Alex L. Kolodkin&#39;e teşekkür ediyorum, laboratuvarımdaki bu dolgulu hazırlık protokolünü öğrendim. Teknik yardım için Young Gi Hong&#39;a da teşekkür ediyorum. Bu çalışma NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlık <ol><li> 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS ilave ederek t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) Ve en az 30 dakika boyunca karıştırma. 4 ° C&#39;de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve çözeltiyi temiz bir şişeye koyun. </li><li> 2.5 mL% 16 stok paraformaldehid solüsyonu ve 1 mL 10x PBS&#39;den 6.5 mL deiyonize suya 10 mL% 4 paraformaldehit yapın. 4 ° C&#39;de saklayın ve bir hafta içinde kullanın. DİKKAT: Son derece toksik olduğu için paraformaldehit çözeltisiyle cilt temasından kaçının. </li><li> 1 mL DMSO&#39;ya 0.1 g X-Gal substrat eriterek X-gal substratını (dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki% 10 a / a vivo X-Gal) olun. -20 ° C&#39;de 100 uL&#39;lik alikotlar halinde saklayın. </li><li> X-Gal boyama çözeltisi, 10 mM fosfat tamponu (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] ve% 0.3 t-Oktilfenoksipolietoksietanol. Karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> % 30 stok hidrojen peroksit 1: 10&#39;u deiyonize su ile seyrelterek% 3 hidrojen peroksit çözeltisi yapın. </li><li> 1 tablet (10 mg) DAB&#39;yi 35 mL taze PBT solüsyonunda tamamen eriterek 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) solüsyonu yapın. 0.2 μm şırınga filtresi ile filtre edin ve 910 μL alikotlar halinde -20 ° C&#39;de saklayın. DİKKAT: DAB&#39;yi yok etmek için tüm DAB atıklarını çamaşır suyuna atın. </li><li> Elma suyuyla yumurta plakaları yapın. 2 L&#39;lik bir şişeye 35 g agar ve 1 L deiyonize su ilave edin. 1 L&#39;lik bir şişeye 33 gr sükroz, 2 gr tegosept ve 375 mL elma suyu ekleyin. Otoklav ile 30 dakika boyunca eritin. Her iki çözeltinin de 60 ° C&#39;ye kadar soğumasına izin verin. Birleştirin ve karıştırarak bu çözeltileri iyice karıştırın. 60 mm&#39;lik kültür çanağı başına 11 mL&#39;lik birleşik çözelti dökün. </li><li> Ekmek mayasının harmanlanarak maya yapıştırın.Iyonu giderilmiş suya (1: 0.8 oranına) sokun ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyonu (1. Gün) <ol><li> Genç kadın ve erkek sinekleri (5 günden daha genç) toplayın ve 1-2 gün boyunca, merkezde az miktarda maya macunu içeren bir yumurta plakalı (60 mm x 15 mm) plastik bir beher kafes içinde muhafaza edin. </li><li> Geç evre-16 embriyolarının optimum koleksiyonu için, yaklaşık 5 PM&#39;de sinekler (&gt; 50) olan bir şişe kafesi kurun ve 3 saat boyunca 25 ° C&#39;de yumurta bırakmalarına izin verin. </li><li> Sinekleri taze bir yiyecek şişesine aktarın. </li><li> Kapaklı yumurta plakasını kapatın ve gece boyunca 25 ° C&#39;de nemli bir inkübatör (~% 70 nem) içinde inkübe edin. </li></ol> 3. Bağışıklama için Embriyoların Hazırlanması (2. Gün) <ol><li> 10:20 civarında yumurta plakasına 1.8 mL PBT solüsyonu ilave edin ve eğinirken embriyoları plakadan gevşetmek için pamuk çubuklarını kullanın. Not: Bir kottan geçirerek maya hamurunu hafifçe ezerekÜzerinde çok miktarda embriyo bulunması durumunda çözülür. Embriyoların toplanmasına 40 dakika önce başlayın (11: 00 civarında). </li><li> 1 mL pipet ucu kullanarak yumurta plakasından embriyoları 1.5 mL&#39;lik bir mikrotube&#39;ye aktarın. </li><li> Embriyoların yerleşmesine ve PBT özümünü olabildiğince aspire etmesine izin verin. Embriyoları iki kez 1 mL PBT çözeltisi ile durulayın. PBT çözümünü olabildiğince aspire. </li><li> Tüp 1 mL% 50 ağartma maddesi ( yani, deiyonize suda seyreltilmiş) ile doldurun ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika süreyle bir nutatorda inkübe ederek embriyoları dechorionate edin. Not: Bu adım, delinmiş embriyoları öldürmez. </li><li> Dechorionated embriyoların çökmesine izin verin, mümkün olduğu kadar% 50 çamaşır suyu aspire edin ve embriyoları 3 mL PBT solüsyonuyla 3 kez yıkayın. </li><li> 0,5 mL heptan ilave edin ve sonra saat 11:00 civarında RT&#39;de 0.5 mL% 4 paraformaldehid solüsyonu tüpün üzerine ilave edin. </li><li> Kuluçkaya yatırRT&#39;de 15 dakika süreyle bir besleyici üzerinde embriyolar. </li><li> % 4 paraformaldehit solüsyonunu (alt tabaka) çıkarın. </li><li> 0.5 mL% 100 metanol ekleyin ve embriyoları, tüpü 30 saniye şiddetle sallayarak devitellellize edin. </li><li> Heptanı çıkarın ( örn . Üst katman). </li><li> 0.5 mL% 100 metanol ilave edin ve tüpü 10 saniye şiddetle çalkalayın. </li><li> Tüpe dokunarak embriyoların yerleşmesini bekleyin ve metanolü olabildiğince aspire edin. Embriyoları 10 mL&#39;den daha az süreyle sallayarak 1 mL% 100 metanolle durulayın. Not: Metanole artan maruz kalma, β-Gal aktivitesini yok eder. </li><li> Metanolü çıkarın ve 1 mL&#39;lik PBT çözeltisi ile 3 kez devitellize edilmiş embriyoları durulayın. </li></ol> 4. LacZ Boyama Kullanarak Embriyoların Genotiplendirilmesi (2. Gün) <ol><li> Tüp 1 mL PBT çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C ısı bloğu veya su banyosu tüp inkübe edin. </li><li> Kuluçka sırasında, X-Gal boyama solüsyonu (1 mL / dakika)Olmak) 65 ° C&#39;de bir su banyosunda bulanık olana kadar. 37 ° C su banyosunda inkübe edin. </li><li> PBT solüsyonunu aspire edin ve 1 mL X-Gal boyama solüsyonu ve 20 uL X-Gal substratını tüp üzerine ilave edin. </li><li> Mavi bir çökelti belirinceye kadar, tüp 37 ° C&#39;de nutrasyonla inkübe edin. Not: Genel olarak 2. ve 3. mavi dengeleyiciler için kuluçka süresi 2-4 saat arasındadır. </li><li> X-Gal boyama çözeltisini çıkarın ve 1 mL RT PBT solüsyonuyla embriyoları 3 kez durulayın. </li><li> Bir iğne probu veya forseps kullanarak, istenilen genotip embriyolarını ( örneğin, lekelenmemiş beyaz embriyolar) hafif bir kesit mikroskopu (1.6X-2.5X hedefler) ile elle sıralayın. Not: CyO, aktin-LacZ ve TM3, aktin-LacZ gibi bazı mavi dengeleyiciler, aktin promotörünün kontrolü altında bakteriyel β-Gal (LacZ) eksprese eden transgenik bir yapı taşıdıklarından, embriyolar maviye boyalı olarakBir veya iki kopya mavi dengeleyici kromozom. Bu nedenle, lekelenmemiş beyaz embriyolar arzu edilen öldürücü alel için homozigot olurlar. </li></ol> 5. Embriyoların Anti-Fasciclin II Antikorları ile İmmunotainedasyonu (2. Gün - Gün) <ol><li> 1 mL&#39;lik bir pipet ucu kullanarak, istenen genotip embriyolarını ( yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) 0.5 mL&#39;lik bir mikro tüpe toplayın ve aktarın. Not: Bu adımda, embriyolar, kabuk makinesinin bölümleme şekilleri ve kafa ve kuyruk 9&#39;un yapıları da dahil olmak üzere morfolojik kriterlere göre kabaca aşamalandırılabilir. Kafa involüsyonu sırasında, yumurtalar atıldıktan 10 ila 16 saat sonra embriyo, en ön segment 9&#39;da belirgin bir azalmaya uğrar. </li><li> Embriyoları bir kez 0.4 mL PBT solüsyonu ile yıkayın ve 0.3 mL engelleyici solüsyon (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu ve% 5 DMSO) ilave edin. </li><li> RT&#39;de 15 dakika boyunca nutasyon ile embriyoları bloke edin. </li><li&gt; 75 uL anti-Fasciclin II antikoru ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında tübü nutasyonla inkübe edin. </li><li> Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın. </li><li> Keçi anti-fare-HRP antikoru (2 ug / mL) içeren engelleyici solüsyonun (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu) 0.3 mL ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka ile tübü inkübe edin. </li><li> Embriyoları, yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 6 kez yıkayın. </li><li> Tüp 0.3 mL DAB çözeltisi ekleyin. DİKKAT: Eldiven takın ve tüm DAB atıkları / tüpleri / uçları çamaşır suyuna koyun. </li><li> 2 μL% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve istenen miktarda çökelti oluşana kadar RT&#39;de nutasyonla tüpü karanlıkta inkübe edin. Not: Genellikle 1D4 immünhistokimyasının kuluçka süresi 0.5-1 saat arasında değişir. </li><li> Embriyoları 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın. DİKKAT: DAB özümünü ve ilk iki yıkamayı bir pipet ve di ile çıkarınOnları çamaşır suyu ile çöpe atın. </li><li> Tüpe 0.2 mL% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de saklayın. Not: Tüpü ışıktan uzak tutun. Embriyoları% 90 gliserol / PBS solüsyonu 10 koyarak daha net preparatlar elde edilebilir. Bununla birlikte,% 70 gliserol / PBS solüsyonu 10&#39;da temizlenenlerden% 90 gliserol / PBS solüsyonu ile temizlenen embriyoları incelemek daha zordur. </li></ol> 6. Embriyoların Evrelendirilmesi, Kesilmesi, Monte Edilmesi ve Görüntülenmesi (4. Gün) <ol><li> Evreleme için,% 70 gliserol / PBS ile dengelenmiş embriyoları bir cam slayta aktarın. </li><li> Abdominal segment 7 (A7), A8 ve A9 ISN sinirleri birbirine değmek veya / ve orta virüslerden üç banda bölünmüş yakın evre-16 embriyolarını toplayın. Not: 1D4 antikoru ile lekelenmiş embriyolar, ISN ve ISNb motor aksonlarının izdüşüm modellerine dayanarak düzenlenebilir. CNS&#39;den çıktıktan sonra A7, A8 ve A9 ISN neGeç evre-16 embriyolarının rfleri birbirine değmek için birleşir ve daha sonra dorsal kaslara kadar genişlemek için ayrılırlar ( Şekil İA&#39;daki ok ucu). Bununla birlikte, orta-evre-16 embriyolarında, A7 ISN sinirleri A8 / A9 sinirleri ile paralel uzanır ( Şekil 1B&#39;deki köşeli parantez). Buna ek olarak, her iki hemizyondaki A6 ISNb sinirlerinin (ventrolateral kaslara dik olan) projeksiyon eksenleri, MSS longitudinal akson fasiküllerinin posterior ucu ile hizalıdır (oklar ve Şekil 1C&#39;deki bir çizgi). Bu morfolojik kriterler, farklı genotipler arasında biraz değişir. Alternatif olarak, embriyolar bağırsak morfolojisi 9 , 11 temel alınarak yapılabilir. 17 no&#39;lu evreye kadar orta bağırsağın kalp benzeri bir şekli var, oysa orta bağırsak 17 no&#39;lu evreye göre üç gruba ayrılmıştır. </li><li> Embriyoları parçalayın. <ol><li> 1 m kullanmaL şırınga ile, her embriyo gliserol damlasının dışına alın ve embriyonun ventral yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Vücut uzunluğunun 1/4 ve motor aksonlardan arındırılmış en arka bölgede ön kısmı kesin. </li><li> Bir iğne probu kullanarak, uç kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dışarıya doğru çekin, sırt üste gelecek şekilde yönlendirin ve tarlaya yatay olarak yerleştirin. Not: Embriyo gliserol damlasının dışına taşındığında, embriyo ile ilişkili bir miktar gliserol yapışkan yapar. </li><li> Tek bir çok ince tungsten iğne 13 kullanarak dorsal orta hat boyunca embriyo kesin. Embriyonun arka ucunda küçük bir kesim yapın ve sonra anteriora doğru dorsal orta çizgiyi kesmeye devam edin; Ters yönde kesmek de iyidir. </li><li> Bir iğne probu kullanarak, orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasına getirin, sırt üste gelecek şekilde yerleştirin ve vücut duvarlarını ventrolateral (çapraz) yönde açarak gutu vücut duvarından ayırın (2.5X nesnel). Not: Dorsal orta çizginin tamamen kesildiğinden emin olun, böylece sağ ve sol vücut duvarları arasında tamamen ayrılır. </li><li> Orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dikkatlice ayırın ve daha sonra ince bir iğne probu (2.5X objektif) kullanarak vücut duvarının iki kapağını cam slayt üzerine yatırın. </li><li> Çok ince bir tungsten iğne kullanarak, iç organları parçalanmış embriyodan yana doğru iterek çıkarın (5X objektif). Not: Başka bir benzer diseksiyon prosedürünün daha ayrıntılı bir açıklaması web sitesinde bulunabilir 5 . </li></ol></li><li> Montaj için, temizlemek için iki kez% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve ince bir iğne probu kullanarak,% 70 gliserol / PBS solüsyonunun 8 uL&#39;sinin üzerine serpilen yeni bir cam slayt haline getirin. Merkez (2.5X objektif). </li><li> Bir lamel koyun (18 mm x 18 mm). Lamel kenarlarını düzenli tırnak cilasıyla sızdırmaz hale getirin (ya daAçık veya renkli iyi). </li><li> Üreticinin talimatlarına göre, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) ışık mikroskopu altında yüksek çözünürlükte (20X, 40X ve 63X yağ ile daldırma hedefleri) görüntü yakalama. Not: Özellikle ISNb motor aksonları için daha iyi görselleştirme ve fenotipik karakterizasyon, 63X yağ daldırmalı bir objektif kullanılarak üretilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

Yazar, rekabet eden finansal çıkarlarının olmadığını beyan eder.

Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dört temel rehberlik ipucu sınıfı, solucanlar, sinekler ve omurgalılar arasında evrimsel olarak rol oynamaktadır 20 . Yarıklar için reseptör görevi gören dolambaçlı (Robo) aile moleküllerinde, Drosophila Robo, ilk önce CNS 6 , 21&#39;deki itici rehberlik işlevine aracılık ettiği tespit edildi. Semalar, plexin içeren reseptör komplekslerine 22 bağlanan büyük bir rehberlik molekülüdür. Semas&#39;ın akson rehberlik fonksiyonuIlk çekirdeği CNS 14&#39;de keşfedildi. Daha sonra, sınıf 1 transmembran semaforisi Sema-1a, Drosophila&#39;da geniş olarak karakterize edildi . Sema-1a, sadece plexin A için bir ligand olarak değil aynı zamanda bilinmeyen bir ligand için bir reseptör olarak işlev görür, embriyonik sinirsel gelişim sırasında spesifik seçim noktalarında akson akson iticisinde önemli bir rol oynar ( 15 , 16 , 17 , 18 Şekil 2C ). Geçerli protokolde oluşabilecek birkaç genel sorun giderme adımları vardır. İlk olarak, 3.9-3.13 adımlarında, metanol devitellinizasyon prosedüründe çok küçük veya çok küçük embriyolar kullanılırsa, embriyolar düşük verimlilikle devitellinizasyona tabi tutulabilir. Bu durumda, adım 3.5&#39;te devitellinizasyon için sabit embriyoların 40-80 μL&#39;lik bir yatak hacmi kullanılması önerilir. İkinci olarak, stePs 3.9-3.13, bir sabitleyici olarak kullanılan metanol, β-Gal aktivitesini yok ettiğinden, metoda daha uzun süre maruz kalması durumunda zayıf X-Gal lekelenmesi veya tamamlanmamış heptan çıkarma olabilir. Bu durumda, adım 3.9-3.13&#39;te metanol kullanan devitellinizasyon prosedürünün mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirilmesi en iyisidir. Buna ek olarak, metanolde çözündürülmüş kalıntı heptan boyaya müdahale edebilir; Bu nedenle, adım 3.11-3.13&#39;te olabildiğince fazla metanol çıkarmak en iyisidir. Mevcut filleted hazırlama protokolü, motor akson yol bulma ve hedef tanıma ile ilgili yeni genleri tanımlamak için fonksiyon kaybı ve fonksiyon kazanma genetik ekranlarına uygulanabilir. Bununla birlikte, bu protokolün bir dezavantajı, filetlenmiş preparatların üretilmesi için sabit embriyoların ayrıştırılması oldukça zaman alacağından kaynaklanmaktadır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, aksonal projeksiyonların fenotipik karakterizasyonu, 1D4 ile boyanmış bir bütün olarak hazırlanmış bir embriyoda izlenebilirRyos, ancak bu yöntem çevredeki aksonal projeksiyonların düşük çözünürlükte görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, tüm montaj hazırlama protokolünün akson rehberlik genlerinin taranması için etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır 4 . Floresan işaretli embriyoların canlı diseksiyonunu kullanan alternatif bir protokol, son zamanlarda sistematik tarama için geliştirilmiştir 11 . Canlı diseksiyon protokolü fenotipik analiz için nispeten hızlı bir hazırlık sağlar 11 . Bununla birlikte, bu protokol, evre 17 11&#39;in başlangıcından daha eski embriyolar için yeterli değildir 11 . Burada açıklanan dolgulu preparat protokolü, protein antikorlarının farklı antikorlarla incelenmesi için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu protokol Drosophila embriyolarına çeşitli gelişim evrelerinde de uygulanabilir.

Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7&#39;nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 1 ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) 3 , 4 ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modellerinin çoklu görüntüleri web 5&#39;de mevcuttur. 1D4 antikoru, tüm motor aksonları ve üç uzunlamasına akson fasikülünü embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) orta çizgisinin her iki yanına etiketliyor </sUp&gt; , 6 ( Şekil 1C ve Şekil 2A ). Bu nedenle, FasII antikoru ile immünohistokimya, motor akson rehberlik ve hedef tanıma altında yatan moleküler mekanizmaları göstermek için nöromüsküler bağlantı için gerekli genlerin belirlenmesi için güçlü bir araç sağlar. Motor aksonlar, A2-A7 abdominal hemizasyondan her birinde, iki ana sinir dalına, segmental sinir (SN) ve intersegmental sinir (ISN) 2 , 4&#39;e ve küçük sinir dalına, transvers siniri (TN ) 7 . SN, seçici olarak, SNa ve SNc olarak adlandırılan iki sinir dalına neden olurken, ISN, ISN, ISNb ve ISNd 2 , 4 olarak adlandırılan üç sinir dalına bölünür. Bunların arasında ISN, ISNb ve SNa motor aksonGeç evre-16 embriyoları FasII antikoru ile boyandığında ve fileto edildiğinde ( Şekil 1C ve Şekil 2A ), projeksiyon desenleri en net şekilde görselleştirilir. ISN motor nöronları aksonlarını 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 ve 20 2 , 4 ( Şekil 2A ) dorsal kaslarını innerve etmek için uzatır. ISNb motor nöronları ventrolateral kasları 6, 7, 12, 13, 14, 28 ve 30 2 , 4&#39;te sinirlendirir ( Şekil 2A ve 2B). SNa sinir dalı yanal kasları 5, 8, 21, 22, 23 ve 24 2 , 4&#39;ü sinirlendirmek için projelendirir ( Şekil 2A ). İki motor aksondan oluşan TN, kas 25&#39;i sinirlendirmek için segmental sınır boyunca ipsilateral olarak projeler ve sinir sisteminde lateral bipolar dendritik nöron (LBD) ile sinapslar oluşturur.Çevre 7 ( Şekil 2A ). Bu hedef kas innervasyonları, spesifik seçim noktalarında motor aksonların seçici defasikasyonunu değil, aynı zamanda kasların tanınmasını da gerektirir. Buna ek olarak, ara hedef olarak işlev gören bazı varsayılan mezodermal kılavuz hücreler ISN ve SNa yolaklarında bulunmuştur, ancak ISNb yolu 4 boyunca bulunmamıştır. Bu, ISNb motor akson yol bulma yönteminin, ISN ve SNa motor akson rehberliğine kıyasla ayrı bir şekilde düzenlenebileceğini ve aynı zamanda periferik motor akson kılavuzluğunun, tek bir rehberlik işaretinin farklı veya korunmuş rollerini incelemek için çekici bir deneysel model sunduğunu gösterir Molekül 8 . Bu çalışma, Drosophila&#39;daki embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modellerini görselleştirmek için standart bir yöntem sunmaktadır . Açıklanan protokoller, 1D4 ile lekelenmiş sabit embriyolarınNtibody ile doldurulmuş ve filleted preparatlar için 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) işlenmiştir. Sabit embriyoların düz preparatlarının kritik bir avantajı, çevresindeki aksonal projeksiyonların ve kas modellerinin daha iyi görselleştirilmesidir. Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda istenen mutant embriyoları LacZ boyama yöntemini kullanarak sıralamak için sabit embriyoların genotiplendirilmesini de gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .

Sinir gelişiminde motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki kesin bağlantılar, seçici akson akson iticiliğine ve belirli seçim noktalarında hedef tanımaya bağlıdır. Drosophila&#39;da , motor aksonlar arasındaki seçici itme , Sema-1a, Sema-2a ve Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 dahil olmak üzere sınıf 1 ve 2 semaforinlerin (Semas) kombine eylemi tarafından kısmen düzenlenir . Bu nedenle, Sema-1a fonksiyonunun kaybı sıklıkla ISNb aksonlarının belirli seçim noktalarında defasikasyona uğramamasına ve dolayısıyla anormal derecede kalın bir morfolojiye ( Şekil 2C&#39;deki ok işareti) neden olur. Vahşi embriyolarda, en az 7 motor nöron uzanır ve aksonlarını fasikülize ederek benSNb sinir dalı ( Şekil 2A ). ISNb sinir dalı, kaslar 6 ve 7 arasında bulunan bir seçim noktasına ulaştığında, iki akson, ana ISNb demetinden seçici bir şekilde defasikleştirir ve daha sonra kasları 6 ve 7&#39;yi sinirlendirir ( Şekil 2B ). Kaslar 6, 13 ve 30 arasında bulunan bir sonraki seçim noktasında, başka bir üç motor akson, kasları 13, 14 ve 30 innerve etmek için seçici bir şekilde defasiküle eder ( Şekil 2B ). Geriye kalan iki akson kas 12&#39;nin kenarının yakınında bulunan son seçim noktasına ulaşmak için dorsal olarak uzanır ve böylece kas 12 ters yönde yönlendirir ( Şekil 2B ). Bu sonuçlar, açıklığa kavuşturulmuş hazırlama protokolünün motor akson rehberliği için gerekli genleri incelemek için yararlı bir araç olduğunu açıkça göstermektedir. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strOng&gt; Şekil 1: ISN ve ISNb motor aksonlarının izdüşüm modellerine dayalı embriyoların evrelendirilmesi. ( A ) Geç evre-16 vahşi embriyolarda, A7, A8 ve A9 ISN sinirleri (oklar) birbirlerine dokunmak üzere birbirlerine yaklaşırlar (ok başı). Ön sol ve ventral aşağı. Ölçek çubuğu = 15 μm. ( B ) Orta-evre-16 vahşi embriyolarda, A7 ISN siniri A8 / A9 sinirlerine (kare köşeli paralel) paralel uzanır. Oklar A7, A8 ve A9 ISN sinirlerini gösterir. Ön sol ve ventral aşağı. Ölçek çubuğu = 15 μm. ( C ) FasII antikoru ile lekelenen geç evre-16 vahşi embriyoların dolgulu hazırlanması. Sol ve sağ A6 ISNb sinirlerinin projeksiyon eksenleri (oklar) CNS longitudinal akson fasiküllerinin posterior ucu ile kabaca hizalıdır (siyah çizgi). Abdominal segmentler A1-A7 en üstte etiketlenmiştir. Anterior kaldı. Ölçek çubuğu = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">Savunma</a>Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> Şekil 2: Vahşi tipli ve Sema-la mutant embriyolarında motor akson projeksiyon modelleri. ( A - C ) FasII antikoru ile lekelenen geç evre-16 embriyoların dolgulu hazırlanması. Ön sol ve ventral aşağı. Her bir panelde temsil edilen aksonal projeksiyon modellerini gösteren şematik diyagramlar. Ölçek çubukları = 15 μm. ( A ) Vahşi embriyolarda A3 ve A4 olmak üzere iki sıralı abdominal hemizasyondan oluşan parlak bir alan fotoğrafı. MSS&#39;de üç bilateral simetrik longitudinal akson demetleri bulunur. ISNb, SNa, ISN ve TN motor aksonlarının normal innervasyon modelleri kutular ve çevredeki bir okla gösterilir. Arial kasları innerve eden lateral bipolar dendrit nöron (LBD), endikedirBir ok ucu ile Şematik diyagramda, ISNb (kahverengi), SNa (mavi), ISN (yeşil) ve TN (sarı) motor nöronlarının sinir dalları ve innervasyon kalıpları ve hedef kasları sunulmaktadır. CNS&#39;de bu motor nöronların hücre vücut pozisyonları da kendi renklerinde gösterilir. ( B ) Vahşi embriyolarda, ISNb aksonları numaralandırılmış olan ventrolateral kaslara projeksiyon yapar ve onları spesifik seçim noktalarında (DIC görüntüsündeki oklar) sinirlendirir. ( C ) Sema-1a fonksiyon kaybı mutantlarında, ISNb aksonları sıklıkla 6 ve 13 kasları arasında (DIC görüntüsündeki ok başı) birbirlerini defasik edemiyor. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila at JoVE.com

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Görüntüleme.  Chonbuk National University.  Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar. 

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...