この作品は、健康の研究のカナダの協会、自然科学工学研究協議会 (レベル検出グラント)、サヴォイ財団によって支えられました。OC は、レベルから博士フェローシップによって支えられました。

動物保護委員会のラヴァル大学とカナダ評議会は、動物愛護の家畜福祉ガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. 事前準備 (オプション: 1 日を前もって準備)
<ol><li>人工髄液 (アプライド) ソリューション (各ノーマル、ショ糖と復旧ソリューション、1 L;テーブル 1を参照) の 3 種類を準備します。300 ± 10 mOsm25に溶液の浸透圧を調整し、氷点下に近いポイントにアプライド ショ糖をクール (0-4 ° C)。 注: 低ナトリウム切削ソリューション (アプライド ショ糖) の使用は、急性スライス26の表面的な層のニューロンの生存を保持できます。</li>
	<li>赤蛍光体 (例えば、Alexa 594) を含む修正プログラム ソリューションの 0.75 ml と緑の合成カルシウム インジケーター (例えば、オレゴン グリーンこれら 1;テーブル 1を参照)。Biocytin は、(表 1参照) 修正プログラム ソリューションの記録された細胞の形態学的同定をアドホックの記事が必要な場合に。</li>
	<li>280 ± 5 mOsm の解決策と pH 7.35 ± 0.5 の浸透圧を調整します。すべての回で冷蔵庫や氷の上のソリューションを保持します。 注: ダイナミック レンジと調査 Ca2 +イベントの性質は、カルシウム インジケーターの選択を前提する必要があります。</li>
	<li>≈ 2 μ m チップ (3-5 MΩ のピペット抵抗) と刺激ピペット ホウケイ酸シータ ガラス管 (のテーブルを参照からパッチ ピペット ホウケイ酸ガラス管 (材料の表を参照してください) からマイクロ ピペットの引き手を使用して、準備します。材料) 2-5 μ m の先端で。 注: 引き手フィラメント タイプとガラスの特定の種類のテスト結果がランプによって特定の直径と形状のピペットの引き手設定が異なります。</li>
</ol>2. 海馬スライス標本
<ol><li>マウスの麻酔 (P13 20; ひずみとマウスのセックスは対処されて実験的質問によって決まりますが) 1 ml のイソフルレン吸入麻酔室内紙タオルの上に置かれました。動物は麻酔深く動き、遅い呼吸の欠如によって証明されるよう、麻酔室からそれを削除し、ギロチンを使用しての首をはねます。</li>
	<li>鼻に頭蓋の後部からはさみの小さなペアで皮膚を切断することによって頭蓋骨を公開します。前レベルで穴を作るためのミニ骨 rongeurs の小さなペアを使用します。尾側吻側矢状縫合線に沿ってカットするはさみを使用しています。Rongeurs 各半球を覆う頭蓋骨を削除する各頭蓋骨フラップ、エレベーター方向および水平方向の背面を把握します。</li>
	<li>脳が完全に公開されている後は、小さいヘラを使って視神経を弱めます。頭蓋骨から脳を外し、酸素、冷たいアプライド ショ糖を含む継続的にシャーレに入れて (ショ糖濃度は表 1を参照)。<ol>
<li>古いマウスから組織が必要な場合は、脳抽出の前に冷えたアプライド ショ糖の 20 ml シリンジ (25 G) を使用して質の良いスライスを取得する心腔内灌流を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>抽出した動物の脳から海馬スライスを準備します。<ol>
<li>約 2 分氷でいっぱいのシャーレに濾紙片を配置、フィルター紙の上に脳を転送のための脳チルをしましょう。2 つの半球を解剖します。</li>
		<li>Vibratome テーブルの上に (方向、コロナ、横、または水平方向のスライスを取得する実験の目標によって決まります) 切り裂かれた半球を接着し、冷えた酸素アプライド ショ糖で満たされた vibratome トレイに没頭します。Vibratome クーラーを使用してまたは vibratome トレイの周りの氷を置くことによって 300 μ m 約 1 ° C の温度で厚さのスライスを作る。</li>
		<li>37 ° C に加熱酸素アプライド回復を含むバースの海馬 (半球あたり最大 6 スライス) が含まれているスライスを蓄積フラット ペイント ブラシを使用して、</li>
		<li>少なくとも 45 分アプライド回復風呂にスライスを残します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
<ol><li>目的の下に風呂の場所で海馬スライスの設定 (倍率: 40 倍、開口数: 0.8) 二光子励起レーザ走査顕微鏡の。継続的にお風呂を灌流、酸素アプライド通常 2.5 〜 3 mL/分の速度で 30-32 ° C で加熱します。</li>
	<li>赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) または Dodt SGC 顕微鏡を使用して、そのサイズ、形状、および位置を使用して興味のセルを探します。 注: 対象となるニューロンの人口に応じてトランスジェニック マウス モデルは興味のセルを簡単に検索する使用できます。この場合、この手順は、蛍光光源の使用と代替可能します。</li>
