Bu eser patoloji departmanı, Utah Üniversitesi J.C.S.B. için bir başlangıç hibe tarafından desteklenmiştir

1. sinerji tahmin mutantlar örtüşme2 yöntemi (O2M) DataSet'in kimyasal-genetik üzerinden belirlenmesi
Not: Bu sinerji tahmin mutantlar Nichols ve arkiçin yayımlanan veri kümesi kullanarak tanımlamak için yöntemidir. 17 E. coli'. Ancak, bu herhangi bir kimyasal-genetik veri kümesi ve mikroorganizma yapılabilir. Bu veri kümeleri 100'den fazla küçük moleküller varlığında, yetiştirilen nakavt mutantlar için her küçük molekül her mutant bir kantitatif büyüme puan veren kütüphanesi içerir. İki tane sinerjik bilinmesi gereklidir ve büyüme puanları dahil veri kümesindeki her iki küçük moleküller için olmalıdır.
<ol><li>
Tüm mutantlar her küçük molekül tek bir konsantrasyon huzurunda yetiştirilen ortalama büyüme puanı ve standart sapmayı hesaplayın. Not: Bu yapılabilir herhangi bir elektronik tablo yazılımı kullanarak. Kahverengi laboratuvar Excel ve işlevlerini kullanır =AVERAGE(B3:B3981) ve =STDEV(B3:B3981) küçük molekül her sütununun hesaplamalar için.<ol>
<li>Bu yönlendirme Eğer farklı bir veri kümesi kullanarak farklı olabilir rağmen anlamına gelir ve standart sapmalar küçük molekül, her sütundaki hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küçük molekül Nichols ve diğerleriiçin aynı veri kümesi kullanarak her konsantrasyon için Z puanları hesaplayın. 17 bir elektronik sayfa programında. Bunun için Z(2.5) negatif z skorları olacak = demek - 2,5 * standart sapma ve pozitif z score-ecek var olmak Z(2.5) = ortalama + 2,5 * standart sapma.</li>
	<li>Bu moleküller tüm konsantrasyonları bakmak için emin olmak bilinen sinerjik çifti oluşturan küçük moleküller önemli Z skorları mutantlar hangi gen içeren belirlemek. Bir mutant puan büyüme daha az negatif Z (2.5) puan edinildi veya bu küçük molekül için pozitif Z (2.5) puan daha büyük, önemli kabul edilir.</li>
	<li>Herhangi bir önemli gen mutantlar bir operon ait belirlemek. Not: E. coliiçin yazarlar tavsiye "Ecoli wiki" bilgi için kontrol eğer bir polycistronic RNA parçası olarak genlerin transkripsiyonu ile ilgili olarak.</li>
	<li>Farklı konsantrasyonlarda ilgi küçük moleküller çoğunluğu için ortak gen/operon mutantlar tanımlamak (Örn., antibiyotik trimetoprim ile synergize molekülleri tanımlamak için önemli bir Z gösteren mutantlar ararken ««puan) huzurunda trimetoprim ve bilinen sinerjik ortakları sulfamethizole veya sulfamethoxazole gibi büyüdü. Bunlar sözde sinerji tahmin mutantız.</li>
</ol>2. Synergizers O2M kimyasal-genetik Dataset içinde tahmin
<ol><li>Veri kümesi17' ye dönersek, sinerji tahmin mutant bir önemli bir büyüme puanı aydınlığa çıkartıyor küçük molekül her konsantrasyonu belirlemek. Bu küçük moleküller her konsantrasyon için hesaplanan Z skorları bakarak yapılır. Yine, bir önemli bir büyüme puan olumsuz Z skor veya küçük molekül bu konsantrasyon için pozitif Z puanı daha büyük olan. Not: bir molekül bile onun konsantrasyonları birinde görüntülenirse, molekül tahmin edilen bir synergizer olarak kabul edilir. Önemli bir büyüme puanı temin etmez herhangi bir tahmin edilen sigara synergizer moleküldür.</li>
</ol>3. öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama
<ol><li>Tahmin edilen synergizers minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) bulma.
