Bu eser Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC keşif Grant) ve Savoy Vakfı tarafından desteklenmiştir. OC NSERC bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak)
<ol><li>Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktası aşağı serin (0-4 ° C). Not: Bir düşük sodyum kesme çözüm (ACSF-Sükroz) kullanımı akut dilimleri26yüzeysel katmanları nöronlarda canlılığı korunmasına yardımcı olur.</li>
	<li>0.75 mL kırmızı bir fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren yama çözeltisi hazırlamak ve yeşil sentetik kalsiyum göstergesi (örneğin, Oregon yeşil BAPTA-1; bkz: Tablo 1). Biocytin dahil (bkz. Tablo 1) yama-çözüm post hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre gerekiyorsa.</li>
	<li>Osmolalite 280 ± 5 mOsm çözümü ve pH 7.35 ± 0.5 için ayarlayın. Çözüm her zaman buzdolabında veya buz üzerinde tutun. Not: Seçim kalsiyum göstergesinin dinamik menzili ve incelenen Ca2 + olayların niteliğine esas.</li>
	<li>Micropipette çektirme kullanarak, borosilikat cam kılcal damarlar ( Tablo malzemelerigörmek) dan yama Pipetler ≈ 2 µm bahşiş (3-5 MΩ pipet direnç) ve borosilikat teta-cam kılcal damarlar (bakınız tablo, gelen stimülasyon Pipetler ile hazır olun Malzemeler) 2-5 µm ipucu ile. Not: Pipetler belirli çapı ve şekil yapmak için çekici ayarı çektirme filaman türü ve rampa test sonuçlarını bir cam türü için tarafından belirlenecektir.</li>
</ol>2. Hipokampal dilim hazırlık
<ol><li>Fare anestezi (P13-20; zorlanma ve seks fare ele alınmaktadır deneysel soru tarafından belirlenir) bir inhalasyon narkoz odası içinde bir kağıt havlu üzerine yerleştirilen isoflurane 1 mL ile. Hayvan derinden, hareket ve yavaş solunum eksikliği kanıtlanan anestezi, narkoz odasından kaldırın ve bir Giyotin kullanarak başını kesmek.</li>
	<li>Kafatası kafatası arkasından makas burun için küçük bir çift ile deri kesim tarafından maruz. Mini kemik rongeurs küçük bir çift bregma düzeyde bir delik açmak için kullanın. Ardından makas sagittal dikiş boyunca Kaudal-için-rostral bir kesim yapmak için kullanın. Rongeurs ile her kafatası kapağı ve Asansör yukarı ve dışa doğru her hemisphere kapsayan kafatası kaldırmak için kavramak.</li>
	<li>Beyin tamamen maruz sonra görme sinirini küçük bir spatula ile kesme vuruşu. Beyin kafatasından kaldırmak ve sürekli oksijenli, soğuk ACSF Sükroz içeren bir Petri kabına koydum (sukroz konsantrasyon için bkz: Tablo 1 ).<ol>
<li>Büyük fareler dokudan gereklidir, İntrakardiyak bir perfüzyon kaliteli dilimleri elde etmek için önce beyin çıkarımı buz gibi ACSF Sükroz 20 mL ile dolu bir şırınga (25 G) kullanarak gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hipokampal dilimleri--dan hulâsa hayvan beyin hazırlayın.<ol>
<li>Bir filtre kağıt parçası üzerinde buz dolu bir Petri kabına yerleştirin, filtre kağıdı üzerine beyin transfer beyin chill yaklaşık 2 dakika süreyle izin. İki hemisferlerin incelemek.</li>
		<li>Disseke hemisferlerin (yönlendirmeyi koronal, enine veya yatay dilimler elde etmek için deneysel hedefi tarafından belirlenir) bir vibratome tablo tutkal ve buz gibi oksijenli ACSF Sükroz ile dolu vibratome tepsisine bırakın. 300-µm vibratome soğutucu kullanarak veya vibratome tepsi çevresinde buz yerleştirerek kalın dilim yaklaşık 1 ° C sıcaklıkta olun.</li>
		<li>Düz boya fırça kullanarak, 37 ° C'ye ısıtılmış oksijenli ACSF kurtarma içeren banyo hippocampus (6 dilim başına yarıküre) içeren dilimleri birikir</li>
		<li>Dilimleri için en az 45 dk. ACSF-kurtarma banyoda bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları
<ol><li>Amaç altında konumlandırılmış bir banyoda yerde Hipokampal bir dilim ayarla (büyütme: 40 x, sayısal Diyafram: 0,8) lazer tarama iki fotonlu mikroskop. Sürekli banyo oksijenli ACSF-normal 2.5-3 mL/dk hızında 30-32 ° C'de ısıtılmış sıvı.</li>
	<li>Kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) veya Dodt-SGC mikroskobu bir hücre boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgi bulmak için kullanın. Not: hedeflenen nöron nüfus bağlı olarak bir transgenik fare modeli kolayca ilgi hücreleri bulmak için kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı Floresan ışık kaynağı kullanımı ile yedek olabilir.</li>
	<li>Stimülasyon pipet kırmızı fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren bir ACSF-Normal çözüm ile doldurun.</li>
	<li>(Bir elektriksel stimülasyon birimine bağlı) stimülasyon pipet faiz hücre olarak aynı bölgede yolgösterendir üstüne dilim ayarlayın.</li>
	<li>Böylece ucu doğrudan ilgi hücre yama pipet yama çözüm ile doldurma ve bir kafa Sahne Alanı'na eklemeyi sonra dilim üzerinde ayarlayın.</li>
	<li>Bir şırınga üçlü stopcock sığacak ve yama-pipet plastik tüp yoluyla bağlayın. Sürekli pozitif basınç yama pipet enjekte (≈ 0.1 mL) kullanarak. Stopcock "Kapat" konumda tutun.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü etkinleştirmek ve "VC" butonuna basarak gerilim tipi kelepçe moduna geçin. Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı (örneğin, clampex) Elektrofizyolojik sinyalleri edinmesinin açın ve o sürekli olarak izlemek gerekli olan bir kare gerilim darbe (5 mV, 10 ms), göndermek için "Membran Test" simgesine tıklayın pipet direnç değişiklikler.</li>
	<li>Hedef hücrenin sağ üstteki kadar yama pipet indirin. Yapımı üzerine hücre membran ile iletişim, "açık" pozisyona stopcock kapatarak baskıyı kaldırmak. Not: Hücre zarı ile temas küçük bir artış zaman pipet direnç olarak algılanır (≈ 0,2 MΩ) görülür ve hücre üzerinde küçük bir girinti pozitif basınç tarafından neden olur.</li>
	<li>Hafif bir negatif basınç yazılım tarafından sağlanan pipet direnç 1 GΩ ulaşıncaya kadar stopcock monte boş bir Ģırınga kullanarak düzeltme eki pipet uygulanır. Veri toplama yazılımı 'Membran Test' penceresinde hücre -60, kelepçe mV.</li>
	<li>Hücre açılır ve hücre içi tüm yapılandırma elde kadar negatif basınç uygulayarak devam edin. Bu hücre durum tespiti (gelen 1 GΩ için 70-500 MΩ interneuron türüne bağlı olarak) pipet direnç ve büyük kapasitif geçişler 'Membran Test' penceresindeki görünümünü ani değişiklik üzerine kuruludur.</li>
</ol>4. İki fotonlu Ca2 + görüntüleme
<ol><li>Eksitatör postsinaptik yanıtlarında ilgilenen varsa, GABAA reseptör engelleyici gabazine (10 µM) ve GABAB reseptör engelleyici CGP55845 ekleyin (2 µM) ACSF banyoda.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü, "CC" butonuna basarak geçerli-kelepçe için yama yapılandırma kümesi ve yanıt olarak geçerli depolarize somatik enjeksiyonları hücrenin ateş deseni kaydetmek (0.8-1.0 nA, 1 s). En az 30 dk yama çözümde mevcut göstergeler ile doldurulacak hücre için bekleyin. Not: Hücrenin alt türü tanımlamak için hücre ateş desen ve etkin özellikleri kullanılabilir; örneğin, hücreleri hızlı yükseliyor. Kayıt ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için) kediler başlamadan önce Difüzyon yoluyla stabilize etmek için gösterge konsantrasyon için önemlidir.</li>
	<li>AP uyarılmış kediler<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak görüntüleri alma başlatın. Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun. Görünür bir yanıt sağlamak için AP backpropagation verimliliğini önemli ölçüde mesafe GABAergic interneurons22ile düşebilir gibi proksimal dendrite (≤ 50 µm) öncelikle, seçin.</li>
		<li>'Dikdörtgen Aracı' görüntü alma yazılımı kullanarak hedeflenen bölgesine yakınlaştırmak ve geçiş "xt" (Lınescan) modu. Pozisyon karşısında faiz dendritik Şubesi tarama. Lazer yoğunluğu denetleyicileriyle edinme yazılımında İki fotonlu lazer temel yeşil Floresans fototoksisite önlemek için sadece biraz görünür nerede en az güç düzeyinde ayarlayın.</li>
		<li>Elektrofizyoloji veri toplama yazılım 'Protokol' pencere ve görüntü alma yazılımı, istenen süre istenen genlik somatik bir geçerli enjeksiyon içeren bir kayıt deneme oluşturun.<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak, "kaydı Başlat" düğmesini tıklatın ve floresan sürekli olarak 1-2 s. tekrarı için resim alma 3 - 10 kez elde etmek. Bekle en az 30 s duyarlilik önlemek için tek taramalar arasında. Linescans bir dendrite boyunca birden çok noktalarda alınıyor, onları sipariş etkilerinden korunmak için rasgele sırada almak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically uyarılmış kediler<ol>
<li>Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun.</li>
		<li>Stimülasyon pipet faiz dendrite yukarıda dilim yüzeyinde ayarlayın. Yavaş yavaş stimülasyon pipet yerine, tüm hücreli yapılandırma rahatsız edici önlemek için hareket en aza indirin. 10-15 µm dendrite üzerinden, pipet getirin.</li>
		<li>Görüntü alma yazılımı sinaptik microdomains aspiny dendrites konumunu görmek için geçin 'xt' (Lınescan) modu ve hat boyunca faiz dendritik dalı konumlandırın.</li>
		<li>'Protokol' penceresi (Toplam Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı) ve görüntü alma yazılımı, stimülasyon birimi deneme başladıktan sonra tetikleyen bir kayıt deneme oluşturun.</li>
		<li>Satın alma yazılımı kullanarak 30 bekleyen 3 - 5 kat, 1-2 s. tekrar Alım için sürekli dendrite boyunca taramak için "kaydı Başlat" düğmesine tıklatın s duyarlilik önlemek için taramalar arasında. Not: Tarama uzunluğu uyarılmış etkinliğin Kinetik bağlı olarak ayarlanabilir, ancak duyarlilik önlemek için indirilmelidir ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için).</li>
		<li>4.5.5 farklı koşullarda (örneğin, farklı yoğunluk/uzunluğu stimülasyon, giriş bir farmakolojik engelleyici, vb) bağlı olarak ele alınıyor sorularınıza arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Hücre sağlığı bozulan belirtileri gösterdiğinde satın durdurmak: -45 aşağıda depolarizasyon mV, temel Ca2 + düzeyi, dendrites (örneğin, blebbing, parçalanma; bkz: Tablo 2 morfolojik bozulma artış sorun giderme için).</li>
		<li>Hücre morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipet konumunu kaydını tutmak için bir yığın Z -kırmızı kanalı hücreye alması. Satın alma yazılımı kullanarak 'xyz' modu, tüm işlemler dahil tüm hücreyi görüntüye yığın üst ve alt sınırları ayarlayın. 'Adım boyutu' 1 µm ayarla ve "Start kayıt" düğmesini kullanarak yığın alma işlemini başlatın.</li>
		<li>Ne zaman Z-yığın alma tamamlandığında, tüm odak planları yığının üst üste ve alım kalitesini doğrulamak için yazılımda "Maksimum projeksiyon" seçeneğini kullanın. Sonra yavaş yavaş dışarı dilim yama pipet geri çek.</li>
		<li>Post hoc morfolojik tanımlama için dilim düzeltmek için hızlı bir şekilde dilimi bir düz boya fırça kullanarak banyodan kaldırın ve arasında iki filtreyi bildiri, ACSF dolu bir Petri kabına yerleştirin. ACSF % 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm ile değiştirin ve 4 ° C oda veya buzdolabı bulaşık gece bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immünhistokimya Post Hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre için
Not: PFA fiksasyonu 1 geceden sonra dilimi fosfat tampon (PB) sodyum azid (%0,5) ile ilâ 1 ay depolanabilir.
<ol><li>Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik çözüm (TBS) Triton X-100 (% 0.3) ile dilim koyun ve 4 yıkama (5-10 dk her) gerçekleştirin.</li>
	<li>TBS-Triton içinde dilimi koymak % 0,3 ile % 10 normal keçi serum (NGS) 1 h için.</li>
	<li>Dilimi koymak TBS-Triton içinde % 0,3 ile % 1 NGS bir Streptavidin Birleşik fluorophore (örneğin, Alexa Fluor 546 Birleşik Streptavidin, 1: 200) için kuluçka gecede.</li>
	<li>4 yıkama TBS. içinde kez (5-10 dk)</li>
	<li>Dilimleri mikroskop slaytlar ve görüntü confocal mikroskop kullanarak bağlayın. Tam hücre yeniden sağlamak için bir Zelde-yığın (adım boyutu: 1 µm) 20 x amacı istimal. Alexa-546-Birleşik bir etiket görüntüleme için kullanım 543 nm lazer ve 515-560 nm algılama filtre ayarlayın.</li>
</ol>6. kedi analizi
<ol><li>Kırmızı ve yeşil kanallardan Lınescan görüntülerde faiz (ROIs) bölgelerinden Floresans verileri ayıklar ve gürültüyü azaltmak her koşul için birden fazla yinelenen değerlerin ortalamasını. Not: Lınescan Alım dendrite gerçekleştirildiğinde, dendritik microdomains (2-5 µm) karşılık, birden çok ROIs veri ayıklamak mümkün olduğunu ve böylece Ca2 + sinyal Bölünebilme çalışma izin.</li>
	<li>Her yatırım Getirisi için Ca2 + genlik değişimler hızlı: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Not: Burada G yeşil kanaldan; Floresans değerdir G0 temel floresan yeşil kanal öncesi stimülasyon döneminde değerdir; R kırmızı kanal18floresan değerdir. İki fotonlu uyarma son derece lokalize ve önemli bir arka plan oluşturmaz, arka plan Floresans çıkarma gerekli değildir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.

Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitimi için iki fotonlu Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca2 + çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde girişleri entegre ve soma ile iletişim kurmak için mükemmel bir araç yapar. Ancak deneme süresi göz önüne alındığında, özellikle dikkat hücre sağlık için böylece dendrites duyarlilik önlemek için düşsel lazer güç kullanımını sınırlama tarafından ödenmesi gerekiyor. Bu aynı zamanda yakınlaştırma düzeyini azaltmak, tarama süresi azalan ve artan inceden inceye gözden geçirmek hız resim alma sırasında elde edilebilir. İnterneuron dendrites görüntüleme ek zorluklar tanıttı. Dendrites bu hücreler yok dikenleri gibi dendrite tarama postsinaptik Ca2 + microdomains lokalizasyonu kolaylaştırmak için önerilir. Buna ek olarak, bir yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi göz önüne alındığında, daha küçük ve daha yavaş--dan o piramit hücreleri dendrites içinde oluşturulan Ca2 + yükselmeler interneuron dendrites içinde. Bu Ca2 + sinyal Kinetik uygun şekilde açıklamak için bireysel linescans yeterince uzun bir süre yanı sıra ortalama için birkaç Lınescan görüntüleri elde etme gerektirir.
İki kutuplu teta-cam elektrot kullanarak yerel elektrik stimülasyonu dendritik postsinaptik Ca2 + microdomains karakterizasyonu için yararlı bir araç temsil eder. Ancak, hala farklı "en anpasan" aksonlar belirli bir bölgesinde bulunan etkinleştirebilir. Aktif girişleri sayısı bu durumda bilinmeyen ve sadece ek Hesaplama araçları kullanarak tahmin edilebilir. Aynı anda birden çok bireysel sinapslarda uyarılması için sağlayan iki fotonlu Glutamat uncaging27, yerel dendritik Ca2 + yanıt almak için iyi bir alternatif temsil eder. Bu yöntem eksitatör postsinaptik yapıları (dikenleri) açıkça tanımladığınız, asıl hücrelerinin çalışma için yaygın olarak kullanılan ancak iyi interneurons, hangi genel olarak düşük omurga yoğunluk var çalışma için uygun değil. İnterneuron dendrite boyunca uncaging Glutamat asıl hücrelerine uygulanan gibi kaçınılmaz etkinleştirmek9,10yorumlamak zorlaştırır, sinyal verme Ca2 + birden çok extrasynaptic mekanizmaları gözlemler.
Son on yılda iki fotonlu Ca2 + görüntüleme için geliştirilmiş zamansal çözünürlük optik teknolojileri gelişmeler teklif etti. En umut verici acousto optik yansıtıcılar (AODs)28,29ile rasgele erişim mikroskobu (rampa) biridir. Tarama geleneksel raster rampa seçili makas-in ilgi yüksek frekansta atalet-Alerjik AODs hızlı hız yanında etkin tarar. Doğrusal bir desen koyulur Puan sınırlı olmadığından birden fazla dendritik dalları, eş zamanlı çalışma için idealdir. Ancak, AODs tarafından sunulan daha yüksek zamansal çözünürlük milisaniye aynı odak planı içinde yüzlerce süren Ca2 + olayları görüntüleme gereksiz olabilir. Ayrıca, Puan faiz aynı yapısı içinde tarama konum nedeniyle mikro-sürüklenir dilim müstahzarları iyi dilim kalitesi için gerekli olan yüksek perfüzyon oranı ile ilişkili denetimi için zor olabilir. Bu nedenle, bu makalede sunulan yüksek zamansal çözünürlük (500-700 Hz) Lınescan tabanlı Alım yöntemi Ca2 + sinyalleri bireysel dendritik dallarında Imaging hala tercih edilir.

Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum1' bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca2 + görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.
Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu2den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.
Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri3görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca2 + görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda4arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca2 + oldu, sağlam doku5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca2 + görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites5,6,7,8,9,10,11' sinyal Ca2 + .
Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü'nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca2 + yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal12 açık ve nispeten genel Ca2 + geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri13' te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca2 +harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca2 +-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs6,14,15. Son olarak, belirli koşullar11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca2 + olaylar oluşturulabilir.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca2 +-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca2 + dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca2 +-duyarsız boya ile yeşil Ca2 + göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca2 +-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca2 + görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca2 +], [Ca2 +]017 dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır , 18. Ayrıca, Floresans değişikliklerimutlak Ca 2 + konsantrasyonları19açısından kalibre edilmesi.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca2 + görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca2 + dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca2 + göstergeleri son derece mobil eksojen Ca2 + hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca2 + göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.
Biz iki fotonlu Ca2 + görüntüleme yöntemi Ca2 + dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 incelenmesi için uyarlanmış , 22. asıl nöronlarda erken Ca2 + görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri20 farklı olan fonksiyonel Ca2 + mekanizmaları çeşitli vitrin , 23 , 24. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca2 + geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca2 + daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca2 + dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.
Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

Kalsiyum (Ca2 +) görüntüleme intrasellüler Ca2 + sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA2 + dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca2 + sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca2 + arada yoluyla, yerel Ca2 + dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca2 + geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitim için uygulanır.

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, şekil 1Bmesafe bağımlı düşüş göstergesi) artan mesafe olarak backpropagating APs tarafından indüklenen kediler genliği bir düşüş görülmektedir. (Alexa Fluor 546 Streptavidin Birleşik kullanarak) immünhistokimya sonra biz biocytin hücre etiketleme almak ve kaydedilen nöron bistratified hücresi olarak stratum oriens ve stratum radiatum (şekil işgal bir akson ile tanımlamak başardık 1 C). ikinci denemede stimülasyon pipet distal dendritik siteye getirildi. Dendrite tarama, biz o zaman elektrik stimülasyon aksonlar geçiş yanıt olarak verilen dendritik dalında (şekil 2A-C) postsinaptik Ca2 + sinyal genliği değerlendirmek başardık. Postsinaptik kediler komşu dendritik microdomains (Bölüm 1-6; arasında farklılık Şekil 2B), hangi Ca2 + sinyal başlatma ve/veya farklı postsinaptik mekanizmaları dahil bölgeden yayılması ile ilişkili olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig1.jpg"> Resim 1: AP uyarılmış Ca2 + geçişler temsili örneği. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron (13 µm) yığını (20 µM). Beyaz çizgiler linescans uzunluğu ve konumunu gösterir. C.top izlemesinde gösterilen yerlerde elde edildi kediler gösterilen (B) izleri somatik geçerli enjeksiyonuyla deneme kayıt sırasında oluşturulan kısa AP tren gösterir. Zaman ölçeği üzerinde gösterilen tüm izlerini aynıdır. (C) maksimum projeksiyon confocal Z-biocytin hücre etiketleme gösterilen yığını. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56776/56776fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig2.jpg"> Resim 2: bir patlama elektriksel stimülasyon (100 Hz değerinde 3 uyaranlara) tarafından uyarılmış postsinaptik Ca2 + geçişler. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron gösterilen yığını (148 µm). Beyaz ok uçları aksonal Terminal interneuron bir sepet hücredir düşündüren piramit katman içinde gidin. Nerede stimülasyon elektrot yerleştirildi dendritik şube gösteren (B) tek odak düzlemi. Kesikli çizgi (C1 ve C2) gösterilen Lınescan konumunu gösterir. (C) görüntüleri (1; kırmızı bir Lınescan sonucunu gösteren Alexa-594; 20 µM) ve yeşil (2; Oregon yeşil Bapta-5N; 300 µM) kanalları. Görüntüleri Ca2 + geçişler (kediler) gösterilen 30 µm. (D) izleri C2 hücresindeki görüntülenen kesimleri içinde elde edildi yanıt yayılmasını analiz etmek için daha küçük bölümler halinde binned. En iyi izleme elektriksel stimülasyon somatik düzeyinde görüntüleme duruşma sırasında kaydedilen gerilim cevaben gösterir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56776/56776fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Çözüm</td>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Konsantrasyonu (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-Normal</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-kurtarma</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-sükroz</td>
			<td>KCl</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glikoz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sükroz</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">K+-yama çözüm tabanlı</td>
			<td>K+- glukonat</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphocreatin di (tris) tuz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP-Tris</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>GTP-Tris</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biocytin</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa-594</td>
			<td>0,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oregon yeşil-BAPTA-1</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: çözüm tarifleri. Bileşikler ve konsantrasyonları iletişim kuralı sırasında kullanılan çözümleri için.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sorun</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yapamaz-e doğru yama sağlıklı nöron</td>
			<td>Onay işaretleri dilimleri sağlıksız için: çekmiş veya şişmiş hücreleri, görünür hücre çekirdeği, vb. Eğer öyleyse, dilimleri atmak. Ayrıca yama-pipet direnç ve yama-çözümün osmolalite doğrulayın; değerleri uygun aralığında değilse bunların yerine.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrites sinyalini Floresans düşüktür</td>
			<td>Hücreyi doldurmak uzun bekleyin. Bir tıkanıklık hücreye Difüzyon yama-çözüm tutuyor yama-pipet negatif basınç az miktarda uygulamak deneyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektriksel stimülasyon Ca2 + yanıt evoking değil</td>
			<td>Bir eşya Elektrofizyolojik kayıt varlığı için kontrol edin. Eğer yok, onay için bir kısa-devre/uyarıcı birim arızası. Varsa, stimülasyon yoğunluğu artırmak veya stimülasyon pipet daha yakın dendrite için hareket. Stimülasyon elektrot ve dendrite arasındaki mesafe 8 um dendrites doğrudan depolarizasyon sinaptik yanıtları okurken önlemek için aşmaması gerektiğini kaydetti için olduğunu.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uyarılmış Ca2 + sinyal da yüksek/karışırlar Ca2 + göstergesi</td>
			<td>Lazer gücü düşür. Birden çok hücreyi sorun devam ederse, farklı bir göstergesi Ca2 + kullanın, ile bir alt Ca2 + ilgi.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temel Ca2 + sinyal deneme sırasında giderek artmaktadır</td>
			<td>Bireysel taramalar arasında daha uzun bir süre bekleyin. Temel artıyor, durdurmak satın alma; Bu hücrenin sağlık büyük olasılıkla kötüleştiğini gösterir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taramalar sırasında Ca2 + sinyal genliği azalır</td>
			<td>Lazer güç azaltmak veya (varsa) vınlamak dışarı.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrite ("blebbing") taramadan sonra parçalanan</td>
			<td>Lazer gücü düşür yakınlaştırabilir veya uzaklaştırabilirsiniz. Blebbing için hedeflenen dendrite sınırlı ise, başka bir dendrite seçin ve lazer gücü azaltmak / vınlamak dışarı. Birden çok dendrites blebbing varsa, satın alma durdurmak.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Floresan sinyallerini "tarama haddimi piyango sonra geliyor"</td>
			<td>Dilimi hareketinde ACSF perfüzyon hızını azaltarak azaltın. Önce yama, yapmak emin dilimi güçlü bir ağ tarafından yerinde sabittir.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: tablo sorun giderme. Deney Imaging bir Ca2 + sırasında ortaya çıkabilecek ilgili genel sorunların çözümleri.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Görüntüleme.  Université Laval. Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Nörobilim

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...