	<li>(例えば、Alexa 594) 赤の蛍光体を含むアプライド標準溶液で刺激ピペットを入力します。</li>
	<li>先端が興味のセルと同じ地域にあるので、スライスの上に (電気刺激装置に接続) 刺激ピペットを設定します。</li>
	<li>修正プログラム ソリューションとパッチ ピペットを充填し、ヘッド ステージに貼り付けて後、興味のセルのすぐ上の先端は、スライスを設定します。</li>
	<li>三方活栓のシリンジの収まるし、プラスチック製のチューブを介してパッチ ピペットに接続します。パッチ ピペットに一定の陽圧を注入 (≈ 0.1 mL) 注射器を使用しています。活栓を「閉じる」位置にしてください。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールをアクティブにし、「VC」ボタンをクリックしてして電圧クランプ モードに切り替えます。電気生理学的信号の取得の電気生理学データ集録ソフトウェア (例えばclampex) を開き、それを継続的に監視する必要のある正方形電圧パルス (5 mV、10 ms) を送信して「膜テスト」アイコンをクリックピペット抵抗の変化。</li>
	<li>対象のセルの右上までパッチ ピペットを下げます。作る時に細胞膜との接触、活栓を「開く」の位置に回すことによって、圧力を削除します。 注: 細胞膜との接触が検出されるときピペット抵抗わずかな増加 (≒ 0.2 MΩ) が、セルに小さなくぼみが肯定的な圧力によって引き起こされます。</li>
	<li>ピペット抵抗のソフトウェアによって提供される 1 GΩ に達するまで、コックに装着空の注射器を使用してパッチ ピペットにわずかな否定的な圧力を適用されます。データ集録ソフトウェアの ' 膜テスト ウィンドウでクランプ-60 でセル mV。</li>
	<li>セルを開けて全体セル構成を達成するまで否定的な圧力を適用することを続行します。このセルの状態の検出は (介在ニューロンの種類に応じて 70 500 MΩ に 1 GΩ) からピペット抵抗と ' 膜テスト ウィンドウで大きな静電容量過渡の外観の急激な変化に基づいています。</li>
</ol>4. 二光子励起 Ca2 +イメージング
<ol><li>興奮性のシナプス応答に興味がある場合、GABAAの受容体ブロッカー gabazine (10 μ M) と GABAB受容体拮抗薬 CGP55845 追加 (2 μ M) アプライドお風呂に。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールの「CC」ボタンをクリックしてして現在のクランプにパッチを設定および脱分極電流体注射に応答細胞の発火パターンを記録 (0.8 〜 1.0 nA, 1 s)。修正プログラム ソリューションのインジケーターを格納するセルの少なくとも 30 分を待ちます。 注: セルの発火パターンとアクティブなプロパティ使用できます。 セルのサブタイプを識別するために例えば細胞の高速スパイクします。レコード猫 (トラブルシューティングの表 2を参照) を始める前に拡散を安定させるために指標濃度が重要です。</li>
	<li>AP 誘発猫<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用して画像を取得を開始します。赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。表示される応答を確保するため、AP 誤差逆伝搬効率が大幅低下する gaba 作動性介在ニューロン22で距離をまず、近位樹状突起 (≤ 50 μ m) を選択します。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの「長方形ツール」を使用して、対象となる領域拡大し、を切り替える、「xt" (ライン スキャン) モード。目的の樹状突起の分岐間でスキャンの位置。集録ソフトウェアのレーザー強度コント ローラー、2 光子レーザー ベースライン緑蛍光は光毒性を避けるために、少しだけ目に見える最小の電力レベルで設定します。</li>
		<li>電気生理学データ集録ソフトウェア プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェアで必要な振幅の体細胞電流注入を含む希望の期間の記録試みを作成します。<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用すると、「記録開始」ボタンをクリックし、、3-10 回 1-2 s. 繰り返し継続的に蛍光画像の取得を取得。光損傷を避けるために単一スキャンの間待機、少なくとも 30 秒。デンドライトの複数のポイントでエネルギーを集録する場合は、順序効果を避けるためにランダムな順序でそれらを取る。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>シナプス誘発猫<ol>
<li>赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。</li>
		<li>興味の樹状突起上のスライスの表面に刺激ピペットを設定します。刺激ピペットは全体構成を脅かさないよう動きを最小限に抑え、所定の位置にゆっくりと下ろします。位置、樹状突起から 10-15 μ m でピペット。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの aspiny の樹状突起でシナプス ミクロ相分離構造の場所を視覚化するに切り替えて、'xt' (ライン スキャン) モードに沿って目的の樹状突起分岐線の位置。</li>
		<li>(電気生理学データ集録ソフトウェア) の [プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェア試用開始後刺激ユニットをトリガー記録試用版を作成します。</li>
		<li>30 を待っている 3-5 回、1-2 s. リピート獲得のために継続的に樹状突起に沿ってスキャンする「記録開始」ボタンをクリックして取得ソフトウェアを使用して光損傷を防ぐためにスキャンの間 s。 注: スキャンの長さは、誘発イベントの速度によって調整することができますが、光損傷を防ぐために最小限に抑える必要があります (トラブルシューティングの表 2を参照)。</li>
		<li>さまざまな条件 (例えば刺激の強度/長さが異なる、薬理学的ブロッカー等の導入) で取り上げられている特定の質問に応じて、4.5.5 手順を繰り返します。</li>
		<li>集録を停止するとき、セルは、健康悪化の兆候を示しています:-45 下脱分極 mV、ベースライン (例えばブレブ、断片化; 参照表 2は樹状突起の形態学的劣化の Ca2 +レベルの増加トラブルシューティング)。</li>
		<li>細胞の形態に関する予備的な情報を入手して刺激ピペットの場所の記録を保持するには、赤のチャンネルにセルのz-スタックを取得します。取得ソフトウェアを使用して 'xyz'モードが含まれているすべてのプロセスとセル全体を画像に上下スタック制限を設定します。1 μ m で 'のステップのサイズを設定し、「記録開始」ボタンを使用してスタック取得を開始します。</li>
		<li>ときZ-スタックの取得が完了したら、ソフトウェアの「最大投射」オプションを使用して、スタックのすべての焦点の計画を重ね合わせるし、、買収の品質を確認します。その後、スライスからパッチ ピペットをゆっくりと上げます。</li>
		<li>アドホックの記事の形態学的同定のためのスライスを修正するには、すぐにフラット ペイント ブラシを使用して風呂からスライスを削除し、アプライドで満たされたシャーレ内の 2 つのフィルター ペーパー間に配置。4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、アプライドに置き換える、4 ° C の部屋や冷蔵庫では、料理を一晩置いておきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.ポストアド ホック記録された細胞の形態学的同定のための免疫組織化学
注: PFA の固定 1 泊後スライスに格納できるリン酸バッファー (PB) アジ化ナトリウム (0.5%) と 1 ヶ月。
<ol><li>トリス緩衝生理食塩水液 (TBS) トリトン X-100 (0.3%) とのスライスを入れて、4 洗浄 (5-10 分ごと) を実行します。</li>
	<li>TBS トリトンのスライスを入れて 1 時間 10% ヤギ血清 (NGS) の 0.3%。</li>
	<li>0.3 %tbs トリトンのスライスを入れて 1% により、NGS とストレプトアビジン共役のため蛍光 (例えば、Alexa Fluor 546 共役ストレプトアビジン、1: 200) 一晩培養します。</li>
	<li>4 を洗う時間 TBS で (5-10 分)</li>
	<li>顕微鏡のスライドと共焦点顕微鏡を用いたイメージ スライスをマウントします。完全な細胞再構成をしてZを取得-スタック (ステップ サイズ: 1 μ m) 20 × 対物を使用します。Alexa-546 共役ラベルをイメージング、543 nm レーザーと 515 560 nm 検出フィルターの使用を設定します。</li>
</ol>6. 猫の解析
<ol><li>赤と緑のチャンネルからライン スキャン画像に関心 (ROIs) の地域から蛍光値を抽出し、ノイズを低減する条件ごとに複数の繰り返しの値の平均します。 注: 樹状突起上ライン スキャン取得が実行されると、それは樹枝状ミクロ相分離構造 (2-5 μ m) に対応して可能性があります、複数 Roi からデータを抽出することが可能と Ca2 +シグナル区画の研究。</li>
	<li>各 roi として Ca2 +振幅の変化を表します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 注: ここで G はグリーン チャンネルから蛍光値G0はグリーン チャンネルからベースライン蛍光値で前刺激期間中R は赤のチャンネル18から蛍光値です。2 光子励起は非常にローカライズされた重要な背景を生成しません、背景の蛍光性の加減は必要ありません。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。

