Erika Taylor bu el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser S.B.D. Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01 HL098053, P01 AG033561 ve R01 HL054732) R.B. için bir doktora sonrası araştırma ek (R01 HL085481) ve arkadaş grubu (AAUW) hibe ve S.B.D. Amerikan Kalp Derneği'nden hibe tarafından finanse edildi ve R.T.B.

1. protokol besleme HFD <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> Tablo 1. Sinek yemek tarifi. 
Bu tablo farklı malzemeler bizim kontrolümüz yemek hazırlamak için kullanılan özetler. Bir kez, gıda 10 mL tüpler dökülür, soğutmalı ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de depolanan.
<ol><li>HFD hazırlık <ol><li>1 kg yüksek yağ yemek yapmak için önceden yapılmış normal sinek gıda 700 g tartmak (bkz. Tablo 1) ve 300 gr Hindistan cevizi yağı içine bir analitik denge kullanarak iki ayrı kapsayıcı.</li>
		<li>Mikrodalga, tek tek her kapta Isı içeriği tamamen eriyecek kadar. Hindistan cevizi yağı sinek gıda konteyner içine dökün. Kadar petrol de sinek gıda içine karışık bir çırpma teli kullanarak karıştırın. 
		Not: Gıda veya yağ yok parçalarını görünür olmalıdır. Sinek gıda mikrodalga eriyor, gıda mix ve üzerinde kaynar önlemek için 1 dk aralıklarla durdurur.</li>
		<li>Yüksek yağ yemek yeniden tartın. Toplam ağırlığı 1 kg az (700 g gıda + 300 gr Hindistan cevizi yağı), su (yaklaşık 10 mL) telafi etmek için Isıtma sırasında buharlaşma ve ağırlık için 1 kg. geri getirmek için ekleyin</li>
		<li>Pour yaklaşık 10 mL iyi karışık şişe (şişe hacmi yaklaşık % 25) başına yüksek yağ gıda. Ardından, sinekler önlemek için tülbent ile kapak &#39; kirlenme. Oda sıcaklığında 1 h için serin sonra 4 ° c için depolama tüpleri için 4 hafta transfer. 
		Not: Normal gıda (NF) bir denetim gıda olarak kullanılır. Aynı zamanda şişe başına 10 mL (yaklaşık % 25 flakon biriminin) NF dökün. HFD yemek için NF gıda % 30'u Hindistan cevizi yağı ile değiştirin. Denetim ve deneysel koşullar için sinekler NF ve HFD (gıda şişe başına 10 mL) aynı miktarda verildi.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Resim 1 . Drosophila içinde besleme HFD. 
Düzeni farklı beslenme adımları sinekler için bir denetim gıda (Hindistan cevizi yağı-NF ilavesi olmadan normal bir diyet) veya HFD (Hindistan cevizi yağı ilavesi ile) gösterir. Tüm süreç yetişkin sinekler ilk koleksiyonu sonra 10 gün sürer. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"> <li>HFD D. melanogaster besleme Not: Denetim gıda ve herhangi bir sinek çizgi ile uyumlu olan yordamlar besleme HFD bu iletişim kuralını içerir. Denetim ve deneysel sinekler aynı miktarda gıda (NF veya HFD) içeren şişeleri konur.
	<ol><li>Sinekler anestezi için Kullanım CO 2. 
		Not: acemi için okuma referans lütfen 21 yetiştirme ve D. melanogaster işleme genel bir bakış için.</li>
		<li>Toplamak 0-5 gün eski sinekler şişeleri ve transfer (çevirme tarafından) sinekler NF (oda sıcaklığında daha önce ısındı) içeren yeni tüpleri içine. Sinekler yaş 21 5 ek gün izin ° C.</li>
		<li>HFD ve NF 4'ten içeren şişeleri 5 günün sonunda çıkarmak ° C. 
		Soğuk sıcaklıklarda yaşam sinekler, stres gibi Not: kullanmadan önce ısınmak için oda sıcaklığında 30 dakika oturmak şişeleri izin.</li>
		<li>Mendil kullanarak, temiz ve aşırı sıvı şişeleri taraftan kaldırmak.</li>
		<li>Hakkında filtre kağıdı, küçük bir parça eklemek 1 cm x 3 cm, herhangi bir fazla sıvı emmek için yüksek yağ gıda içine. 
		Not: Bu sinekler HFD gıda yapışmasını önlemek için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Sonra yüksek yağ yemek üzerine sinekler (saygısız) aktarın. Şişeleri (kalkmadığım) yatay olarak onların tarafında, 21-22 ° c 5 gün yattı. 
		Not: Bu kısmen yüksek yağ yemek, gıda ve ölmek için sopa sinek neden erime olabilir gibi yüksek sıcaklıklarda kaçının.</li>
		<li>Sonra 5 günü, devir (saygısız) NF ve HFD uçar bağırsaklarını 30 dk için boş için izin vermek için gıda olmadan yeni tüpleri içine. Ardından, Sineklerin ağırlığında için devam. 
		Not: Bu HFD Protokolü besleme önemli adımlardan biri iyi karışık bir HFD, herhangi bir sinek gıda veya yoğun yağ parçalarını ücretsiz hazırlamaktır. Homojen karıştırma ve 45-30 ° c HFD soğutma tavsiye edilir, tüpleri dökme ve 4 ° C. uygun yaşta Gıda Depolama önce denetim ve deneysel sinekler eşleşen kontrollü beslenme ve çevre koşulları önceden yanı sıra önemlidir HFD besleme için. Besleme aşamasında kontrol ve deneysel sinekler NF ve HFD aynı miktarda verilmelidir. Hiç sinek kalabalık tüpleri veya şişe (transgenerational etkilerinden korunmak için) toplamak. Her zaman en fazla 25 sinekler NF ve diyet kısıtlaması veya diğer crowding etkileri önlemek için besleme HFD sırasında şişe koydu. HFD % 30 Hindistan cevizi yağı oluşur, böylece 22 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kısmen yağlı yiyecek ve die sopa sinek neden HFD, eriyebilir. HFD üzerinde sinekler koymadan önce herhangi bir kalıntı petrol kaldırmak ve herhangi bir aşırı sıvı gıda emmek için bir filtre kağıdı eklemek için şişeleri temizle. HFD üzerinde sinekler kuluçka sırasında tüpleri üzerinde sinekler için yağsız yatay bir yüzey sağlamak için yan yana koyulur.</li>
	</ol></li> <li>Sineklerin ağırlığında <ol><li>her genotip ve test edilmesi için cinsiyet için önceden etiketli, boş 1.7 mL tüpler ağırlıkları kaydetmek için Ultra-duyarlı bir ölçek kullanın.</li>
		<li>Anestezi ve aynı genotip, cinsiyet, 36 sinekler toplamak sinek anestezi veya CO 2, kullanma ve bir fırça ile durum içine bir besleme önceden 1.7 mL tüp tartılır.</li>
		<li>Aynı Ultra-duyarlı ölçek sinekli içeren tüp tartmak.</li>
		<li>Belirlemek bu formül takip ortalama sinek ağırlığı: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Not: Bu protokol sinekli 36 sayısıdır.</li>
		<li>Flash 2 dk. toplamak için sıvı azot içine dalan tarafından sinekler içeren 1.7 mL tüpler donma ve tüpler kutulara koyun. Sonra kutuları etiketi tahlil ile kullanmak kadar depolama için-80 ° C (tercih sıcaklık) transfer. 
		Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı nitrojen var. Lütfen uygun kişisel koruyucu giysiler kullanın.</li>
	</ol></li></ol> 2. ETİKET tahlil <ol><li>Etiket standart konsantrasyonları hazırlanması <ol><li>500 mL PBT hazırlamak (PBS 1 X, % 0.05 Triton).</li>
		<li>Kullanma 0.5 mL tüpler ve etiket çözüm (Tablo malzemeler), hazırlamak boş (sadece PBT) 100 µL ve altı standart etiket konsantrasyonları (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 100 µL 0,125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) ile PBT.</li>
		<li>Tüpler Buza koyun ve sinekler taşlama ile devam edin.</li>
	</ol></li> <li>Sinekler taşlama <ol><li>-80 ° c (Adım 1.3) dondurulmuş sinekler çıkar. Buz üzerinde sinekler içeren tüpler transfer</li>
		<li>İlk olarak, yer 2 mm metal topları bir 96-iyi top dispanser taşlama, ek toplar kaldırmak için küçük bir fırça kullanın.</li>
		<li>96-şey taşlama yeri plaka topu dağıtıcı ve flip metal topları doğrudan taşlama plaka aktarmak için üstüne baş aşağı. Orada-meli var olmak iyi başına bir top.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak PBT 600 µL 96-şey taşlama plaka her satır eklemek.</li>
		<li>3 şey uçar Forseps ile ekleyin. Her satır/iyi 96-şey taşlama plaka sinekli genotip, cinsiyet ve gıda durumunu.</li>
		<li>Sıkıca kapaklar 96-şey taşlama plaka üzerine yerleştirin. Teyp hiçbir sızıntı olması için üstte yer yerleştirilebilir.</li>
		<li>Düzgün 96-şey taşlama tabaklar taşlama makinesi yerleştirin. En yüksek hız ve basın için set machine &#34; çalıştırmak &#34; 3 dakika süreyle sinekler öğütmek için</li>
		<li>Sonra 3 dk, taşlama durdurmak ve plaka Santrifüjü ile devam edin: centrifu4000 x g, 4 ° c de 15 dakika Ge Santrifüjü sonra dikkatle süpernatant ile Pelet karıştırma önlemek için bileme plaka yönetmek.</li>
	</ol></li> <li>Örnek yükleme ve etiket içerik kararlılık <ol><li>yeni bir 96-şey Spektrofotometre tabak al. Bir çok kanallı pipet ile plaka her satır etiket reaktif 200 µL yüklenmesi.</li>
		<li>PBT yükü 20 µL bir boşluk oluşturmak için ilk satırın ilk kuyunun içine. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		İlk satır ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix <li>yükü 20 µL kalan içine her standart seyreltme (Kimden adım 2.1.2), kuyu. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak transfer süpernatant ile 20 µL taşlama plaka her satırdan 96-şey Spektrofotometre plaka karşılık gelen satırda. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Sonra 96-şey plaka üzerinde gaz geçirgen bir folyo yerleştirin.</li>
		<li>Kuluçkaya plaka 10 dk. 37 ° C'de 
		Not: wells kabarcıklar eğer vasıl tüm kabarcıklar kaldırmak için 2.000 x g 2 dk plaka santrifüj kapasitesi. Kabarcıklar varlığı ile Absorbans okuma karışmamasıdır.</li>
		<li>Okunur her şey 550, plaka Absorbans nm bir uyumlu Mikroplaka okuyucu kullanarak. Daha sonra standart eğri takip edip bilinmeyen örnekleri [µg/µL] konsantrasyonu belirlemek.</li>
		<li>Etiketinin içeriği başına ortalama sinek ağırlık miktarını belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Not: Bu protokol için 3 sinekler PBT 600 µL içinde kıyılmış; ortalama sinek başı 200 µL birimdir.</li>
	</ol></li> <li>Bradford tahlil ve normalleştirme etiket içerik protein içeriği ile <ol><li>yedi hazırlamak sığır serum albumin (BSA) standart dilutions 100 µL (75 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1000 µg/mL) ile PBT.</li>
		<li>Yeni bir 96-şey plaka almak ve 1 X Bradford reaktif 200 µL plaka her satır yük.</li>
		<li>İlk satırının ilk kuyuda bir boşluk oluşturmak için PBT 10 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		İlk satır ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix <li>kalan içine her standart seyreltme eklemek 10 µL kuyu. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak transfer süpernatant sinek 10 µL taşlama plaka her satırdan karşılık gelen satırda 96-şey plaka içine. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet. Kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>96-şey plaka üzerinde gaz geçirgen bir folyo yerleştirin.</li>
		<li>Plaka, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells kabarcıklar varsa, bunları kaldırmak için 2.000 x g de 2 dk plaka santrifüj kapasitesi. 
		Not: Kabarcıklar varlığı ile Absorbans okuma karışmamasıdır.</li>
		<li>Kullanım Spektrofotometre okuma boş Absorbans, standartları ve bilinmeyen örnekleri, 595 nm. Her satırda örnekleri [µg/µL] konsantrasyonları belirlemek için standart eğri kullanın.</li>
		<li>Normalize etiketi aşağıdaki formülü kullanarak protein seviyesi ile içerik: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013.">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li><li>Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015)</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates.">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways.">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li><li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila.">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene.">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38 (2013).</li><li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li><li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila.">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li><li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila.">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li><li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila.">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling.">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li><li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila.">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li><li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease:+an+epidemiological+approach.">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li><li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation.">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li><li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li><li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila.">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li><li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dietary+fat+in+obesity.">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li><li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes.">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li><li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation.">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li><li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila.">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587 (2012).</li><li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+class+III+obesity+(BMI+of+40-59+kg/m2)+and+mortality:+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies.">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673 (2014).</li><li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL.">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li><li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis.">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li><li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy.">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Obezite indüksiyon farelerde ay19,20alabilir. Sinekli, aşırı yağ birikimi bir kaç gün veya daha az, (bkz: Şekil 2) sadece 18 s sonra yağ birikimi artar neden indüksiyon Protokolü besleme bu HFD sağlar. Açıklanan protokolü ile besleme HFD glikoz içerik 12 artırır ve Bmm lipaz ve PGC-1 ifade24azaltır. Bu yağ ve şekeri içeriği25,26 ve artan Bmm ifade24hızlı bir düşüş neden olan yetişkin Drosophila Orucun aksine. Ayrıca, Bmm veya PGC-1 düzeyleri yükselen obezite HFD kaynaklı14,24karşı korur. %30 HFD % 3, %7 veya % 15 yağ sinekli besleme bu protokol için kullanılmış olan bir doz bağımlı indüklenen obezite diyet yaparken HFD (şekil 3) besleme süresi artan olduğu gibi12, moda. Ayrıca Hindistan cevizi yağı, Yani, % 14 laurik asit veya % 5 miristik asit ana bileşenlerinin tek yağ asitleri besleme, nedenleri önemli ölçüde yağ birikimi12yüksek bulduk.
Bu sinekler bulunan bir HFD rejimi ile hızlandırılmış metabolik yanıt memeliler28gözlemlediği gibi sınırlı ömrü27 ile ilişkilidir ama &#62; %80 "Sineklerin Tanrısı" hayatta HFD2720 gün geçmiş. Yağ birikimi hızlı indüksiyon lipid kontrol korunmuş hücresel ve moleküler işlemler tarafından aracılık ve glukoz metabolizma şeker hastası veya lipotoxic kardiyomiyopati10gibi birçok obezite ile ilgili çalışmalar için avantajlıdır, 12,13,14,15,16. Anahtar bulgular sonuçları metabolik dengesizlikler ve ilgili kardiyak işlev bozuklukları olarak büyük olasılıkla karşılaştırmalı translasyonel çalışmalar insanlarda sağlayacaktır.
İletişim kuralı besleme HFD kullanım için benzer diyetler D. melanogasterile paylaşan diğer Drosophila türler ve böcekler modelleri ile uyumludur. İletişim kuralları besleme bu HFD organizma C. elegans ya da farklı 'normal' Gıda medya gerektiren diğer böcekler gibi uygun bir şekilde uyum sağlamış. % 30 HFD için uygun değildir yüksek sıcaklık gerektiren deneme kullanın; Ancak, Hindistan cevizi yağı veya tek yağ asitleri düşük konsantrasyonlarda yeterli alternatifler12olacaktır.
Bu etiket Protokolü PBS üzerinde dayanır, kolay kullanım ve deneme olmadan duman hood, daha önce aksine sağlar bir toksik olmayan arabellek organik çözücüler (metanol/kloroform veya Dietil eter) lipid çıkarma ve miktar15 içinde kullanılır. , 29 , 30. bu arabelleği bir diğer avantajı bu protein içerik şişman belirlenmesi küçük doku örneklerinde organ çalışmaya kolayca ulaşılabilir ve sunan yeni fırsatlar yapmak aynı ilk homogenate üzerinde temel etiket düzeylere normalleştirmek olduğunu çapraz-organizma metabolik homeostazı hadis. Ayrıca, paralel glikoz ve glikojen deneyleri, lipid ve glukoz metabolizması aynı biyolojik örneklerinden değişiklikleri çalışma izin gerçekleştirmek için aynı ilk sinek homogenate zımpara sonra elde edilen kullanılabilir. Bu etiket iletişim kuralı daha az zahmetli veya daha önceki iletişim kuralları15,29,30zaman alıcı ve oldukça yüksek hızlı yakın 100 örnek için test sağlayan bir 96-şey biçimi kullanılarak üretilen iş, bir saat içinde. Bu iletişim kuralı da yağ içeriği yüksek şeker diyeti13,31, diyet kısıtlaması ve açlık, dahil olmak üzere diğer diyet koşullar altında yanı sıra yaş ilişkili değişiklikleri anlamak yaşlanma Etütler ölçmek için kullanılabilir yağ metabolizmasında.
Obezite, metabolik sendrom ve ilgili patolojiler bir tüm zamanların en yüksek insan sağlığı1,2yıkıcı sonuçlara ile altındadır. Kombine HFD Protokolü ve yüksek işlem hacmi hızla obezite ve genetik faktörler, ekran ikna etmek için model organizmalar, Drosophilagibi kullanmak için benzersiz bir platform tahlil teklif etiketi veya doğal ve sentetik kimyasal bileşikler, daha iyi anlamak metabolik dengesizlik. Sonuçta bu yeni tedaviler veya tedavileri metabolik hastalıklar için geliştirmek için bilimsel keşifler ilerlemesi katkı.

Biz bir zaman obezite ve onun ilişkili ekonomik güçlükler, nerede bir dünya çapında sorun1vardır. İki her üç Amerikalı dışında fazla kilolu ya da obez ilgili kalp patolojiler, ölüm2yetişkin nüfus içinde birincil nedeni ile vardır. Yeni verimli yöntemleri yeterince metabolik sendrom model organizmalar kullanarak yönetmelikte karıştığı genetik ve moleküler bileşenleri araştırmaya ihtiyaç vardır. 3,4,5,6fareler ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerin ile en temel biyolojik süreçlerin hisse çünkü bu nedenle, biz meyve sineği Drosophila modeli seçin. Drosophila' ın genom son derece korunmuş evrim sırasında ama genel olarak çok daha küçük daha az gen ikilenmesi ve metabolik karmaşıklığı, birçok insan hastalıkları4 ' te karıştığı temel mekanizmaları anlamak için idealdir , 7 , 8. Ayrıca, karakteristik süreçleri yağ dokusu, gut tarafından yürütülen ve pankreas sinek içinde gösterilir ve insanlar9' a, benzer olan düzenleyici işlevleri glikoz ve lipid metabolizması, örneğin, aracılık 10,11. Ayrıca, temel moleküler yolları obezite, insülin direnci ve insanlarda diyabet kontrol dahil işlevsel olarak Drosophila melanogaster12,13,14 ' te konservasyonu , 15 , 16. daha yüksek organizmalar gibi Drosophila geliştirme sırasında memeli kalp3,17' e benzer işlemler tarafından kurulmuş bir kalbi vardır. Böylece, besleme protokolü ve yüksek işlem hacmi etiket tahlil, Drosophila, genetik araç kutusunu kullanarak verimli tarama amaçlı adapte güvenilir bir HFD gelişimi sağlayan çalışma ve temel genetik temeli anlamak için önemli bir araç temel karmaşık metabolik hastalıklar.
HFD yemek ile Hindistan cevizi yağı, çoğunlukla doymuş yağ asitlerinin metabolik sendrom18ile ilişkili olduğu bilinen oluşan takıma bir standart laboratuvar sinek yemek yapılır. Obezite gibi kemirgenler, memeli modellerinde inducing, ay19,20alırken, bizim en iyi duruma getirilmiş HFD Protokolü besleme Drosophila içinde etkili ve tekrarlanarak birkaç içinde organizma yağ içeriği artar gün12,14. Bu iletişim kuralı, bir yüksek işlem hacmi etiket tahlil ile birlikte genetik faktörler, çevresel etkilere ve yağ metabolizmasının yeni modülatörler keşfetmek için ilaç adaylarının etkileri için verimli kitle tarama sağlar. Sonuç olarak, bu protokoller olasılığı anlamak ve/veya insan patolojiler obezite ile ilişkili ve obezite ile mücadele ilgili.
Besleme protokolü çok yönlü ve tek doymuş veya doymamış yağ asidi metabolik ve fonksiyonel etkilerini incelemek için uygulanabilir. Bu yüksek işlem hacmi etiket tahlil kullanımını D. melanogasteriçin sınırlı değildir, ancak küçük model organizmalar kütikül veya zor ekstraselüler matrisler (örneğin, diğer Drosophila türler, C. elegans ile çeşitli adapte ve diğer omurgasız canlılar gelişmekte olan) farklı çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ içeriği geliştirme, yetişkinlik veya metabolik hastalık aşaması herhangi bir aşamasında ölçmek için. ETİKET tahlil Renkölçer ölçüm etiketleri içine serbest yağ asitleri, gliserol, gliserol 3-fosfat ve sonunda H2O2 4-aminoantipirin (4-AAP) ve 3,5 - ile tepki veren aşağılamak enzimatik reaksiyonlar bir dizi dayanmaktadır dichloro-2-hydroxybenzene Sülfonat (96-şey Spektrofotometre ölçülür bir kırmızı renkli ürün üretmek için 3,5 DHBS).

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

Kalp hastalığı insan ölüm dünya çapında bir numaralı nedenidir. Çok sayıda çalışmalar insanlarda güçlü bağlantıları arasında obezite ve kalp arıza göstermiştir ama daha fazla araç ve araştırma çabalarını daha iyi mekanizmaları dahil aydınlatmak için ihtiyaç vardır. İçin bir yüzyılı aşkın süredir, Drosophila genetik olarak son derece uysal modelinin anahtar genlerin ve türler arasında son derece korunmuş kanıtladı moleküler yollar keşfi vesile olmuştur. Birçok biyolojik süreçlerin ve hastalık mekanizmaları işlevsel olarak geliştirme (örneğin, vücut planı, kalp), kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi anında korunmuş. Son zamanlarda, obezite ve model organizmalar, kalp hastalığı gibi ikincil patolojiler çalışma anahtar düzenleyiciler metabolik Sendromu insanlarda dahil tanımlama son derece kritik bir rol oynamıştır.
Burada, neden obezite, Yani, aşırı yağ birikimi ve yağ içeriği Etiketler birikimi şeklinde izlemek için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek için etkili bir araç olarak bu model organizma kullanmayı öneriyorum. Ek olarak son derece korunmuş, ancak daha az karmaşık genom, anında da hızlı deneme, maliyet-etkililik ile kombine için kısa bir ömrü vardır. Bu inceleme obezite ve yağ içeriği yüksek tekrarlanabilir olmak amacı ile ilişkili artış ölçmek için bir yüksek üretilen iş triacylglyceride (TAG) tahlil ikna etmek için Drosophila yüksek yağlı diyet (HFD) beslenme için detaylı bir protokol sağlar ve büyük ölçekli genetik veya kimyasal tarama için etkili. Bu protokoller verimli düzenleyici mekanizmaları obezite ilgili araştırmak, aynı zamanda ilaç bulma araştırma geliştirme ilaç adaylarının etkisinin hızlı test etmek için standart bir platform sağlamak için yeni fırsatlar sunmak veya Obezite, diyabet ve ilgili metabolik hastalıkları önleme.

D. melanogasteriçinde diğer türler ile olduğu gibi işte cinsel dimorfizm kadın ve erkek22arasında. İyi kadınlar daha büyük, onların abdomens daha fazla yağ daha erkek22ile bilinmektedir. Bizim iletişim kuralı etkinliğini test etmek için etiket deneyleri Etiketinin içeriği standart laboratuvar wildtype (w1118) kadınlar ve erkekler arasındaki farklılıkları uçar belirlemek için gerçekleştirilen. Kadın erkek meslektaşlarına (Şekil 2A, B) daha fazla tüm vücut yağ olması verileri göstermek. Verileri ayrıca tahlil etiketi miktar zaman içinde hiçbir varyasyon ile tutarlı olduğunu gösterdi (50 dakikaya kadar kuluçka sonra) ve hiçbir varyasyon biyolojik örnek boyutu (3 veya 5 sinekler) bağlı olarak.
HFD tüketimi obezite insan ve fare19,20,23neden olduğu gösterilmiştir. Bizim besleme protokolü etkinliğini test etmek için etiket deneyleri HFD ve dişi sinekler beslenen denetim ile gerçekleştirilen. Bulduk Drosophila HFD tüketimi giderek (şekil 3A-C) zamanla birikir artan yağ içeriği neden olur. Daha sadece 18 h (biz bu sinekler yağ içeriği önemli bir artış ikna edebildikşekil 3C), besleme HFD sonra bu bulmak önemli. Bu bulgular bu genetik model sistem hızlandırılmış araştırma içine HFD kaynaklı obezite roman düzenleyiciler bulmak için ideal bir araç olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig2.jpg"> 
Resim 2 . ETİKET deneyleri erkek ve dişi sinekler de. 2 - haftalık sinekler normal diyet toplanmış, seks (kadın ve erkek) tarafından gruplandırılmış, tartılır ve (iyi başına 3 veya 5 sinekler) kadar etiketi çözümleme için zemin. Bu makalede açıklanan yordamları izleyerek etiketi deneyleri gerçekleştirilmiştir. Her örneği 550'Absorbans nm okumak farklı noktalarda zaman-(0 dk, 5 dk, 20 dk ve 50 dk) nihai TAG miktar dalgalanmalar belirlemek için zaman, şişman içerik varyasyon üzerinde farklı nüfus boyutlarda (3 ve 5 sinekler) w1118 uçar ve etiket içeriklerini erkek ve kadın arasındaki farklar. Sonuçlar gösterdi kadın erkek meslektaşlarına (A-B) daha fazla yağ birikir, etiket ölçüleri 50 dakikaya kadar tepki kuluçka 37 ° c (A-B) sonra dalgalanma değil. Ayrıca, ortalama etiket düzeyleri arasında 3 veya 5 sinekler (A-B) kullanarak etiket deneyleri değişmeden kalır. Verileri ortalama ± SEM istatistik sunulmaktadır: anlamlı bir fark. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig3.jpg"> 
Şekil 3 . Yağ birikimi üzerine etkileri HFD. 
A-b 2 - hafta yaşlı kadın sinekler normal veya HFD 5 gündür kaldırdı toplanmıştır ve yağ düzeylerini belirlemek için etiket deneyleri gerçekleştirilmiştir. Etiketinin içeriği ağırlık(a)veya protein düzeyleri (B) ile normalleştirilmiş. Veri HFD tüketimi artan yağ içeriği için normalleştirme her iki yöntem ile yol gösterdi. C: 2 - hafta yaşlı kadın sinekler normal/denetim gıda (NF) ve 18 h, 1 gün ya da 2 gün HFD Etiketinin içeriği için denetlesinler. Sonuçlar 2 gün HFD etkilenme 18 h dan etiket düzeylerinin önemli ve ilerici bir artış gösterir. Verileri ortalama ± SEM istatistik sunulmaktadır: Öğrenci t-testi. * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K Görüntüleme.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.

Video: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...