Vorremmo ringraziare Erika Taylor per l'editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) a R.B., un supplemento di ricerca post-dottorato (R01 HL085481) e comunione (AAUW) a S.B.D. e dall'associazione americana del cuore di S.B.D. e r.t.b.

1. HFD alimentazione protocollo <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> tabella 1. Ricetta di cibo volare. 
La tabella seguente riassume i diversi ingredienti utilizzati per preparare il nostro controllo cibo. Una volta effettuata, 10 mL del cibo è versato in fiale, raffreddato e conservato a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
<ol><li>Preparazione HFD <ol><li>per fare 1 kg di cibo grasso alto, pesare 700 g di alimento normale pre-fatta (cfr. tabella 1) e 300 g di olio di cocco in due contenitori separati usando una bilancia analitica.</li>
		<li>Di calore ogni contenitore individualmente nel microonde, fino a quando il contenuto si fondono completamente. Versare l'olio di cocco nel contenitore per alimenti volare. Mescolare con una frusta fino a quando l'olio è ben amalgamato nel cibo volo. 
		Nota: Nessun pezzi di cibo o di olio devono essere visibile. Quando l'alimento si sta sciogliendo nel microonde, interrompere a intervalli di 1 min a mescolare il cibo ed evitare l'ebollizione.</li>
		<li>Ripesare il cibo grasso alto. Se il peso totale è inferiore a 1 kg (700 g di cibo + 300 g di olio di cocco), aggiungere l'acqua (circa 10 mL) per compensare l'evaporazione durante il riscaldamento e per riportare il peso di 1 kg.</li>
		<li>Versare circa 10 mL di omogeneizzato alto cibo grasso per flaconcino (circa il 25% del volume del flaconcino). Successivamente, coprire con una garza per evitare mosche &#39; contaminazione. Raffreddare per 1 h a temperatura ambiente, poi le fiale a 4 ° C per lo stoccaggio di trasferimento fino a 4 settimane. 
		Nota: Il cibo normale (NF) viene utilizzato come un alimento di controllo. Anche versare 10 mL (circa il 25% del volume di fiala) di NF per flaconcino. Per il cibo HFD, sostituire il 30% del cibo NF con olio di cocco. Per il controllo e condizioni sperimentali, le mosche ci hanno dato la stessa quantità di NF e HFD (10 mL di cibo per flaconcino).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Figura 1 . HFD alimentazione in Drosophila. 
Lo schema mostra le diverse fasi di alimentazione per le mosche su un alimento di controllo (dieta normale senza aggiunta di olio di cocco-NF) o HFD (con l'aggiunta di olio di cocco). L'intero processo richiede 10 giorni dopo la raccolta iniziale di mosche adulte. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"> <li>HFD alimentazione di d. melanogaster Nota: questo protocollo comprende controllo cibo e HFD alimentazione procedure che sono compatibili con qualsiasi linea di volo. Controllo e sperimentali mosche sono messi in flaconcini contenenti lo stesso cibo di quantità (NF o HFD).
	<ol><li>Uso CO 2 ad anestetizzare le mosche. 
		Nota: Per i neofiti, per favore leggi di riferimento 21 per una panoramica sulla generazione e la gestione di d. melanogaster.</li>
		<li>Raccogliere 0-5 mosche di giorno vecchio da fiale e trasferimento (girando) le mosche nei nuovi flaconi contenenti NF (precedentemente riscaldato a temperatura ambiente). Lasciare che l'età di mosche per ulteriori 5 giorni a 21 ° C.</li>
		<li>Alla fine dei 5 giorni, togliere i flaconcini contenenti HFD e NF da 4 ° C. 
		Nota: poiché le temperature fredde possono sollecitare vivente mosche, lasciate le fiale riposare per 30 min a temperatura ambiente per riscaldare prima dell'uso.</li>
		<li>Uso salviettine, pulire e rimuovere il liquido in eccesso dai lati delle fiale.</li>
		<li>Inserire un piccolo pezzo di carta da filtro, circa 1 cm x 3 cm, nell'alto alimento grasso di assorbire qualsiasi liquido in eccesso. 
		Nota: Questo passaggio è fondamentale per prevenire le mosche di attaccarsi al cibo HFD.</li>
		<li>Trasferimento le mosche sul cibo grasso elevato (girando). Posare le fiale orizzontalmente dalla loro parte, (non permanente) 21-22 ° c per 5 giorni. 
		Nota: Evitare temperature superiori come questo può fondere parzialmente il cibo grasso alto, causando le mosche a bastone per il cibo e il die.</li>
		<li>Dopo 5 giorni, trasferimento (girando) le mosche da NF e HFD nei flaconi di nuovi senza cibo per consentire loro coraggio di vuoto per 30 min. Successivamente, procedere alla pesatura le mosche. 
		Nota: Uno dei passaggi critici in questo HFD protocollo di alimentazione è quello di preparare un omogeneizzato HFD, gratuitamente qualsiasi pezzi di cibo volo o olio condensato. Miscelazione omogenea e la HFD a 45-30 ° C di raffreddamento è consigliabile, prima versando in fiale e immagazzinare il cibo all'età corretta di 4 ° C. corrispondenza di controllo e sperimentali mosche è importante così come Priore condizioni nutrizionali e ambientali controllate per l'alimentazione di HFD. Durante la fase di alimentazione, controllo e mosche sperimentale devono essere data la stessa quantità di NF e HFD. Mai raccogliere mosche da sovraffollate fiale o flaconi (per evitare effetti transgenerazionali). Sempre mettere un massimo di 25 mosche per flaconcino durante NF e HFD per evitare la restrizione dietetica o altri effetti di affollamento. La HFD è composto di 30% di olio di cocco, così temperature superiore ai 22 ° C parzialmente potrebbero fondere la HFD, causando le mosche attaccare il cibo oleoso e morire. Prima di indossare le mosche la HFD, pulire le fiale per rimuovere eventuali residui di olio e inserire un filtro di carta per assorbire il liquido in eccesso nel cibo. Durante l'incubazione delle mosche su HFD, le fiale vengono deposte sui loro lati per fornire una superficie orizzontale senza grassi per le mosche.</li>
	</ol></li> <li>Le mosche di pesatura <ol><li>per ciascun genotipo e sesso per essere testato, utilizzare una scala ultra-sensibile per registrare i pesi dei tubi pre-etichettata, vuoto 1,7 mL.</li>
		<li>Utilizzando anestetico Vola o CO 2, anestetizzare e raccogliere 36 mosche dello stesso genotipo, genere, e alimentando uno stato con un pennello pre-pesati 1,7 mL tubo.</li>
		<li>Pesare nella provetta contenente le mosche con la stessa scala ultra-sensibile.</li>
		<li>Determinare il peso medio di volare seguendo questa formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Nota: il numero di mosche in questo protocollo è 36.</li>
		<li>Flash congelare le provette di 1,7 mL contenenti mosche immergendo nell'azoto liquido per 2 min. raccogliere e mettere i tubi in scatole. Successivamente, trasferire le caselle a-80 ° C (temperatura di preferibile) per deposito fino all'utilizzo con il dosaggio TAG. 
		Attenzione: L'azoto liquido è ad una temperatura estremamente bassa. Si prega di utilizzare l'equipaggiamento protettivo personale appropriato.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG analisi <ol><li>preparazione delle concentrazioni standard TAG <ol><li>preparare 500 mL di PBT (PBS 1X, 0.05% Triton).</li>
		<li>Utilizzando provette da 0,5 mL e la soluzione di TAG (Tabella materiali), preparare 100 µ l di blank (PBT solo) e 100 µ l di sei concentrazioni standard di TAG (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0.125 µ g / µ l; 0,0625 µ g / µ l) con il PBT.</li>
		<li>Mettere i tubi sul ghiaccio e procedere con le mosche di macinazione.</li>
	</ol></li> <li>Rettifica le mosche <ol><li>prendere le mosche congelate da-80 ° C (punto 1.3). Trasferire le provette contenenti le mosche sul ghiaccio</li>
		<li>In primo luogo, disponga 2 mm metallo sfere di macinazione in un dispenser di 96 pozzetti palla, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere palle extra.</li>
		<li>Posto la macinazione di 96 pozzetti piastra capovolta in cima al distributore di palla e flip per trasferire le sfere di metallo direttamente nella piastra di macinazione. Ci dovrebbe essere una palla per pozzetto.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 600 µ l di PBT in ogni riga della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Con il forcipe, aggiungere 3 mosche per pozzetto. Indicare la condizione di genotipo, sesso e cibo delle mosche in ogni riga/pozzetto della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Posto saldamente i tappi sulla piastra 96 pozzetti rettifica. Nastro può essere posizionato sulla parte superiore per garantire che non vi siano perdite.</li>
		<li>Inserire correttamente le piastre da 96 pozzetti rettifica la rettificatrice. Impostare la macchina per la massima velocità e premere &#34; eseguire &#34; per macinare le mosche per 3 min.</li>
		<li>Dopo 3 min, sospendere la macinazione e procedere con centrifugazione piastra: eleGE per 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire la piastra di macinazione con attenzione per evitare di mescolare il surnatante con il pellet.</li>
	</ol></li> <li>Caricamento del campione e determinazione del contenuto di TAG <ol><li>prendere una nuova piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare 200 µ l del reagente TAG in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Di carico 20 µ l di PBT nel pozzo prima della prima riga, per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>carico 20 µ l di ciascuna diluizione standard (dal punto 2.1.2) nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 µ l di supernatante da ogni riga del piatto rettifica per la riga corrispondente nella piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Successivamente, inserire un foglio di gas-permeabili sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min. 
		Nota: Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuovere tutte le bolle. La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto della piastra a 550 nm utilizzando un lettore di micropiastre compatibile. Quindi, tracciare la curva standard e determinare la concentrazione [µ g / µ l] dei campioni sconosciuti.</li>
		<li>Per determinare la quantità di contenuto del TAG a medio peso Mosca, utilizzare la seguente formula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Nota: nel presente protocollo, sono stati tritati 3 mosche in 600 µ l di PBT; di conseguenza, il volume medio per volare è 200 µ l.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di Bradford e la normalizzazione del contenuto dei TAG con contenuto proteico <ol><li>preparare sette 100 µ l di albumina di siero bovino (BSA) diluizioni standard (100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 75 µ g/mL; 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) con il PBT.</li>
		<li>Prendere una nuova piastra a 96 pozzetti e caricare 200 µ l di reagente di Bradford X 1 in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Nel primo pozzetto della prima riga, aggiungere 10 µ l di PBT per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>aggiungere 10 µ l di ciascuna diluizione standard nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 10 µ l del surnatante fly da ogni riga del piatto rettifica nella riga corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Posizionare un foglio permeabile al gas sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min. Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuoverli. 
		Nota: La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Uso uno spettrofotometro leggere l'assorbanza dello spazio in bianco, standard e campioni incogniti a 595 nm. Utilizzare la curva standard per determinare le concentrazioni [µ g / µ l] dei campioni in ogni riga.</li>
		<li>Normalizzare il TAG contenuto con livello di proteina utilizzando la seguente formula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Induzione di obesità nei topi può richiedere mesi19,20. In mosche, questo HFD alimentazione protocollo consente per l'induzione dell'accumulo di grasso in eccesso in una questione di giorni o meno, causando aumenti in accumulo di grasso solo dopo 18 ore (Vedi Figura 2). HFD alimentando con il protocollo descritto aumenta il glucosio contenuto 12 e diminuisce Bmm lipasi e PGC-1 espressione24. Questo è in contrasto con il digiuno di adulto della drosofila che provoca una diminuzione veloce grasso e glucosio contenuto25,26 sia aumentata espressione di Bmm 24. Inoltre, innalzamento dei livelli di Bmm o PGC-1 protegge contro l'obesità indotta da HFD14,24. Mentre 30% HFD è stato utilizzato in questo protocollo, alimentazione mosche con il 3%, 7% o 15% grasso dieta obesità indotta in un dose-dipendente la moda12, come fa aumentare la durata del HFD alimentazione (Figura 3). Abbiamo anche trovato che alimentazione singoli acidi grassi dei componenti principali dell'olio di cocco, cioè, acido laurico 14% o 5% acido miristico, cause significativamente elevato accumulo di grasso12.
La risposta metabolica accelerata con queste mosche su un regime HFD è correlata con una ridotta durata27 come osservato nei mammiferi28, ma &#62; l'80% delle mosche sopravvivere oltre 20 giorni su HFD27. La rapida induzione di accumulo di grasso mediato da processi cellulari e molecolari conservati controllo dei lipidi e metabolismo del glucosio è vantaggioso per molti studi correlati all'obesità, come la cardiomiopatia diabetica o lipotoxic10, 12,13,14,15,16. Risultati chiave nelle conseguenze di squilibri metabolici e relative disfunzioni cardiache probabilmente permetterà studi comparativi translational in esseri umani.
La HFD protocollo di alimentazione è compatibile per l'utilizzo con altri modelli della specie e insetti di Drosophila che condividono simili diete con d. melanogaster. Questo HFD protocolli di alimentazione potrebbe essere opportunamente adattati per organismo come c. elegans , o anche altri insetti che richiedono supporti diversi cibo 'normale'. Il 30% HFD non è adatto a utilizzare nella sperimentazione che richiedono alte temperature; Tuttavia, le concentrazioni ridutrici di olio di cocco o singoli acidi grassi potrebbero essere adeguate alternative12.
Questo TAG protocollo si basa su PBS, un buffer non tossico che permette la facile manipolazione e sperimentazione senza una cappa aspirante, in contrasto con precedentemente utilizzati solventi organici (metanolo/cloroformio o etere etilico) in lipidi estrazione e quantificazione15 , 29 , 30. un altro vantaggio di questo buffer è che può normalizzare i livelli di TAG al contenuto di proteine basato su stesso omogenato iniziale, rendendo la determinazione del grasso in piccoli campioni di tessuto facilmente realizzabili e offrendo nuove opportunità per lo studio dell'organo cross-talk nell'omeostasi metabolica organismal. Inoltre, l'omogenato Vola iniziale stesso ottenuto dopo macinazione, utilizzabile per eseguire analisi parallele di glucosio e glicogeno, permettendo lo studio dei cambiamenti nel metabolismo lipidico sia glucosio dagli stessi campioni biologici. Questo protocollo di TAG è meno laborioso o che richiede tempo che precedenti protocolli15,29,30ed è piuttosto alto velocità effettiva, utilizzando un formato di 96 pozzetti che consente per il test rapido di vicino 100 campioni entro un'ora. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per quantificare il contenuto di grasso sotto altre circostanze dietetiche, compreso alta zucchero dieta13,31, restrizione dietetica e della fame, così come per gli studi di invecchiamento capire i cambiamenti età-collegati nel metabolismo dei grassi.
Obesità, sindrome metabolica e patologie correlate sono a un livello più alto con disastrose conseguenze sulla salute umana1,2. Il protocollo HFD combinato e il throughput elevato TAG offerta saggio una piattaforma unica per l'utilizzo di organismi modello come Drosophila, di indurre rapidamente obesità e schermo per fattori genetici, o composti chimici naturali e sintetici, per meglio comprendere squilibrio metabolico. In definitiva questo potrebbe contribuire notevolmente al progresso delle scoperte scientifiche per lo sviluppo di nuovi trattamenti o cure per malattie metaboliche.

Siamo in un tempo dove l'obesità e suoi associati oneri economici, è un problema mondiale1. Due su ogni tre americani sono in sovrappeso o obesi con patologie relative al cuore, la causa primaria di morte entro la popolazione adulta2. Nuovi metodi efficienti sono necessari studiare adeguatamente i componenti genetici e molecolari implicati nella regolazione della sindrome metabolica utilizzando organismi modello. Per questo motivo, abbiamo scelto il moscerino della frutta Drosophila modello perché condivide i più elementari processi biologici con i mammiferi, compreso gli esseri umani e topi3,4,5,6. Genoma di drosophilaè altamente conservato durante l'evoluzione, ma nel complesso molto più piccolo con meno duplicazione genica e di complessità metabolica, che lo rende ideale per la comprensione dei meccanismi fondamentali implicati in molte malattie umane4 , 7 , 8. Inoltre, caratteristici processi effettuati dal tessuto adiposo, intestino e pancreas sono rappresentate in tempo reale e mediare le funzioni di regolamentazione nel metabolismo glucidico e lipidico, ad esempio, che sono simili a esseri umani9, 10,11. Inoltre, la base delle vie molecolari coinvolte nel controllo dell'obesità, insulino-resistenza e diabete negli esseri umani sono funzionalmente conservate in Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. come organismi superiori, Drosophila ha un cuore che batte che si forma durante lo sviluppo di processi simili a quella del cuore di un mammifero3,17. Così, lo sviluppo di un affidabile HFD alimentazione protocollo e throughput elevato TAG dosaggio, adatte a scopi di screening efficiente utilizzando la casella degli strumenti genetici di Drosophila, fornire un importante mezzo per studiare e comprendere le basi genetiche fondamentali malattie metaboliche complesse sottostanti.
Il cibo HFD stesso fatta da un alimento standard del laboratorio integrato con olio di cocco, che è costituita principalmente da acidi grassi saturi, conosciuti per essere associato con la sindrome metabolica18. Mentre che inducono l'obesità nei modelli dei mammiferi, come roditori, può richiedere mesi19,20, nostro HFD ottimizzata protocollo di alimentazione in Drosophila in modo efficace e riproducibile aumenta organismal tenore di materia grassa in una questione di giorni12,14. Questo protocollo, in combinazione con un dosaggio elevato throughput TAG, permette lo screening di massa efficiente per gli effetti di fattori genetici, influenze ambientali e i farmaci candidati per scoprire nuovi modulatori del metabolismo dei grassi. Di conseguenza, questi protocolli sono probabili rilevanti per capire e/o combattere l'obesità e le patologie associate all'obesità.
Il protocollo di alimentazione è versatile e può essere applicato per studiare gli effetti metabolici e funzionali dei singoli acidi grassi saturi o insaturi. L'uso di questo test di velocità effettiva elevata TAG non è limitato a d. melanogaster, ma può essere adattato ad una varietà di organismi modello piccolo con cuticola o dure matrici extracellulari (ad es., altre specie di Drosophila , c. elegans e altri emergenti organismi invertebrati marini modello) per misurare il tenore di materia grassa in differenti condizioni ambientali, genetiche o fisiologiche, in qualsiasi fase di sviluppo, età adulta o fase di malattia metabolica. Il dosaggio di TAG è basato su una misurazione colorimetrica di una serie di reazioni enzimatiche che degradano i tag in acidi grassi, glicerolo, glicerolo 3-fosfato e, infine, H2O2 che reagisce con 4-amminoantipirina (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-idrossibenzene sulfonato (3,5 DHBS) per produrre un prodotto colorato di rosso che viene misurato mediante uno spettrofotometro a 96 pozzetti.

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

La malattia di cuore è la causa numero uno di morte umana in tutto il mondo. Numerosi studi hanno dimostrato forti connessioni tra l'obesità e malfunzionamento cardiaco negli esseri umani, ma più strumenti e gli sforzi di ricerca sono necessari delucidare meglio i meccanismi coinvolti. Per oltre un secolo, il modello geneticamente altamente trattabile di Drosophila è stato strumentale nella scoperta di geni chiave e vie molecolari che ha dimostrato di essere altamente conservata tra le specie. Molti processi biologici e meccanismi di malattia sono funzionalmente conservati al volo, come sviluppo (ad es., piano di corpo, cuore), cancro e malattie neurodegenerative. Recentemente, lo studio dell'obesità e patologie secondarie, come le malattie cardiache negli organismi di modello, ha svolto un ruolo molto critico nell'identificazione dei regolatori chiave coinvolti nella sindrome metabolica in esseri umani.
Qui, ci proponiamo di utilizzare questo organismo di modello come strumento efficace per indurre l'obesità, cioè, eccessivo accumulo di grasso e sviluppare un efficiente protocollo per monitorare il contenuto di grassi sotto forma di accumulo di tag. Oltre a altamente conservata, ma meno complesso genoma, al volo ha anche una durata breve per sperimentazione rapida, combinata con rapporto costo-efficacia. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per l'alimentazione di alta dieta di grassi (HFD) in Drosophila per indurre l'obesità e un'analisi di triacylglyceride (TAG) di throughput elevato per la misurazione l'associato aumento nel contenuto di grassi, con l'obiettivo di essere altamente riproducibile e efficiente per lo screening genetico o chimico su larga scala. Questi protocolli offrono nuove opportunità per efficientemente indagare meccanismi regolatori coinvolti nell'obesità, nonché fornire una piattaforma standard per la ricerca di scoperta di farmaci per il test rapido dell'effetto di farmaci candidati sullo sviluppo o prevenzione dell'obesità, diabete e malattie metaboliche correlate.

In d. melanogaster, come è il caso con altre specie, non c'è dimorfismo sessuale tra maschi e femmine22. È noto che le femmine sono più grandi, con più grasso in loro addomi, di maschi22. Per testare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo eseguito saggi di TAG per determinare le differenze di contenuto TAG tra maschi e femmine di laboratorio standard wildtype (w1118) Vola. I dati mostrano che le femmine hanno più grasso di tutto il corpo che le loro controparti maschii (Figura 2A, B). I dati hanno mostrato anche che il dosaggio è stabile, senza alcuna variazione nella quantificazione di TAG nel tempo (fino a 50 min dopo incubazione) e nessuna variazione a seconda della dimensione del campione biologico (3 o 5 mosche).
Consumo di HFD ha dimostrato di causare obesità in essere umano e del mouse19,20,,23. Per testare l'efficacia del nostro protocollo di alimentazione, abbiamo effettuato analisi di TAG con i nostri HFD e controllo alimentato femminile mosche. Abbiamo trovato che il consumo di HFD in Drosophila provoca maggiore contenuto di grasso che si accumula progressivamente nel tempo (Figura 3A-C). Un altro importante trovare è che dopo solo 18 h di HFD alimentazione (Figura 3C), siamo stati in grado di indurre un significativo aumento del tenore di grassi in questi ditteri. Questi risultati suggeriscono che questo sistema modello genetico è uno strumento ideale per la ricerca accelerata per trovare nuovi regolatori dell'obesità indotta da HFD.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig2.jpg"> 
Figura 2 . TAG analisi nella mosche maschii e femminili. 2 - settimana-vecchio mosche su una dieta normale sono sono raccolti, raggruppati per sesso (maschi e femmine), pesati e macinati (3 o 5 mosche per pozzetto) per analisi di TAG. TAG analisi sono state eseguite seguendo le procedure descritte in questo documento. L'assorbanza di ciascun campione a 550 nm è stato letto a intervalli di tempo diversi (0 min, 5 min, 20 min e 50 min.) per determinare eventuali fluttuazioni nella quantificazione di TAG nel corso del tempo, grasso contenuto variazione in diverse popolazioni (3 e 5 mosche) di w1118 mosche e le differenze tra maschio e femmina contenuto del TAG. I risultati hanno mostrato che le femmine si accumulano più grasso rispetto ai loro colleghi maschi (A–B), misure di TAG non cambiano fino a 50 min dopo incubazione a 37 ° C (A–B) reazione. Inoltre, la media TAG livelli rimangono invariati tra TAG analisi facendo uso di 3 o 5 mosche (A–B). I dati sono presentati come media ± SEM. Statistiche: nessuna differenza significativa. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig3.jpg"> 
Figura 3 . Effetti di HFD su accumulazione grassa. 
A-b: 2 - settimana-vecchio femminile mosche generati su un normale o HFD per 5 giorni sono stati raccolti e l'analisi di TAG sono state eseguite per determinare i livelli di grasso. Contenuto del TAG è stata normalizzata con peso (A) o (B) i livelli della proteina. I dati hanno mostrato che il consumo di HFD porta a maggiore contenuto di grassi con entrambi i metodi di normalizzazione. C: 2 - settimana-vecchio femminile mosche sul cibo normale/controllo (NF) e 18 h, 1 o 2 giorni su HFD sono analizzati per il contenuto dei TAG. I risultati mostrano un aumento significativo e progressivo di livelli di TAG da 18 h a 2 giorni di esposizione al HFD. I dati sono presentati come media ± SEM. Statistiche: test t di student. * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56029/56029fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K Views.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

Video: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Ricerca

Genetica

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em&gt; Reinhardtii Chlamydomonas</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...