ここに示すメソッドでは、勉強して樹状 Ca2 +急性脳スライスにおける神経樹状突起におけるシグナル伝達のための 2 光子励起 Ca2 +イメージングとパッチ ・ クランプ電気生理学の組み合わせの使用方法を示します。このメソッドは両方ローカル Ca2 +標高樹枝状のセグメントと細胞の体細胞応答に電気刺激や逆伝搬 AP により誘発されるを監視することができます。樹状?...

ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース1で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca2 +イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。
複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡2から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも希薄(3) 生成や毒性また焦点平面に制限されます。したがって、従来の共焦点顕微鏡と比較すると 2 光子システムの高コストは、にもかかわらず、2PLSM 太い生体組織における神経細胞の構造と機能の高解像度の調査のための選択の方法のまま。
散乱体内の 2PLSM の最初のアプリケーションは、樹状突起スパイン3の機能と構造のイメージをだった。Ca2 +イメージングとの組み合わせで 2PLSM として分離された生化学的なコンパートメントで棘関数を明らかにしました。以来、さまざまな神経棘と個々 のシナプス4の間の一対一の対応がある、二光子励起 Ca2 +イメージングすぐになった便利なツールそのまま組織5、個々 のシナプスの活動報告 6,7,8。さらに、2PLSM ベースの Ca2 +イメージングがうまく使われた単一カルシウム チャネルおよび組み込みとシナプスのコンダクタンスの非線形相互作用の活動を監視するし、状態とアクティビティに依存を評価するにはCa2 +シグナル神経樹状突起5,6,7,8,9,10,11の規則。
ユビキタス細胞内二次メッセンジャーであり、その細胞内の時空間的構成イオンの調節するシナプス強度の変化からの生理学的反応の方向を決定するカルシウム チャネル、デンドライトと背骨の成長としてなく、細胞死、生存。複数経路の活性化を介して樹状 Ca2 +上昇が発生します。活動電位 (Ap)、樹状突起を逆伝搬は、電位依存性カルシウム チャネル12を開き、樹状突起と棘13で比較的大域的な Ca2 +トランジェント (猫) を生成します。シナプス伝達はシナプス後 Ca2 +活性化に関連付けられて-透水性受容体 (NMDA、Ca2 +-透水性 AMPA とカイニン酸)、6、14,15猫シナプスのトリガーします。最後に、特定の条件11,12,13,16の下で樹状突起で超直線性 Ca2 +イベントを生成できます。
パッチ ・ クランプ記録との組み合わせで二光子励起 Ca2 +イメージングを採用しています合成 Ca2 +-通常は全細胞記録中にパッチ電極経由で配信される機密の蛍光インジケーター.Ca2 +動態の定量化のための標準的な方法は、デュアル表示法17,18に基づいています。よく分離発光スペクトルと 2 つの同時を使用して (例えば、赤い Ca2 +の組み合わせ-緑の Ca2 +インジケーター オレゴン グリーンこれら 1、蛍光色 4 などと区別しない染料) に比べていくつかの利点があり、単一指示薬法。最初に、Ca2 +-に依存しない染料を使用、Ca2 +イメージングを実行する (樹枝状の枝、棘) 興味の小さい構造を検索します。第二に、緑と赤の蛍光 (ΔG/R) の変化比が大きく変動する [Ca2 +]017ベースライン蛍光の変化に敏感である [Ca2 +]、メジャーとして計算されます。,18します。 さらに、蛍光変化は絶対 Ca 2 +濃度19面でキャリブレーションできます。
急性スライスで二光子励起 Ca2 +イメージング実験を実行する場合の一般的な心配は細胞の健康と高レーザー出力の通常使用による画像取得の安定性。さらに、Ca2 +イメージング実験である摂動法と細胞内 Ca2 +動態の実質的な過大評価懸念 Ca2 +インジケーターとして高度なモバイル外因性 Ca2 +という事実のためにバッファー。したがって、Ca2 +インジケーターとその濃度の選択は、神経型、猫の予想される振幅と実験の質問によって異なります。
我々 は樹状突起における gaba 作動性介在ニューロン9,10、11,20,21 Ca2 +変動の調査の 2 光子励起 Ca2 +イメージング法を適応,22. 抑制介在ショーケース多種多様な錐体細胞20のそれらとは異なる機能性の Ca2 +メカニズムの初期 Ca2 +イメージング研究の大部分は、主ニューロンで行われた中、,23,24. これらの介在ニューロン固有のメカニズム (例えばCa2 +透過性 AMPA 受容体) は、細胞活性の調節に特定の役割を果たすことがあります。二光子励起 Ca2 +イメージングでこれらの細胞の樹状突起が薄く直径樹状突起と棘の欠如から、追加の課題を提示樹状 Ca2 +シグナル介在ニューロンは詳しい調査のための魅力的なターゲットが、特に内因性 Ca2 +結合能力が高い。私たち研究の海馬介在の研究の焦点、次のプロトコル間異なる神経細胞の集団に適用したこれらの課題に対処する適応
このプロトコルは、2 つの外部の非 descanned 探知機 (NDDs)、電気光学変調器 (EOM) とグラデーション コントラスト (SGC) をスキャン Dodt を装備され、光学テーブルにインストールされて商業共焦点 2 光子顕微鏡、実行されました。顕微鏡 800 モード同期チタンサファイアレーザー多光子と結合されていました (> 3 W、140 の fs パルス、80 Hz の繰り返し率) の nm。イメージング システムは、温度制御、2 つのマニピュレーターを持つ翻訳プラットフォーム、コンピューター制御電極アンプ、デジタイザー、刺激と灌流チェンバを含む標準的な電気生理学のリグが装備されていた単位、およびデータ集録ソフトウェア。