	<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür 37 ° C'de M9 en az medyada büyümek Not: Herhangi bir gecede kültür faiz organizma için uygun şekilde tanımlanmış ortamda yetiştirilen olabilir. Kahverengi laboratuvar LB veya YPD gibi zengin medya önermez. M9 en az medya 10.5 g/L M9 suyu, %0,2 casamino asitler, 0.1 M CaCl2, % 0,4 glikoz, 1 M MgSO4, % 0.25 Nikotinik asit ve %0,33 tiamin H2o oluşur</li>
		<li>Eğer patojen ilgi küçük moleküller alınması üzerine literatürde bulundu mikrofon veri yüksek bir konsantrasyon dimetil sülfoksit (DMSO) dağıtılması (> 10 mg/mL).</li>
		<li>96-şey plaka kullanarak 100 µL M9 medya her şey için ekleyin. Toplam 200 µL içerecek şekilde bir ekstra 100 µL M9 medya sütun 1 ekleyin.</li>
		<li>Çoklukta (~ 10 µL) konsantre küçük molekül çözüm 1 sütun ekleyin. Sütun 1 (8 plaka küçük moleküller) kuyu başına bir küçük molekül. Not: Bu synergize tahmin edilmektedir küçük moleküller ilgi vardır. Kahverengi laboratuvar genellikle yüksek konsantrasyonlu küçük molekül çözümün E. coliinhibe olabilir % 100 DMSO miktarın altına olan 10 µL ekler.</li>
		<li>Küçük moleküller eklendikten sonra küçük moleküller plaka x ekseni oranında seyreltin. 100 µL çözüm sütun 1, sütun 2 yer alıp karıştırın. 100 µL sütun 2, 3 sütun içinde yer alıp karıştırın. 100 µL yerleştirilir kadar 11 sütununda bu işleme devam edin. Sütun 11 karıştırın, sonra o sütundaki 100 µL alıp atmak. Sütun 12 ile sadece medya verileri normalleştirmek için bırakın.</li>
		<li>Plaka aşılamak. Optik yoğunluk (OD600) bir gecede kültür elde etmek. Kültür ve OD600 0,002 itibaren M9 medyaya bir çözüm hazırlamak (veya uygun 500 hücre/µL ilgi istenen organizma için temsil eden konsantrasyon). Yani iyi başına 1.000 hücre kültür çözüm 2 µL plaka her kuyuya pipet.</li>
		<li>Yavaşça plaka sallamak ve 0 h okuma OD600 elde edilir. Plakayı 24 h 24 h okuma OD600 elde edilir için 37 ° C'de büyümeye izin. Not: Kullanım uygun diğer organizmalar için koşullar ilgi büyüyor.</li>
		<li>Her şey bir elektronik tablo programı kullanmanız için net büyüme hesaplamak.</li>
		<li>Ortalama hiçbir ilaç büyüme elde etmek için sütun 12 net büyüme ortalama. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak hiçbir ilaç büyüme ortalaması için diğer wells normalleştirmek. Bakmak için herhangi bir şey ile az % 10 büyüme MIC90 tanımlamak için. Herhangi bir MIC50 büyüme de az %50 ile gösterir. Bu Wells küçük molekül konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim için
	<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür medyada M9 en az önce büyümek. Not: Uygun kullanım koşulları diğer organizmalar için büyüyen.</li>
		<li>Her şey bir 96 iyi tabak ve bir ekstra 100 µL sütun 1 100 µL M9 medya ekleyin.</li>
		<li>Test küçük molekül eklemek (~ 8 MIC x) her şey sütun 1 ve çift konsantrasyon ekleyin (~ 16 x mikrofon) iyi A1 için (bir küçük molekül test plaka). Not: Bu miktar mikrofon test tamamlandı önceden belirlenir ve her potansiyel synergizer için farklıdır.</li>
		<li>Bir degrade seyreltme alarak 100 µL sütun 1 ve sütun 2 aktarma x ekseni üzerinde oluşturun. 100 µL sütun 11 eklenene kadar bu işleme devam edin. Karıştırın, sonra sütun 11 100 µL alıp atın. Herhangi bir ilaç sütun 12 (Şekil 1A) eklemeyin.</li>
		<li>Giriş uyuşturucu için y ekseni boyunca ikinci ilaç degradenin ayarlayın. Medya içeren 2 x mikrofon giriş molekülün satırındaki A. Mix ve seyreltik olarak daha önce alarak 100 µL satır A ve 100 µL satır G. Mix yerleştirilir kadar B. Continue (devam) yerleştirerek üzerinden 100 µL eklemek, 100 µL ve elden çıkarma giriş herhangi bir ilaç satır H. eklemek için sağlanması, Bu satır H ve sütun 12 test ilaç çifti (Şekil 1B) tek tek doz içeren sağlar.</li>
		<li>Plaka aşılamak. 2 µL OD600 0,002 bir E. coli kültürün her şey (iyi başına 1.000 hücreleri) ekleyin.</li>
		<li>0 h okuma plaka her kuyuya OD600 ölçmek.</li>
		<li>37 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya</li>
		<li>24 saat her kuyuda OD600 ölçmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Çözünme kesirli inhibitör konsantrasyon dizinden (FICI) hesaplama
	<ol>
<li>Her şey için net büyüme plaka, 0 h, bir elektronik tablo programında 24 h OD600 OD600 çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Yazılım büyüme yok küçük molekül içerir her şey iyi H12 bölerek normalize.</li>
		<li>Sütun 12 giriş molekülünün MIC90 ve H. satırda potansiyel synergist MIC90 bulmak</li>
		<li>Büyüme yüzde 90'ını inhibe tüm kuyular için bak.</li>
		<li>Ya da en düşük (sinerjik) aşağıda o FICI90 hesaplamak veya yukarıda (düşman) en üst denklemi kullanarak her iki MIC90 değeri: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>Herhangi bir FICI ≤ 0,5 olarak sinerjik düşünün ve FICI ≥ 4 antagonistik (Şekil 2). Not: Bu da MIC50 ile yapılabilir (% 50 büyüme inhibisyonu) bu mikrofon değerlerine göre bir FICI50 almak için.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss bağımsızlık tahlil Not: Bliss bağımsızlık bir mikrofon, kendi yoktu herhangi bir potansiyel synergist ile çalıştırılır.<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür M9 medya 37 ° C'de daha önce olduğu gibi büyür. Not: Bu adımda yine, uygun yetişme şartlarına ilgi diğer organizmalar için kullanılabilir.</li>
		<li>96-şey plakaları potansiyel sinerjik molekül, giriş molekül, kasanın ve sigara tedavi kontrol testleri için hazır olun.</li>
		<li>Potansiyel synergist plaka her şey için 50 µL M9 medya ekleyerek oluşturun. 50 µL medya kümesi bir konsantrasyon (10 µM veya 100 µM) içeren bir satır her şey için potansiyel synergist ekleyin. Plaka başına 8 molekülleri sınayın.</li>
		<li>Giriş molekül plaka her şey için 50 µL medya ekleyerek oluşturun. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. X ekseni boyunca bir degrade seyreltme mikrofon tabak, sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma benzer oluşturun. Sütun sütun 12 50 µL atılması 12, kadar bu işlemi sürdürün. Her şey için bitiş toplam 100 µL bu yüzden her şey için bir ek 50 µL medya ekleyin.</li>
		<li>Kombinasyon plaka 96 iyi plaka kullanarak oluşturma, her şey için 50 µL medya ekleyin. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. Benzer sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma mikrofon tabak, x ekseni boyunca oranında seyreltin. Bu sütun 12, 50 µL 12 sütundan atılması için tüm yol devam. 50 µL 10 µM ya da her şey bir satır için 100 µM potansiyel synergist içeren medya ekleyin. Yine, bir konsantrasyon veya satır başına ilaç olmalıdır.</li>
		<li>Sigara tedavi kontrol plaka bütün wells için 100 µL M9 medya ekleyerek oluşturun.</li>
		<li>Tüm plakaları her yanı sıra daha önce bakteri kültürü 2 µL 0,002 veya 1.000 hücrelerin bir OD600 ile ekleyerek aşılamak.</li>
		<li>Her şey 0 ile 24 h OD600 ölçmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss bağımsızlık puan hesaplama
	<ol>
<li>Her şey için net büyüme plaka 0 h 24 h bir elektronik tablo programı kullanmanız büyümeden OD600 çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Kuyuları ortalama büyüme için bir elektronik tablo programında hiçbir ilaç plaka normalleştirmek.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı kullanarak, inhibisyon 1 net büyüme çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı yalnızca giriş degradede içeren denetim plaka sütunlarda ortalama.</li>
		<li>Her şey için bliss puanı denklemi tarafından Hesapla: Bliss puanı (iyi X + giriş sütun X) -iyi X kombine =
</li>
		<li>Olumsuz puanları Wells giriş MIC90 aşağıda bulabilirsiniz. Not: Birden fazla konsantrasyonları arasında negatif puanları bir sinerjik etkileşim gösterir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. yüksek üretilen iş ekran roman sinerjik çiftleri tanımlamak için sinerji tahmin mutantlar ile
<ol><li>
Sinerji tahmin mutantlar tanımlamak Not: Adım 1.5 sözde sinerji tahmin mutantlar tespit edilmiştir. Burada, hangi bu mutant bir yüksek üretilen iş ekran sinerjik ilaçlar için en iyi çalışacaktır belirlemek. Biz bir Bioscreen makine bu tahlil gerçekleştirilen ama 96 iyi plaka okuyucu sayısı-meli da var olmak kabul edilebilir.<ol>
<li>Her sözde sinerji tahmin mutantlar ve vahşi-türü hücre M9 en az medyada büyümek.</li>
		<li>100 kadar set de petek plaka (veya 96 iyi plaka) uygun büyüme orta, büyüme orta + giriş uyuşturucu, büyüme orta + giriş ilaç ve büyüme orta + sinerjik sigara uyuşturucu bilinen sinerjik ortağı ile. Araç denetimleri eklemek için emin olun. Not: Dört kuyu her zorlanma/ilaç/yoğunlaşması çoğaltmak öneririz.</li>
		<li>Şey, boş denetim wells de dahil olmak üzere başına 1.000 hücre aşılamak.</li>
		<li>48 h 37 ° C'de sallayarak ile büyümek ve OD600 her 20 dk okuyun.</li>
		<li>Vahşi-türü ve sinerji arasındaki en büyük büyüme fark giriş uyuşturucu ve bilinen sinerjik ortakları huzurunda tahmin mutant hücreleri gösterir ilaç konsantrasyonu ve saat noktayı belirlemek. Uygun zaman nokta ve konsantrasyon uyuşturucu huzurunda sinerjik giriş uyuşturucu (Şekil 3) ile hareket değil bilinen yetiştirilen vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant hücreleri arasında fazla büyüme fark olmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinerjik uyuşturucu için yüksek üretilen iş ekran
	<ol>
<li>Vahşi-türü hücreleri ve sinerji tahmin mutant hücreleri M9 en az medyada büyümek. Not: uygun büyüme orta vade farkı organizma için kullanın.</li>
		<li>Uyuşturucu de, önceki adımda belirlenen küme toplama, küçük moleküller ile 100 µL ortamı içeren ortam her kitaplıktan ekleyin. Boş wells (olmadan hücreleri) ve wells ile araç denetimleri içerir (e.g., DMSO) herhangi bir büyüme inhibisyonu için uyuşturucu seyreltme araç tarafından hesap için.<ol>
<li>En az dört araç kontrol kuyu başı plaka, ideal iyi pozisyon etkileri için hesap için plaka dağılmış hazırlayın. Deneyleri değişken varsa, de satır/sütun başına en az bir araç denetim içerir ve her satır/sütun denetim de denetimi olarak yerine bir bütün plaka (adım 4.2.5) için her satır/sütun için Z score hesaplamak için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kültür 2 µL her yanı sıra daha önce ekleyin. (Vahşi türü bakteri ve tahmin edilen sinerji mutant bakteriler için bir tabak bir tabak).</li>
		<li>0 ile 18 h E. coli için veya 48 h OD600 C. neoformansiçin değerlendirmek.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı kullanarak, net büyüme araç kontrol kuyulardan boş Wells OD600 çıkararak hesaplar. Kuyu-2.5, Z-score ile tanımlamak (Z puanı demek - 2.5 = * standart sapma). Bu wells bir potansiyel synergist küçük molekül içerir.</li>
		<li>3. adımda açıklanan yöntemleri kullanarak ekran sayısı doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Development:+Challenges,+Unmet+Clinical+Needs,+and+New+Approaches.">Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).</li><li>Oprea, T. I., Mestres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Repurposing:+Far+Beyond+New+Targets+for+Old+Drugs.">Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs.</a> AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).</li><li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., Garc&#237;a-Contreras, S. J., Garc&#237;a-Contreras, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+repurposing+as+an+alternative+for+the+treatment+of+recalcitrant+bacterial+infections.">Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections.</a> Front Microbiol. 6, 282 (2015).</li><li>Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Drug+Synergy+in+Antimicrobial+Treatments.">Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments.</a> PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).</li><li>Cowen, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Hsp90+function+as+a+powerful,+broadly+effective+therapeutic+strategy+for+fungal+infectious+disease.">Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease.</a> P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).</li><li>Zuo, G. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819 (2011).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+drug+combinations:+interaction+and+network+perspectives.">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li><li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+and+rational+design+of+synergistic+small-molecule+pairs+for+combating+and+bypassing+antibiotic+resistance.">High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance.</a> PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).</li><li>Brown, J. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell.">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li><li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li><li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery.">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930 (2015).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li><li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinerjik küçük molekül çiftleri mikrobik enfeksiyonları tedavi güçlü bir araç olabilir, henüz sinerjik çiftleri tanımlamak için zor, çünkü onlar tam klinik potansiyellerini ulaşmak değil. Bu kağıt sinerjik çiftleri basit ikili kombinasyonları çok daha hızlı tanımlamak için bir yöntem açıklanır. Kimyasal-genetik veri kümelerini kullanarak, O2M daha sonra ekran büyük kitaplıklarına küçük moleküllerin bir okuma olarak sinerjik çiftleri tahmin etmek için kullanılabilir gen altını gizleme ile mutantlar tanımlar. Ekranlar, sinerjik ortakları largescale tanımlanması için sırayla kılan yüksek ölçeklenebilirlik için küçük moleküller tahmin yeteneği sağlar. Sinerjik çiftleri belirledikten sonra bir moleküler mekanizması temel sinerjik etkileşim aydınlatmak sonra rasyonel tasarım ek sinerjik çiftleri11.
O2M kimyasal genetik bir veri kümesi ve bilinen bir sinerjik çift gerektirir. Neyse ki, kimyasal-genetik veri kümeleri mikroplar19,20,21çeşitli için ortaktır. Kahverengi laboratuvar daha önce O2M başarıyla C. neoformans ve E. coli11,12' sinerjik çiftleri bulabilirsiniz gösterdi. Bu geniş etki O2M geniş bir çeşitli organizmalar için uygulanabilir bir ölçeklenebilir yöntemi olarak sahip olduğunu gösterir. Burada listelenen tüm adımları farklı bir mikroorganizma ile nispeten benzer sonuçlar, böylece O2M sinerjik çiftleri genel tanımlaması için değerli bir araç yapma büyüme için değiştirilebilir. Bu yöntemlerden en az programlama bilgisine O2M gerektirse de çeşitli diğer gruplar farklı analitik yöntemlerle kimyasal-genetik veri kümesinden gelen sinerjik kombinasyonları tespit vardır. Her yöntemin sinerjik antibiyotik veya antifungaller 18,22,23,24sinerjik çiftleri çok sayıda keşfedilmeyi kalmasını telkin, farklı grupları tanımlar. O2M ve diğer sinerji tahmin yöntemleri de kanser ilaç kombinasyonlarını belirlemek de dahil olmak üzere memeli sistemler için potansiyel olarak geçerlidir.
Özetle, bu yöntem bir kimyasal-genetik veri kümesinden gelen hızlı bir şekilde sinerjik çiftleri için ekran için açıklar. Bu yöntem ve diğerleri sinerjik çiftleri kliniklerde daha uygun bir tedavi seçeneği haline yardımcı olur. Ayrıca, O2M'ın hızlı ve yaygın yöntem bu değerli bir araç zaman sinerjik küçük molekül çiftleri Aradığınız kanıtlıyor.

Antibiyotik dirençli bakteri 2 milyondan fazla enfeksiyonları ve 23.000 ölümlerin her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nin CDC1göre neden. Yeni tedaviler bunlar hastalık üstesinden gelmek için ihtiyaç vardır. Bu yeni tedaviler tanımlamak için stratejiler geliştirme yeni antimikrobiyal ilaçların veya küçük moleküller diğer koşullar mikrobiyal enfeksiyonlar2,3,4tedavisi onaylanmış repurposing içerir. Ancak, yeni ilaç keşfi çok pahalı ve zaman alıcı. Uyuşturucu repurposing roman uyuşturucu tanıtabilecek değil veya uyuşturucu5,6hedefler. Laboratuarımızın sinerjik kombinasyon tedavileri bilinen üçüncü bir strateji üzerinde duruluyor. İki küçük molekül birlikte onların bireysel efficacies7katkı etkisi büyük bir etkinlik var sinerjik kombinasyon oluşur. Ayrıca, sinerjik kombinasyonları bir patojen dayanıklı onları büyük potansiyel8,9işleme ek olarak daha az istenmeyen hedef dışı etkilere sahip çift küçük moleküllerin birine karşı etkili olabilir, 10.
Sinerjik çiftleri uyuşturucu kombinasyonları11,12,13yaklaşık % 4-10 meydana nadirdir. Böylece, geleneksel teknikleri ikili ekranlar gibi zor ve zaman alıcı, küçük bir kütüphane üzerinden potansiyel kombinasyon yüz moleküllerin binlerce vardır. Ayrıca, sinerjik etkileşim genellikle bileşikler14aktivitesinden bilinemez. Ancak, yazarlar için örtüşme2 yöntemi (O2M)12olarak adlandırılan sinerjik çiftlerini ekran yüksek üretilen iş yaklaşımı geliştirdi. Burada, açıklanan bu yöntem bu sinerjik çiftleri daha hızlı, daha verimli tanımlanması için sağlar. O2M bilinen bir sinerjik çift ve bir kimyasal-genetik veri kullanımını gerektirir. Nakavt mutantlar Kütüphanesi birçok farklı küçük molekül huzurunda yetiştirilen kimyasal-genetik veri kümeleri oluşturulur. Bir molekül bilinen bir sinerjik çiftindeki ikinci sinerjik molekül olarak belirli nakavt mutant üzerinden fenotip aynı neden olmaktadır, aynı bu mutant üzerinden fenotip aydınlığa çıkartıyor diğer küçük molekül de bilinen her üye ile synergize sinerjik çifti. Bu mantığı kahverengi laboratuarda sinerjik antibiyotik çiftleri Escherichia coli (e.coli) karşı etkin ve sinerjik antifungal ilaç çiftleri patojenik mantar Cryptococcus neoformans (C. karşı etkin tanımlamak için kullanılmıştır neoformans)11,12. O2M sadece çeşitli patojenler için uyarlanabilir değil ama büyük Kütüphaneler moleküllerin tarama için kolayca ve hızla sinerjik çiftleri tanıtılmasına olanak sağlar. O2M tarafından tanımlanan genetik mutant ile tarama sadece sinerji için öngörülen küçük moleküller doğrulamak için bize izin verir. Olsaydı bile sadece 20 molekülleri synergize tahmin bu kitaplıkta, sinerji için şimdi test birkaç gün sürer, ancak böylece, 2.000-molekül kitaplığa ikili test ay, alır. O2M programlama bilgisi gerektirmez ve gerekli ekipman çoğu labs veya çekirdek imkanları mevcuttur. Araştırmacılar yanı sıra uyuşturucu kombinasyonlarda baktılar, O2M analiz bir uyuşturucu testi tamamladı ve önemli ilaç-ilaç etkileşimleri tespit ederek onların sayısı genişletmek isteyen herkese ilgilendirir. Aşağıda bakteri sinerjik küçük moleküllerin belirlenmesi gibi iyi bilinen deneyleri15,16öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama protokolüdür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Antimikrobiyal ilaçlar önemli ölçüde yaşam kalitesi ve ömrü 20inci yüzyılda artmıştır rağmen antimikrobiyal direnç tüm toplumumuzun yetenek sistemik enfeksiyonları tedavisi için tehdit ediyor. Yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde, antibiyotik dirençli enfeksiyonlar bir yıl ve maliyeti yaklaşık 20 milyar YTL ek sağlık hizmetlerinde yaklaşık 23.000 kişi öldür. Antimikrobiyal direnç mücadele için bir yaklaşım bulaşmasını organizma ve onun ilaç direnci profil tespit edilmiştir önce enfeksiyon, kritik erken dönemde özellikle yararlı olan kombinasyon tedavisi olduğunu. Birçok antimikrobiyal tedavi kombinasyon tedavileri kullanın. Ancak, bu kombinasyonlar çoğu katkı, Birleşik etkinlik bireysel antibiyotik etkinliğini toplamı ile aynı olduğu anlamına gelir. Bazı kombinasyon tedavileri sinerjik: Birleşik etkinlik katkı daha çok daha büyüktür. Antimikrobiyal ilaç dirençli suşların büyümesini inhibe çünkü sinerjik kombinasyonları özellikle yararlıdır. Ancak, bu kombinasyonlar nadir ve tespit etmek zordur. Bu ikili bir şekilde test edilmesi için gerekli molekülleri sayısının çokluğu kaynaklanmaktadır: 1 milyon potansiyel kombinasyon 1.000 moleküllerin bir kütüphane bulunmaktadır. Böylece, çabaları molekülleri sinerji tahmin etmek için yapılmıştır. Bu makalede çakışma2 yöntemi (O2M) bilinen sinerjik küçük molekül çiftleri oluşabileceğini bizim yüksek-den geçerek yöntemi. O2M desen kimyasal genetik veri kümesinden gelen aşırı duyarlı her molekül sinerjik bir çift, ancak diğer molekülleri mutantlar tanımlamak için kullanır. Kahverengi laboratuvar mutant ama değil vahşi türü hücre büyümesini inhibe molekülleri yüksek üretilen iş ekran gerçekleştirerek bu büyüme fark patlatır. Laboratuar çalışma daha önce antibiyotik trimetoprim ve bu strateji kullanarak antifungal ilaç flukonazol ile synergize molekülleri tanımlanmış. Burada, yazarlar için birden fazla mikroorganizmaların değiştirilebilir roman sinerjik birleşimler için ekran için bir yöntem mevcut.

Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim ölçmek için yarı nicel bir yöntemdir. FICI, çıkış final skoru belirleyen bir ilaç kombinasyonu sinerjik (FICI ≤0.5) görülürse, Sigara-etkileşim (0,5 < FICI < 4), ya da antagonist (FICI ≥4.0). Şekil 1 bir dama tahtası tahlil uyuşturucu degradeler ayarlamak verilmektedir. Şekil 2 ortak sonuçlar gösterilmektedir. % 90 Büyüme inhibisyon daha az görüntülemek büyüme (mor wells) göz önünde bulundurun. Her şey bir tabak içinde OD600 ölçme sonra de biz hiçbir uyuşturucu kontrolü için her şey normale. Normalleştirilmiş bir değer ile bir şey > 0,1 (iyi denetimin OD%600 10) "olarak büyüme" attı. FICI puanları bağlı olarak iyi seçilmiş değişebilir; Biz en düşük fiyat FICI her tabağını veriyor iyi seçin. Bu iyi F9 (sütunlar sayılı, aydın satır) olurdu, Şekil 2A, bir FICI ile 0.07 =. Şekil 2BFICI iyi C3 hesaplanır (FICI = 1,0). Antagonistik etkileşim için olası en yüksek FICI puanı için bak. Şekil 2Ciçinde FICI hangi bir FICI 8.0 vermek iyi A1 hesaplanır.
En iyi tarama koşulları yanlış pozitif ekranından, zaman ve para tasarrufu sağlayan yüksek bir dizi engel olur. Sinerji tahmin mutantlar mantar Cryptococcus neoformansiçin optimize edilmiş, biz test giriş uyuşturucu (flukonazol), dört bilinen sinerjik sigara uyuşturucu (kafein, climbazole, trimetoprim ve brefeldin A) ve beş flukonazol'ın sinerjik ortakları (rifamisin, myriocin, nigericin, rapamycin ve FK506, tüm Chandrasekaran, S. ve ark. tartışıldı 18). O2M Analizi (Bölüm 1 ve 2), seçmeli olarak sinerji tahmin mutant hücreleri ama değil vahşi türü hücre büyümesini inhibe için bilinen synergizers beklediğimiz ile bu moleküller keşfetti. Beklenen büyüme fark en üst düzeye çıkarmak için en çok hangi sub-inhibitory konsantrasyonları her küçük molekül için bir dizi test.
Örnek sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir. Sinerjik flukonazol, brefeldin A, Inhibe vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant büyüme ile sadece biraz hareket etmez bir molekül ve yaklaşık aynı miktarda. Rifamisin (Şekil 3B), sinerji tahmin mutant (cnag_03917Δ) büyüme inhibe ama vahşi-türü hücre büyümesini değildi. Böylece tarama için timepoint bu aralıkta 32 ve 49 s sonrası aşılama arasında en büyük büyüme fark oldu. Büyüme eğrileri diğer sinerjik ve sinerjik olmayan moleküller rifamisin ve brefeldin A, sırasıyla andıran.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig1.jpg"> Resim 1 : Adım 3 dama tahtası tahlil tasviri. Test ilaç ve giriş uyuşturucu degradeler gösterilmiştir A ve B, anılan sıraya göre. Son tahlil plaka C. olduğu gibi görünmesi gereken <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig2.jpg"> Resim 2 : Grafiksel dama tahtası tahlil sonuçlarını. Çizimleri sinerjik, hiçbiri, ve antagonistik etkileşim tasvir içinde A, B ve C, sırasıyla. <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig3.jpg"> Şekil 3 : Tarama zaman tanımlamak için örnek veri. (A)vahşi-türü (yeşil) ve sinerji tahmin mutant (mavi), brefeldin A, küçük bir molekül huzurunda flukonazol ile synergize değil bilinen yetiştirilen C. neoformans . Vahşi-tipi kumanda (koyu yeşil) ve tedavi ilaç (açık yeşil) sinerji tahmin mutant denetim (koyu mavi) ve tedavi ilaç (açık mavi) büyüme benzer bir fark var. Rifamisin varlığında, küçük bir molekül flukonazol ile synergize bilinen yetiştirilen (B) vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant. Vahşi-tipi kumanda (koyu yeşil) ve tedavi ilaç (açık yeşil) sinerji tahmin mutant denetim (koyu mavi) ve tedavi ilaç (açık mavi) daha küçük bir büyüme fark var. En büyük fark, bilinen sinerjik molekül için 48 h görülmektedir ve fark, o zaman noktasında bilinen sinerjik molekül için benzer. <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu zor ve zaman alıcı ampirik olarak tanımlamak oluşur. Burada, belirlenmesi ve sinerjik küçük moleküller doğrulama yöntemi açıklanmaktadır.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K Görüntüleme.  University of Utah. Sinerjik uyuşturucu zor ve zaman alıcı ampirik olarak tanımlamak oluşur. Burada, belirlenmesi ve sinerjik küçük moleküller doğrulama yöntemi açıklanmaktadır.

Video: High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...