meiotischen Zusammenhalt erforderlich sind, damit andere assay für Schwester Chromatids Zusammenhalt Mängel an Reifen Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Prep BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2</td>
			<td>Amplify BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21676</td>
			<td>Label BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals &#38; Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Prepare 10% stock 
			Freeze aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C75-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100&#181;g/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 &#176;C. Prepare 1 &#181;g/ml solution in 2X SSCT before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite</td>
			<td>Drierite Company</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td>Prepare 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP (10 &#181;mol, 100 &#181;l)</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>1277049</td>
			<td>Prepare 1 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>Prepare 250 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (molecular grade, 200 proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>18505</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>901393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>737-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H350-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438227</td>
			<td>Prepare 3 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.9 M Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>104-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#376; 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 &#376; 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (0.1mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S209-500</td>
			<td>Prepare 3M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1131</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28320</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC (Saline Sodium Citrate)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 300 mM sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X cacodylate fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1X Hybridization buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSBTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction buffer (PBSTx + Rnase)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 &#181;g/mL RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 20% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 40% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 50% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0137S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaeIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0108S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MseI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0167S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuCI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0636S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NEB buffer #2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/&#181;l</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>3333566001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT buffer</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology Tools etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#5 INOX, Biologie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#8221; Disposable glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td>Autoclave to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass dissecting dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well dish (3 wells)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7223-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-104</td>
			<td>Used to cover deep well dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted glass slides, 25 x 75 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48312-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong GOLD mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed-air in can</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at room temperature</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at 4 &#176;C</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven or incubator with rotator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSi laser scanning confoal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;l microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l PCR tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container with tight fitting lid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>To hold Drierite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>disposable wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC purified 5&#39;-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes

Beim Menschen sind Chromosom Abtrennung Fehler in Eizellen verantwortlich für die meisten Fehlschläge und Geburtsschäden. Außerdem ist, wie Frauen im Alter, ist ihr Risiko zu konzipieren, dass eine Aneuploidie Fötus drastisch erhöht und dieses Phänomen als mütterliches Alter-Effekt bekannt. Eine Voraussetzung für präzise Chromosom Trennung während der meiotischen Divisionen sind Wartung der Schwester Chromatids Zusammenhalt in der erweiterten Prophase-Zeit, die Eizellen zu erleben. Zytologische Nachweis bei Menschen und Modellorganismen zufolge meiotische Zusammenhalt während der Alterungsprozess verschlechtert sich. Darüber hinaus Segregation Fehler in der menschlichen Eizellen sind am häufigsten während der Meiose I, Einklang mit vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt. Die Verwendung von Modellorganismen ist entscheidend für die Entschlüsselung der Mechanismen, die altersabhängigen Verlust der Kohäsion zugrunde liegen. Drosophila Melanogaster bietet mehrere Vorteile für die Regulierung der meiotischen Zusammenhalt in Eizellen zu studieren. Allerdings waren bis vor kurzem nur genetische Tests zur Verfügung, um für den Verlust von Arm Zusammenhalt in Eizellen von unterschiedlichen Genotypen oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen bestimmen. Hier ist ein detailliertes Protokoll, unter der Voraussetzung für die Verwendung von Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) direkt zu visualisieren Mängel an Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen verhaftet. Erzeugen eine Fisch-Sonde, die am distalen Arm des x-Chromosoms hybridisiert und konfokale Z-Stapel zu sammeln, kann Forscher die Anzahl der einzelnen Fische Signale in drei Dimensionen zu visualisieren und festzustellen, ob Schwester Chromatids Arme sind getrennt. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, Arm Zusammenhalt Mängel in Hunderten von Drosophila Eizellen zu quantifizieren. Als solches stellt diese Methode ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die zum Zusammenhalt Wartung sowie die Faktoren, die zu seinem Untergang, während der Alterungsprozess führen beitragen.

Abbildung 5 zeigt Bilder, die mit einem Arm-Sonde, zytologische Region 6E-7 b auf dem x-Chromosom hybridisiert . Diese Testergebnisse in ein Signal, das gemeinsam mit der DAPI lokalisiert, unterscheidet sich leicht vom Hintergrund und wird bereits erfolgreich eingesetzt, Arm Zusammenhalt Mängel in verschiedenen Genotypen19zu quantifizieren. Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel beschränkt war, prometaphase ich und Metaphase ich inszeniert; Eizellen vor Kernhülle Ausfall wurden von Analyse19ausgeschlossen. Eine intakte Kernhülle wird deutlich, wenn in den DAPI-Kanal zu scannen, da die Chromosomen der Eizelle durch eine diskrete Kreisfläche umgeben sein, die dunkler als die umgebende Zytoplasma.
Abbildung 5 b zeigt maximale Intensität Projektionen der einzelnen Z-Serie nach Entfaltung und Kontrast Verbesserung. Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel erfordert für jede Sonde bestimmen, dass die Zahl der Fische, dass Überschneidungen mit dem DAPI-Signal signalisiert. Für eine solche Analyse ist die Visualisierung der zusammengeführten Bilder in drei Dimensionen unerlässlich. Nur Fisch Spots, die eindeutig im Zusammenhang mit DAPI-Signal in allen drei Dimensionen sollten in die Analyse einbezogen werden.
Intakte Schwester Chromatids Zusammenhalt zeigt sich als zwei Fisch-Spots für den Arm und Pericentric Sonden (Abbildung 5 b, links). Eizellen mit drei oder vier getrennten Fisch-Spots für jede Sonde gelten Zusammenhalt Mängel (Abbildung 5 b, rechts). Um einzelne Flecken eingestuft werden, müssen zwei FISH-Signale minimal in allen drei Dimensionen durch einen Abstand entsprechend dem Durchmesser der kleinsten Stelle getrennt werden. Dünne schwache Fäden verbinden zwei Fische Flecken sind keine Seltenheit. Solche Signale gelten nicht völlig getrennt und daher nicht als Instanzen des Zusammenhalts Defekte gezählt.
Mit der 6E-7 b Arm Hybridisierung Sonde war ca. 15-20 % der Eizellen abgebildet komplett fehlte Signal oder das Signal zu schwach, um selbstbewusst zu erzielen. Darüber hinaus etwa 5 % der Eizellen abgebildet ausgestellt einen großen Bereich der diffusen chromosomalen Signal und diese wurden aus der Analyse verworfen. Im Gegensatz dazu war es selten, Eizellen zu begegnen, für die das Pericentric-Hybridisierung-Signal fehlt oder ist zu diffus, um Gäste war.
Die 6E-7 b Arm Sonde wurde ausgiebig genutzt, um Arm Zusammenhalt Mängel im prometaphase zu quantifizieren und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen19. Wenn die Cohesin Untereinheit SMC3 während Mid Prophase, 16,3 % der die reifen Eizellen analysiert enthaltenen abgerissen wurde größer als zwei Spots, bezeichnend für vorzeitigen Verlust der Kohäsion Arm arm. Im Gegensatz dazu haben wir beobachtet abgetrennten Arm Flecken nur 5,1 % der Eizellen, die normalen Niveaus von SMC319enthalten. Interessant ist, obwohl die Häufigkeit der Arm Zusammenhalt Mängel wurde in mehreren Knockdown Genotypen, Schwester, die Chromatiden selten in den Pericentric Regionen19getrennt wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig1.jpg"> Abbildung 1: Altersabhängige Verlust der Kohäsion in der erweiterten Prophase ich verhaften der weibliche Meiose führen zu Fehlern im Chromosom Abtrennung und Aneuploidie im Ei. Zusammenhalt ist vertreten durch schwarze Balken zwischen den Schwester Chromatiden. Arm Zusammenhalt funktioniert um rekombinante homologe zusammenzuhalten und ist erforderlich für genaue Trennung bei Anaphase ich. Wenn Arm Zusammenhalt vorzeitig verloren geht, kann Chromosom Missegregation auftreten, was zu einer Aneuploidie Ei. Diese Zahl wurde von Referenz19angepasst. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig2.jpg"> Abbildung 2: Größe der DNA-Moleküle nach BAC Fragmentierung und Verstärkung (links) und nach Beschränkung Enzym Verdauung (rechts) für drei verschiedene BACs. 400 ng der amplifizierten DNA-Produkte sind in den ersten drei Gassen gezeigt. Die letzten drei Bahnen zeigen DNA-Fragmente nach der Nacht Beschränkungsauswahl. Die amplifizierten DNA-Produkte reichen von 200 bp bis zu 3 kb. Nach der Beschränkungsauswahl, die meisten Fragmente reichte von 100-200 bp, aber größere Fragmente (bis zu 500 bp) waren zu sehen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig3.jpg"> Abbildung 3: Zytologie Werkzeuge. Instrumente aus dem Protokoll: (1) paar Zangen (#5 Dumont); (2) Wolfram Nadel; (3) Tiefbrunnen Schüssel mit Deckel; (4) flachen Glas sezieren Gericht; (5) zog Pasteurpipette. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig4.jpg"> Abbildung 4. Anordnung und Bewegung der Folien für rollende Eizellen. (A) schematische Darstellung der Folie eingerichtet zum Walzen von Eizellen, wie im Protokoll beschrieben. Die dunklere Bereich kennzeichnet den Milchglas Teil der Folie. (B) Richtung der Bewegung Vektoren für Folie #2 während der Eizelle Rollen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig5.jpg"> Abbildung 5. Fisch Test Ergebnisse. (A) Schaltplan zeigt das x-Chromosom von Drosophila , wo die beiden Sonden (6 BACs) zu bewaffnen und hybridisieren, die 22 Oligonukleotid Chromosomenregion Sonde im Protokoll beschrieben. Der Einfachheit halber die 6E-7 b-Sonde 7 b gekennzeichnet ist und die 2F - 3C-Sonde trägt 3 C. (B) repräsentative Bilder von Fisch Ergebnisse (6E-7 b-Sonde) für intakte Arm Zusammenhalt (zwei Arm-Sonde Flecken, einer pro Homolog) und den gestörten Arm Zusammenhalt (drei bis vier Arm-Sonde Flecken). DNA ist blau, das Arm-Sonde-Signal ist gelb und die Pericentric Sonde Signal ist rot. Bilder entsprechen höchster Intensität Projektionen der Z-Serie nach Entfaltung und Kontrast Verbesserung. Maßstabsleiste = 2 µm. Diese Zahl wurde von Referenz19angepasst. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes at JoVE.com

Verwendung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FISH zur Überwachung des Zustands der Armkohäsion in Prometaphase- und Metaphase-I-Drosophila-Oozyten | Entwicklung | Biologie | Video

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K Aufrufe.  Dartmouth College. Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Serie: Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...