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

カルシウム (Ca2 +) 画像は、神経樹状突起における細胞内 Ca2 +シグナルの時空間ダイナミクスを調べるための強力なツールです。Ca2 +変動は様々 な膜と細胞内メカニズムを介して発生するでき、樹状の興奮性のシナプス可塑性の誘導と制御に重要な役割を果たします。したがって、樹状突起の分岐で Ca2 +シグナルの種類を記録する機能は樹状突起が情報を統合する方法を研究するグループの貴重です。2 光子顕微鏡の出現は、症状や光散乱などの生体の画像に固有の問題を解くことによって、このような研究を大幅に簡略化は。また、2 光子 Ca2 +イメージングと従来の電気生理学的手法の組み合わせによるローカル Ca2 +変動録音と並行して神経細胞の樹状突起でのシナプスを調査することが可能です。相馬。ここでは、gaba 作動性抑制性介在神経細胞の樹状突起にローカル Ca2 +トランジェント (猫) のダイナミクスを研究するこのメソッドを使用する方法について述べる。メソッドは、樹状 Ca2 +急性脳スライスに異なる神経型シグナルの勉強にも適用できます。

ここで提示されたプロトコルを使用して、体の電流注入によると海馬の CA1 野オリエンス/alveus 介在ニューロンの樹状突起に電気刺激による誘発猫を得られます。複数のポイントで近位樹状突起全体エネルギーを培ってニューロンは、特定のパッチの形状と位置に基づく後で相馬 (図 1 a) から距離が与えられます。相馬の増加 (減少の AP 振幅また?...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K ビュー.  Université Laval. 全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。

ビデオ: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

神経科学

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

生物学

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

行動学

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

ニューロンのカルシウムイメージング法

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

二光子

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニックマウス

ニューロンのカルシウムイメージング法

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

二光子

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

ニューロンのカルシウムイメージング法

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニックマウス