Manuel Zimmer erkekler ile kullanmak için adapte oldu ilk tasarım dosya ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum; Frank Schroeder sentezi ve ascr 3 temini için; Ross Lagoy için fikir ve görüntüleme ve çözümleme ile ilgili yardım için; ve bu el yazması gözden geçirme için ana imalat ve kim, Laura Aurilio Christopher Chute, yanında bulunmuştur. Ulusal Sağlık Enstitüleri grant 1R01DC016058-01 (js), Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET 1605679 (D.R.A.) ve Burroughs Wellcome kariyer Ödülü, bilimsel arabirimi (D.R.A.) altında bu iş için fon sağlanmıştır.

1. cihaz imalat Not: bkz: başvuru 1.
 Not: silikon ana kalıpları fabrikasyon SU-8 fotorezist silikon ana 1 , 7 desenlendirme için standart photolithographic teknikleri kullanarak. Photomasks gofret desenlendirme için 25.000 dpi çözünürlükte basıldı. 19 bağlantı noktası yükleme, M. Zimmer (özel yazışmaları, 2016) elde edilen bir tasarım adapte solucan bir değişiklik ile tasarım erkek adapte aygıt özellikleri Chronis koku çip. Bir dönüş hayvanlar dönüşü kontrol için bulunur. Bağlantı noktası Kanal yükleme solucan genişliğini için 50 mikron daralmış. Tüm kanallar 32 mikron uzun boylu vardır. Silikon ana kalıp kullanıcı için kullanıma hazır olduğunda, kullanıcı sonraki takip edebilirsiniz, protokol 1 daha önce açıklandığı gibi.
<ol><li>Mix PDMS temel ve kür Ajan ağırlık tarafından 10:1 oranında.</li>
	<li>Karıştırın iyice transfer Pipetler ile.</li>
	<li>Tüm görünür kabarcıklar kaldırılana kadar 1s için bir vakum desiccator karışımı degas.</li>
	5 mm kalınlığında (100 gr) kadar <li>bir silikon kalıp yöneticisinde bir 150 mm çapında çanak üzerine karışımı dökün. Herhangi bir kabarcıklar veya karışıma ortaya konan toz kaldırmak için bir Pasteur pipet kullanın.</li>
	<li>İçin en az 3 h ya da bir gecede 65 ° C'de pişirin.</li>
	<li>PDMS neşter kullanarak kalıp uzak kesmek ve ayrı aygıtlar ayrı bir jilet kullanarak kesti.</li>
	<li>1 mm dermal yumruk ile giriş ve çıkış delikleri yumruk.</li>
	<li>Sifonu dH ile delik 2 O, etanol ve parçacıklar yumruk kaldırmak için tekrar dH 2 O ile. Bir hava akışı darbe cihazda kuru.</li>
	<li>Temiz kanal taraf ve yapışkan bant, toz ve başarılı bağ için izin vermek için cihaz üzerinde kalan enkaz kaldırma cihazın üst kısmında.</li>
	<li>Plazma-bond cihazın bir No 1 kapak cam kanal tarafı aşağı,.
	<ol><li>Maruz kapak cam ve aygıt (kanal-tarafına kadar) 100 W 30 gibi uygun bağ için izin koşulları kullanarak hava plazma s veya 24 W 60 s. 
		Not: Ayarları bağ etkinliğini artırmak için ayarlanabilir. Plazma-bağ koşullar bağ etkinliğini artırmak çalışırken uygun temizlik olarak kritik değildir. Yeterince temizlenmiş bir aygıt, hatta ideal plazma koşullar altında bağ değil.</li>
		<li>İle 5 için başparmak aşağı cam kanal yan aygıt ve basın üzerine ters çevir s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Arabellek hazırlık <ol><li>Dilute 1 x S Bazal (100 mM NaCl ve 0,05 M KPO 4, pH 6.0) steril 10 x stoktan.</li>
	<li>Tüm çözümleri arabellek için 1 M tetramisole hisse senedi 1 S Bazal x 1 mM son bir konsantrasyon için oranında seyreltin.</li>
	<li>Fluoresein için her iki ekleyin &#34; akış denetimi &#34; ve &#34; tampon &#34; rezervuarlar.
	<ol><li>Fluoresein 100-mg/mL stokunun 1 x S Bazal oluşturun.</li>
		<li>Hisse senedi için akış denetimi 1 µg/mL ve 0.1 µg/mL arabellek son konsantrasyonları sulandırmak.</li>
	</ol></li> <li>Uyaranlara oluşturmak.
	<ol><li>Son konsantrasyonu 1 m 1 X S Bazal seyreltik gliserol.</li>
		<li>Seyreltik ascaroside #3 (ascr 3) 1 µM son bir konsantrasyon 1 X S Bazal içine için.</li>
	</ol></li></ol> 3. Aygıt Kurulumu Not: bkz: 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> şekil 1. Mikrosıvısal aygıt ayarları. (A) rezervuar ve boru. 30 mL şırınga olmadan bir dalgıç olarak hizmet veren &#34; rezervuar. &#34; bu üç akış seçenekleri ile bir radarı Vana bağlı olduğu. Diğer mikrosıvısal cihaza baðlanýr tüp takılı olduğundan bir iğne (turuncu) için bağlı olduğu sırada bir çıkış pompası, 3 mL şırınga bağlıdır. (B) genel deneme Imaging mikrosıvısal kuruluşu. Cihazın objektif lensler üzerinde bir ters epifluorescence mikroskop bir sahnede yer alıyor. &#34; Akış denetimi &#34; arabellek seyahatleri ile belgili tanımlık tertibat üstünde rafta bir birimi tarafından kontrol edilir bir 3-yollu vana. Arabellek içeren satırların sonra uygun aygıt bağlantı noktaları eklenir. (C) mikrosıvısal aygıtının bağlantı noktalarını. &#34; Akış denetimi &#34; bağlantı noktaları diğer giriş bağlantı noktalarını yan: &#34; uyarıcı &#34; ve &#34; tampon &#34; bağlantı noktaları. &#34; Çıkış &#34; en sağdaki port limanıdır. Solucan yükleme arena, konumu nedeniyle &#34; yükleme solucan &#34; Merkez-çoğu bağlantı noktası aygıt üzerindeki bağlantı noktasıdır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3 mL şırınga ve iğne ( şekil 1A) olduğu gibi de radarı Vana bağlı ile 3-yönlü radarı Vana, 30 ya da 60 mL şırınga ekleyerek <ol><li>hazırla üç sıvı su depoları. İğne mikrosıvısal aygıta uzanan boru bağlanmak ( şekil 1A olduğu gibi -B).</li>
	<li>Hava kabarcıkları rezervuar ve boru çıkarın.</li>
	<li>1 S Bazal x ile ekli boru ile 3 mL şırıngaya doldur ve prize takın limanda</li>
	<li>Arabellek giriş delikleri üst kısmında görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.</li>
	<li>Akış denetimi, arabellek ve uyarıcı boru uygun giriş delik bağlantısı ( şekil 1B olduğu gibi -C), her iki yükleme noktasındaki sıvı damla mevcut sağlama delik ve bağlanmak tampon tüp.</li>
	<li>Yine yavaşça damlacıkları bağlantı noktası giriş yükleme solucan görününceye kadar çıkış bağlantı noktasına bağlıysa şırınga basınç uygulamak.</li>
	<li>Limanda yükleme solucan içine sağlam bir engelleme çiviyi yerleştirmeden</li>
	<li>Şırınga çıkış bağlantı noktasından çıkarın ve ev vakum (-670 Torr) bağlı çıkış satırına ekleyebilir.</li>
	<li>Kontrol aygıtı akışında herhangi bir kabarcık açısından kanalları, görsel ve fotoğraf makinesi ile uyumlu bir yazılım yoluyla video onay aracılığıyla, kullanılan açık kaynak yazılım Mikro-yemlik gibi. Adım 6 mikro-Yöneticisi'ni kullanma hakkında ipuçları için bkz:.
	<ol><li>Herhangi bir kabarcıklar varsa beklemek onları çıkarmak veya PDMS absorbe duvar herhangi bir hayvan önce yükleme; kabarcıklar varlığı sıvıların uygun akış aygıtı aracılığıyla rahatsız edemeyecek.</li>
	</ol></li> <li>GFP filtreyi kullanarak onaylamak uygun akış dinamiği içinde belgili tanımlık aygıt yükleme 3-yollu vana aktüatör ve arabellek geçiş gözlemleyerek solucan önce.
	<ol><li>Belirleme uygun akış dinamikleri: akış denetimi ve tampon çözümlerinde mevcut floresein gözlemlemek ( şekil 2B -2E) denetim basarak akış denetimi değeri değiştiğinde değiştirme 3-yollu vana Vana bağlantısını ( şekil 1B) karşılık gelen düğmeyi.</li>
		<li>Mikro-Yöneticisi'ni açtıktan sonra tıklayın &#34; Live &#34; cihazın canlı bir görüntü gözlemlemek için. Cihazın arabellekleri akışını Floresan ışık kaynağı açın ( şekil 2B -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Resim 2: Bir erkek adapte mikrosıvısal koku çip. (A) akışını desenleri solucan maruz kaldığında cihazın tampon. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. Bağlantı noktası yükleme solucan solucan yönlendirme daha iyi kontrol için sağlar bir eğri eklemek için uyarlanmıştır. (B) akışını desenleri solucan için uyarıcı maruz kaldığında cihazın. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. (C) ölçümleri fabrikasyon olarak adapte cihazın. Bağlantı noktası yükleme solucan, erkek genişliği için tasarlanmış bir 50 µm kanal açılarak bir 42 µm biter. Ölçülen Kanallar tasarımı 25 µm hedef rağmen 32 µm yüksekliğidir. (D-E) A tuzak erkek ifade p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 organizatörü kül özgü değildir ve hiçbir kalsiyum geçişler ASI tespit edildi, ancak bazı ifade ASI nöron gözlenen. (E) sadece floresan ise (D) alan parlak ve floresan aydınlatma, bir arada görüntüdür. Ölçek çubukları 42 µm. (F) ASH nöron tepki 1 M gliserol stimülasyon ile sağlam sinirsel aktivite gösterir. Mavi alanı 1 M gliserol uyarıcı zamanı gösterir. Gölgeli bölge n ile standart hatasını gösterir yedi solucanlar dan 20 bakliyat =. Kırmızı izler depolarize yanıt-e doğru göstermek. Axes ΔF/F 0 göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 4. hayvan hazırlık Not: bkz: başvuru 23.
<ol><li>1 M gliserol yanıtlarını görüntüleme kül.
	P sra-6 için olumlu <ol><li>yer yaklaşık 20 C. elegans erkek:: GCaMP3 dizi ifade nematodunun büyüme orta (NGM) agar plaka üzerine numaralı seribaşı OP50 E. coli çim ile. Floresan GECI ifade ve/veya bir ortak enjeksiyon marker dizi pozitif hayvanların tanımlanması için kullanın. 
		Not: Dizi olumlu hayvanlar kullanılan GECI göre belli (Yani, hayvanlar GCaMP ifade bulabilsem yeşil mavi ışık stimülasyon altında lebomm hayvanlar kırmızı yeşil ışık stimülasyon altında belli iken). Ortak enjeksiyon işaretçileri GFP ve RFP, gibi floresan diğer proteinler gibi rol-6, fenotipik işaretleri alanı kullanılabilir veya pha-1 mutasyon 28 gibi baskın bir fenotip kurtarabilirsiniz.
		<ol>Eğer hemen tahlil önce çekme genç yetişkin erkekler toplama <li>. Gün önce tahlil, L4 larva erkekler cevap.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>1 µM ascr 3 CEM yanıtlarını görüntüleme.
	<ol><li>Çekme yaklaşık 20 L4 C. elegans erkekler (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); onu-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dsRed ortak enjeksiyon marker ifade için olumlu. 
		Not: dsRed ray nöronlar içinde erkek masalı gözlemlemek ve GCaMP ifade dört CEM nöronlar içinde daha onaylamak daha kolay ifadesidir.</li>
		<li>İzole hünsa görüntüleme deneme yapmadan önce bir çim OP50 E. coli için 5-14 h seribaşı NGM agar tabakta gelen bu erkek. 
		Not: en az 5 h için izole değil erkek davranışsal ascr 3 yanıt vermeyen ve bu nedenle ascaroside için burada görülmektedir daha bile az kalsiyum geçişler sergileyebilirler.</li>
	</ol></li></ol> 5. Hayvan yükleme Not: bkz: refefence 1.
<ol><li>Standart solucan bakım teknikleri kullanarak bir seribaşı NGM agar plaka üzerine bir solucan seçin.
	<ol><li>Çekme solucanlar bakteri çekme üzerine toplama (düzleştirilmiş Platin tel yapılmış) bir çekme, alev ve &#34; dabbing &#34; almak için bir solucan. Yavaşça solucan kapalı, kendi tarama izin yeni plaka üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Plaka sular altında olacak yaklaşık 5 mL 1 x S Bazal seribaşı plakasına eklemek.</li>
	<li>1 x S Bazal ile önceden doldurulmuş oldu bir yükleme şırınga (Yani, 3 mL şırınga ile ekli boru) içine belgili tanımlık kurt çizin.
	<ol><li>Solucan değil sonuna kadar içine şırınga, sadece tüp içine emmek için emin olun. 
		Not: solucan şırınga geçerse, yakın olduğunu onu geri içine tüp imkansız.</li>
	</ol></li> <li>Çıkış radarı kapak kapatarak akışını durdurmak için vakum kapatmak.</li>
	<li>Sağlam iğneyi limanda yükleme solucan engelleme kaldırma</li>
	<li>Açmak böylece bu havalandırma ( şekil 1B) çıkış bağlantı noktasına bağlı radarı Vana. 
	Not: bir canlı video solucan yüklenirken konumunu ve yönünü hayvan (Adım 5.8-5.13) onaylamak için kullanın.</li>
	<li>Limanda yükleme solucan tüpüne yükleme solucan Ekle</li>
	<li>Solucan yükleme kanalda görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.</li>
	<li>Solucan kuyruk-ilk kanal başlanır, solucan kanal girmesini önlemek için şırınga pistonu üzerinde çekin.</li>
	<li>Uygulama ve baş kanal ilk girene kadar basınç ters arasındaki geçiş.</li>
	<li>3'lü radarı kapak kapatarak vakum atmosfer yerine vakum açmak için çıkış noktasına bağlı açık.</li>
	<li>El ile yönlendirmek ve arabellek akışı kanal, ama henüz maruz öyle ki solucan kafa yerleştirmek için şırınga dalgıç tarafından iç karartıcı baş serbestçe taşıyabilirsiniz basınç uygulayın ( Şekil 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Uyarıcı ve satın alma <ol><li>bir açık kaynak mikroskobu yazılımını kullanarak, mikro-Yöneticisi gibi tarafından esir alma imge: 10 kare/s Mavi ışıklı uyarma kullanarak TIFF yığını olarak kaydetmek (470 nm) 30 s.</li>
	<li><ol><li>Açık 100 Bayan için ana menüsünde pozu ayarlamak &#34; çok D alma. &#34; yazılım ana menüden. Ayarla &#34; numarası &#34; için &#34; 300, &#34; ve &#34; Aralık &#34; için &#34; 0. &#34;'ı tıklatın &#34; edinme! &#34; video kazanmaları.</li>
	</ol></li> <li>Uygula 10 s nabzı satın alma başlatılıyor sonra uyarıcı 5 s. İstediğiniz gibi uyarıcı uygulama süresi ayarlamak.
	<ol><li>5 edinme sonra s video, değiştirme uyarıcı test edilen hayvan uygulamak için akış denetimi arabellek kontrol 3-yollu vana. Vana bağlantı ( şekil 1B) en sol düğmesini.</li>
		<li>Sonra 10 s uyarana maruz kalma (Bu sefer ayarlanabilir kullanıcı tarafından istediğiniz gibi), yine Vana linke en soldaki düğmeye basarak akışı arabellekleri alter.</li>
	</ol></li> <li>Kayıt sadece 30-s pencere temele dönmek GECI Floresans izin vermek için tamamlanana kadar tampon altında.</li>
	<li>İstediğiniz şekilde yineleyin. Bekle 30 s edinme sonu ve sonraki deneme inisiyasyon arasında.</li>
</ol> 7. Görüntü analizi <ol><li>dosya ImageJ penceresine sürükleyerek açık kaynak yazılım ile ImageJ, TIFF yığın açın.</li>
	<li>İmleç kullanarak tıklatın ve faiz (ROI) faiz nöron çevresinde bölge ayarlamak için sürükleyin. Faiz (olduğu gibi şekil 3A) nöron soma içerecek şekilde bölgesi ayarlayın.</li>
	<li>Aç'ı tıklatarak yığınları arasında yatırım Getirisi floresan yoğunluğu z yığını arsa-&#62; görüntü - &#62; yığınları - &#62; z ekseni profil çiz.</li>
	<li>Tıklama &#34; listesi &#34; açılır penceresinde. Düzenle-'yi &#62; değerleri kopyalamak için Kopyala. Değerleri Yapıştır bir elektronik tablo programına.</li>
	<li>GCaMP ifade içermeyen solucan bir bölgeye yatırım Getirisi sürükleyerek her darbe için arka plan Floresans analiz.</li>
	<li>Arka plan Floresans nöron floresan yoğunluğu değerinden çıkararak her darbe için arka plan çıkarma gerçekleştirmek.</li>
	<li>ΔF/F 0 her darbe her çerçeve için hesaplamak.
	<ol><li>Olarak yatırım Getirisi için ilk 1 ortalama yoğunluk değerini hesaplamak F 0 s satın alma (Örneğin, çerçeve 1-10).</li>
		<li>ΔF/F 0 faiz çerçeve arka plan düşülen değeri hesaplanan F 0 değerine göre bölerek hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Görüntüsü her nöron ve her uyarıcı darbe için yineleyin.</li>
	<li>Nöronlar ile tutarlı yanıt profilleri, ASH gibi tüm darbeleri her neuron için ortalama ve SEM (olduğu gibi şekil 2F) hesaplamak için.</li>
	<li>Her neuron için zaman içinde SEM ile ortalama ΔF/F 0 arsa. 
	Not: Bu durumda, bu heatmaps her deneme de bireysel nöronal tepkilerin dahil etmek yaygın uygulamadır. Kalsiyum geçişler tekrarlanan elektrodlar arasında uyarıcılara maruz üzerine tutarlı değişiklikler sergi değil nöronlar, veya farklı kişiler 23, bireysel darbe izlemeler (olarak göstermek için daha uygun olabilir şekil 4). Ayrıntılar için tartışma verilerin nasıl görüntüleneceğini belirleme bkz.</li>
</ol>

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li>
<li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm+chips%3A+Microtools+for+C.+elegans+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li>
<li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li>
<li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023(2016).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neuro%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).</li>
<li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li>
<li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li>
<li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+Lon%22%5BJournal%5D)">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li>
<li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li>
<li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+male%3A+postembryonic+development+of+nongonadal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li>
<li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons%3A+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_transformationmicroinjection/transformationmicroinjection.html">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>García, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li>
<li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescent+%26%2334%3Blipofuscin+granules%26%2334%3B+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The autofluorescent &#34;lipofuscin granules&#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li>
<li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Erkek adapte koku çip bir dönüş yönünün daha fazla denetim ve erkek C. elegansverimli yakalama sağlar daha dar bir yükleme limanı içine içermektedir. Bu z-istifleme için gerek kalmadan nöronal ikili çift sol ve sağ üyeleri görselleştirme sağlar. Bu eğri bir solucan zamanında yönünü dikey %100 uzak nerede sadece bir ikili çift kül (şekil 2B-E)29,30gibi floresan bir marker ile hedef yol açar. Ancak, nöronal sınıfları gibi CEM, dört Radyal simetrik nöronlar ile tüm dört nöronlar görünür zaman sadece üçte biri. Başka bir üçüncü test solucan var sadece üç dört nöronların görünür ve üçüncü kalan için sadece ayırt fark değil-sol asimetri (veri gösterilmez) dorsal ve ventral hücre organları arasında. Dar bağlantı noktası solucan dalgalanma z ekseni önlemek için daha düşük bir kanal yüksekliği ile birleştirilmiştir. Bu tasarım erkek görüntüleme için gelecekte sağlar çalışmaları, hangi, erkek connectome25,31sürekli artan bilgi ile birleştirildiğinde, daha iyi seks özel sinirsel işlevini anlamak için izin verir.
Floresans nöron ilgi içinde değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım ImageJ bu protokol için gerçekleştirilen çözümlemesini kullanır. Geçerli tasarım ile 1 mM tetramisole arabellek etkili solucanlar felç ediyor ve hareket görüntüsü nöronların engeller. Hareket önlenebilir değildir veya kullanıcı bulduğumuz kullanımı istemiyorsa, daha karmaşık izleme komut dosyaları7taşırken bu nöronlar izlemek yazılmalıdır. Etkili bir şekilde yükleme limanı ve gliserol gibi son derece caydırıcı bir uyarıcı görüntülendiğinde kısıtlı için çok küçük olduklarını ancak, bu protokol için erkek solucanlar sadece gitmenizi sağlar. Bu durumlarda bile, hareketin kısa ve izleme ayarlar büyük miktarda gerektirmez — bir yatırım Getirisi yeni nöron konumu ayarlama yanlış floresan dökümanları (Şekil 2) azaltır.
Bir tek-solucan, tuzak tabanlı görüntüleme saat1' de tek bir solucan yansıması kısıtlamasıdır. Başka bir bu tuzakları solucanlar cihaz içindeki sıkışmış almak kısıtlamasıdır tıkanmış için aygıtları ve "kadar kullanılan" sadece birkaç solucan görüntüleme sonra neden. Ancak, yeni aygıtları ana kalıp imalatı için hızlı gerçekleştirme süresi bu zararı azaltır. C. elegans32,33duyarlilik ikna etmek için genişletilmiş mavi ışık aydınlatma da gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı görece kısa deneysel zaman dilimi (30 s) ölçülebilir photobleaching olmadan görüntüleme sağlar. Ancak, photobleaching ve daha uzun deneylerde duyarlilik önlemek için ışık kaynağının pulsed7olabilir. Örneğin, her 100 ms pozlama sırasında ışık 10 Bayan bu artan vücut autofluorescence saat7üzerinde ortadan kaldırmak için gösterilmiştir için Geniş puls.
Düzgün erkekler için ascarosides yanıtlarını sınamak için larva sahne 4 (L4) erkek ilk hünsa, en az 5 h için gelen Feromonlar23saf yakınındaki yanıt elde etmek için izole gerekir. Bu süre boyunca daha az yalıtım hayvanlar için ascarosides yanıt vermek başarısız olmasına neden olabilir. Ancak bu yalıtım gliserol gibi sigara ascaroside yardımlar sınarken gerekli değildir. Ancak, tutarlılık uğruna, hayvanlar her zaman kalsiyum görüntüleme için izole en az 5 s önceden vardı. CEM gibi bazı nöronların her stimülasyon nöronal yanıt temin ve yanıt her CEM öyle bir belirli "sinirsel gösterimi kod" oluşturmak için yapar. CEM bu fenomen Elektrofizyoloji çalışmaları, yanı sıra kalsiyum olanlar burada23açıklandığı gibi çalışmalar Imaging ile gözlenmiştir. Böylece, her ascaroside maruz hayvan nöronlarda CEM ölçülebilir kalsiyum geçişler23garanti edilmez. Aslında, birçok tarihi için soruşturma ascarosides ölçülebilir kalsiyum geçişler13,15,34,35temin değil. Ölçülebilir geçişler başarılı yaşla feromon iki faiz (şekil 3) ascaroside için maruz beş hayvanların üç darbeleri yalnızca biri sırasında gözlendi. Bu daha önce diğer labs23' gözlenen başarı oranı ile eşleşir. Bu değişkenliği feromon yanıt okurken bir kısıtlamadır ve bu iletişim kuralı erkek tabanlı odak nedeniyle değil.
Ascarosides yanıt olarak elde edildi kalsiyum geçişler soruşturma zaman, bir daha da soruşturma olmadan tutarlı yanıt alınamaması göz ardı değil. Bu nöronal bir sınıf içinde değişken yanıt onaylamak için Elektrofizyoloji çalışmalar gibi deneyler yoluyla test edilebilir. ASH gibi nöronlar için bu güvenilir, tutarlı yanıt alınamaması hataları uyarıcı kontrolü gibi daha büyük deneysel sorunların göstergesi olabilir yanıt. Değişkenlik yanıtta beklenen yanıt-e doğru tepe yoğunluğunu da araştırılması. İzleri standart sapma veya standart hata (olduğu gibi şekil 2F) ile çizilebilir. Standart sapma küçükse, izlerini çizilen ve bu nedenle analiz. Orta standart sapmalar lider değişimi fark tutarı ise, veri olabilir Cevabıyla yanıt yanıt değişim göstermek için "tip" göre heatmaps eşlik eden ile aynı çizilen. Önemli değişim (şekil 3), neyin doruklarına cant dağıtılacak Gauss bir şekilde, eğer yanıt-e doğru yanıt "türleri" (Örneğin, kutuplarını, hyperpolarizing veya sigara polarize) kategorize edilebilir23. Belirli bir "türü" düşmek yanıt çizilen ve birlikte analiz. Benzer şekilde, heatmaps de bu analiz eşlik etmeli.
İleride, bu aygıt yükleme limanı daha da daraltarak larva sahnelenen nematodlar görüntüleme için izin vermek için adapte edilebilir. Daha fazla yükleme limanı sonuna daralma hayvan kısıtlaması için sadece kirpikler duyusal nöron hücre gövdesi aksine görüntüleme için izin vermek için izin verir. Diğer cihazlar daha yaygın olarak okudu hermafrodit için tasarlanmıştır, bu adapte koku çip erkek sinir devreleri sinirsel aktivite görüntüleme sağlar. Erkek connectome hala aydınlatılmamıştır, seks özel ağlar neural dynamics ölçmek için güçlü olmak tamamen nöronal sinyal anlamak için önemlidir. Hermaphroditic ve erkek yanıt arasındaki farklar şimdi test edilebilir ve bu aygıtı kullanarak ölçülen.

Yuvarlak solucanlar C. elegans,-ebilmek var olmak deneysel olarak işlenmiş1gibi mikrosıvısal aygıtları tam kontrollü ortamlarda, artan erişim hayvanlar, neyin sağlar. Bu çalışmalar davranış deneyleri, kalsiyum görüntüleme çalışmaları veya hatta gösterimleri deneysel sonuçlar1,2,3,4daha kesin ölçümler sonucu belirli fenotipleri için dahil, 5,6. Havacilik hangi aracılığıyla detaylı deneyler reaktifler en az miktarda gerçekleştirirken çalıştırılabilir küçük ölçekli sıvı koşulları sağlamak. Yeni mikrosıvısal cihaz tasarımları sürekli üretim ve her kullanımı, sinirsel görüntülemede kullanılan aygıtları yakalamak doğal sinüsoidal hareketi C. elegans davranış deneyleri ve sinirsel görüntüleme çalışmaları için izin arenalar gelen değişir ve yüksek üretilen iş fenotipik analizde genetik4,5,6,7ekranlar için izin aygıtlara koku çalışmaları. Ana kalıp imalatı mikrosıvısal aygıt oluşturmak ucuzdur — efendi kullanılırlığı verilen — ve kullanımı kolay, bırakmak için hızlı veri üretimi ile yüksek-den geçerek çalışmalar. Fabrikasyon polimerler polydimethylsiloxane (PDMS) gibi kullanan aygıtların saat içinde yeni cihazlar yaratılması için izin verir.
Kalsiyum görüntüleme çalışmaları ifade hedef hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Turk) gerçek zamanlı8,9,10,11bu hücrelere sinirsel dinamikleri ölçmek için kullanın. C. elegans şeffaf doğası bu proteinler Canlı hayvanlarda floresan düzeyde kayıt sağlar. Geleneksel olarak, Turk yeşil flüoresan protein (GFP) üzerinde itimat-sensör GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), her ne kadar daha yeni çalışmalar daha iyi sinyal-gürültü oranı ve kırmızı kaymıştır uyarma profiller için izin vermek için bu sensörler adapte olması dayalı. GCaMP3 gelişimini, bu özellikleriyle proteinler çeşitli, GCaMP6s ve GCaMP6f gibi sensörler dahil olmak üzere (yavaş ve floresan kapalı-fiyatlar, sırasıyla hızlı), RFP-Calmodulin-M13 peptid (lebomm) yanı sıra, sahip olduğu kırmızı kaymıştır harekete geçirmek profil. Bu Turk C. elegans hücre özel gen organizatörü dizileri ile kombinasyonu ilgi, özellikle duyusal sinir hücreleri12,13,14,15 hücreleri hedef alabilirsiniz , 16.
Mikrosıvısal çalışmalarda C. elegans kullanım kolaylığı belirgin olsa da, hemen hemen tüm çalışmalar hünsa üzerinde odaklanmıştır. Erkekler sadece 0,01-0,02 için muhasebe rağmen vahşi türü nüfusunun %, çok değerli bulgular--dan onların karakterizasyonu çıkabilir. Hermafrodit sinir sisteminin fiziksel connectome tam on yıl17için eşlenen süre erkek connectome özellikle hayvan18kafa bölgesinde eksik, kalır. Kalsiyum görüntüleme erkeklerde kullanımı erkek sinir sistemi ve iki cinsiyetler arasında ortaya çıkan farklılıklar bir anlayış oluşturmak için yardımcı olacaktır. C. elegans Yetişkin erkekler daha küçük boyutu daha büyük hermoafroditler için tasarlanan geleneksel koku aygıt yükleme noktalarından etkili ve güvenilir yakalama engeller. Bu sorunu çözmek için Chronis koku çip19 değiştirilmiş bir versiyonu daha dar bir yükleme limanı ile alt kanal yüksekliği, geliştirilmiş ve ikili sol/sağ görselleştirme için izin (hangi hayvan döndürmek) solucan yükleme limanı, döner nöronal çiftleri. Bu tasarım izin verir: genç yetişkin erkekler (1 etkili bindirme, ikili eşleştirilmiş sinir hücreleri iki üye ve (3) erkek nöronlar sinirsel aktivite hassas görüntüleme görselleştirme için hayvan daha güvenilir (2) bir yönünü.
C. elegans erkek farklı hünsa daha için a değişiklik-in ascarosides (ascr) veya Yuvarlak solucanlar Feromonlar20,21,22,23 yanıt çalışmalar giderek, göstermek ,24. Bu nedenle, sinirsel dynamics ve temsilcilikleri erkek connectome içinde bir anlayış geliştirmek bile daha uygun oldu. Erkek C. elegans içeren 87 seks özgü nöronlar hermafrodit25,26' da yok içinde connectome olarak değiştirme-henüz belirlenmemiş yolları. Bu benzersiz sinirsel dinamikler resim edememek bizi daha iyi seks özel yanıt ve sinirsel ifadeleri anlamak izin verir.
Bu iletişim kuralı bir erkek adapte koku çip erkek C. elegans sinirsel görüntüleme için açıklar chemosensation. ASH, güvenilir bir şekilde 1 M gliserol için erkeklerde, önceki ile tutarlı hermaphroditic yanıt nosiseptif nöron27çalışmalar. Ascarosides maruz gerektiren test edilecek hayvanlar daha çok sayıda hayvan hayvan, değişken olan yanıt-e doğru çıkarmak. Erkek özel CEM nöronların yanıt daha önce Elektrofizyoloji ve çalışmalar, Imaging kalsiyum degisken ascaroside #323için yanıt vermek için gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Soft Tubing</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Hard Tubing</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425&quot; OD x .500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>3 mL syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Used as buffer reservoirs.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator Control System LF-5 Plasma System</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Desicator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm inner diameter.</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipettes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Model Number: 1500E.</td></tr><tr><td>60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Illumination Adaptor</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>3-way valve for controlling flow.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&amp;reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [p&lt;em&gt;sra&lt;/em&gt;-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 line</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[p&lt;em&gt;pkd&lt;/em&gt;-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; &lt;em&gt;pha&lt;/em&gt;-1(e2123ts); &lt;em&gt;him&lt;/em&gt;-5(e1490); &lt;em&gt;lite&lt;/em&gt;-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Reservoir&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>To create a Reservoir: A &quot;30 mL syringe&quot;, is connected to a &quot;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&quot;, which is connected to a &quot;3 mL syringe&quot; and a &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot;. The &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot; is then inserted into &quot;Soft Tubing&quot; approximately 1/3 of the way down the needle.</td></tr></tbody></table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

Kalsiyum göstergeleri kullanımını büyük ölçüde sinirsel dinamikleri ve yönetmelik anlayışımızı geliştirmiştir. Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans, tamamen eşleştirilmiş sinir sistemi ve şeffaf anatomi, kalsiyum göstergeler kullanarak gerçek zamanlı sinirsel dynamics anlamak için ideal bir model sunar. Mikrosıvısal teknolojileri ve deneysel tasarımlar ile birlikte, hem ücretsiz taşıma ve kapana kısılmış hayvanlarda kalsiyum görüntüleme çalışmaları bu göstergeler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, içinde Chronis ve ark., açıklanan koku çip gibi yakalama aygıtları kullanan en önceki çalışmaları olarak daha az yaygın erkek hem morfolojik ve yapısal olarak daha yaygın hermafrodit olarak kullanılmak üzere tasarlanan aygıt var birbirine benzemeyen. Adapte bir koku çip tasarlanmıştır ve genç yetişkin hayvanlar kullanarak erkek nöronal görüntülemede verimlilik artışı için fabrikasyon. Bir dönüş hayvanlar döndürmek için ve 2D görüntülemede ikili bir çift bireysel nöronlar ayrılması için izin vermek için bağlantı noktası yükleme solucan içine dahil oldu. Solucanlar propil mikrosıvısal aygıt içinde kontrollü bir akış önceki hermafrodit çalışmalarda açıklandığı gibi maruz kalır. Kalsiyum geçişler sonra açık kaynak yazılım ImageJ kullanarak analiz edilir. Burada açıklanan yordamı erkek tabanlı C. elegans artan miktarda için izin vermelidir çalışmalar seks özgü nöronal sinyal verme mekanizmaları bizim anlayış derinleştirilmesi, Imaging kalsiyum.

Genel aygıt kurulum örneği şekil 1A-Bgörülebilir. Şekil 1A uygun rezervuar inşaat ve kurulum gösteriyor. Şekil 1B mikrosıvısal aygıt depolar bağlantılarını gösterir. Şekil 1 c ile netlik için etiketli bağlantı noktalarını ayrı ayrı bir mikrosıvısal aygıtı gösteriyor.
Yükleme limanı eğrideki erkek adapte mikrosıvısal aygıt tasarımını içerir, ancak akış dynamics Chronis tarafından tasarlanmış alet aynı ve ark.19(şekil 2A-2 C). Akış Arabellek hangi akış kontrol vanası açık değiştirerek kontrol edilebilir (şekil 2A-2B). Fabrikasyon olarak ölçümleri tasarlanmış dosyasından değişir. Şekil 2C içinde sağlanan ölçümleri "gibi uydurma" ölçüleri vardır.
Erkek adapte koku aygıt, onların yerleşim ve yönlendirme yanı sıra kanal akış dinamikleri erkek C. elegans yükledikten sonra alan parlak ve floresan görüntüleme ile doğrulanabilir (şekil 2B-2E). Nosiseptif nöron, ASH, 1 M gliserol için GCaMP3 ifade solucanlar pozlama Floresans kül nöron, sinir aktivitesinin (şekil 2F) gösterge içinde görünür değişiklikleri sonuçlanır. Floresans ince değişiklikleri gözle görünür olmayabilir, ama yazılım bu değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Ücretsiz ImageJ yazılım analiz ve kül nöronlar 1 M gliserol maruz üzerine floresan yoğunluğu zaman içinde (şekil 2F) ölçmek için kullanılabilir. Bu hünsa27 ' deki ve gliserol kül nöronal cevaben sağlamlığı nedeniyle gözlenen için benzer, bu test tüm hayvanlarda görülmektedir.
Aksiyel veya dönme hareketi az miktarda kez video analiz (şekil 3A) sırasında bir nöron izleme algoritma gerektiren unparalyzed hayvanlarda bekleniyor. Bazı hayvanlar (~ %10) hala denemeler sırasında hareket olsa da (Örneğin, 1 mM tetramisole) arabelleklerindeki bulduğumuz eklenmesi bu etki neredeyse ortadan kaldırır. Bu tarafından atlatılabilmişlerdir: (a) kullanarak daha verimli bir şekilde sıkışıp kalırlar; büyük erkekler (b) genişlik veya bağlantı noktası daha da yükleme solucan kalınlığı azaltmak; veya (c) de kullanılan paralitik veya başka bir felç kullanarak konsantrasyonu artan. Bu da orada değil çok fazla kafa tuzak sonu geçmiş ve koku kanal maruz sağlayacaktır. Bir deneme solucan hareketi ile ortaya çıkarsa, alan analiz taşındı ve sonra hareketi (şekil 3B) oluştuğu çerçeve başlayan yeni nöronal konumundan yeniden okumak. Sinirsel izlemeler kullanıcı tarafından el ile yeniden inşası bu örnekte gerekir. Bu nöron içindeki floresan değişikliklerini çözümlemek ve19da yazılabilir hareket ederken nöron'ın merkezi takip komut dosyaları.
Erkek C. elegans çekici biyojenik Feromonlar dört seks özel CEM nöronlar23üzerinden ascarosides denilen hissediyorum. Kalsiyum geçişler erkeklerde gözlendiğinde, şekli, işaret ve büyüklüğü nöronlar ve hayvanlar (şekil 4A-B) arasında değişken yanıtlardır. Ancak, Feromonlar erkek yanıt olarak güvenilir birçok hayvan (şekil 4 c) kalsiyum geçişler olarak görülmektedir değil. Çoğu ascarosides kalsiyum geçişler hissi13,14,15üzerine temin değil gibi bu cesaret kırıcı, değil.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig3.jpg"> 
Şekil 3: adresleme solucan hareketi sırasında görüntü edinme dönemi. (A)ΔF/F0 (floresan yoğunluğu ortalama arka plan floresan yoğunluğu için ilk 1 bölü değiştirmek s Alım) nerede faiz nöron 1 için güvenilir bir şekilde statik bir alanı tanımlayarak ImageJ kullanarak hesaplanan s. (Mavi alanı), uyarıcı darbe sırasında hayvan taşındı, kalsiyum izleme yukarıdaki resimlerde görüldüğü gibi artık analiz alanı (sarı kutu) içinde bulunan nöron sonuçlanan. Ölçek çubukları 42 µm. kesik çizgiler Haritayı her görüntüde solucan konumuna karşılık gelen izleme bölgesi belirtmek. (Alan analiz nöron duruşma sırasında takip etmek taşıdıysanız ve bireysel izleri gerçek sinirsel dynamics iletmek için yeniden oluşturulurB), izleme hayvan kımıldamadı gibi görünür. Kesik çizgiler solucan hareket için düzeltilen izleme bölgesi göster. Hem kül nöronlar, sol ve sağ için izlemleri (yakın (kırmızı) ve ASHR (mavi), sırasıyla) gösterilir. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig4.jpg"> 
Şekil 4: Erkek C. elegans CEM 1 mikron ascr 3 yanıttır değişken. Erkek özel CEM nöronlar biyojenik Feromonlar için yanıtının benzersiz desenler görüntüler. (A)her CEM nöron bir darbe için bir duyarlı hayvan gözlenen yanıt gösterilir. Dört CEM nöronlar vardır: dorsal sağ (CEM DR), dorsal sol (CEM DL), ventral sağ (CEM VR) ve ventral sol (CEM VL). Üç dört nöronların ile değişen şekli ve büyüklüğü, depolarizations dördüncü ascaroside için yanıt vermiyor ile yanıt. (B) yaklaşık 1 / 3 (2/7 Bu çalışmada test) kapana kısılmış hayvan sonuç sadece üç nöronlar yansıması mümkün. Bir solucan bu yönde tepkiler ilk solucan gözlenen farklı CEM kalsiyum geçişler sonuçlandı. CEM DR hem yönelimleri görünür ve hayvanlar arasında değişken yanıt sergileyen bu solucan yönünü değişikliği nedeniyle değildi. (C) birçok solucan yok (5/7 test bu çalışmada) herhangi bir tespit kalsiyum geçişler ile yanıtla. Gösterilen bireysel temsilcisi görüntüleri araziler yukarıda gösterilen tek hayvanların izleri. ,ölçek çubukları göstermek 42 µm. izlemeler: 1 mikron ascr 3 pozlama zaman mavi alanı gösterir. Kırmızı izler depolarizing tepki gösterir. Siyah izleri gözlenen yanıt göstermek. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons at JoVE.com

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.1K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Video: Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Nörobilim

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ta Uçucu Seks Feromon Yanıtlarının Ekstraksiyonu ve Miktarının Belirlenmesi

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Erkek C. elegans Davranışı Üzerindeki Uçucu Seks Feromon Etkisinin İncelenmesi

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Davranış

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma