Teknik destek için Robert Graffin ve Pauline Duhant için sana şükrediyoruz.

Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konsey direktifleri ile uyumlu hayvan için (2010/63/AB, 86/609/EEC ve 87-848/EEC) yapılan ve hayvan Etik Komitesi, üniversite Namur tarafından (etik proje n ° 17-284 kabul edildi ). Şekil 1 gösterir iki ilgili yaklaşımlar: transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne. Erkek C57bl/6J fareler kullanın (n = 18), 4 ay çalışma 3 yaşında.
1. CTB çözüm hazırlanması
<ol><li>Transdiaphragmatic enjeksiyon için:<ol>
<li>%0,2 (w/v) konsantrasyonu için steril su CTB iktidarda geçiyoruz.</li>
		<li>CTB çözüm (% 0,2 w/v) 7.5 µL bir steril 10-µL-microsyringe içinde her fare için ekli bir 33'lik iğne (künt veya kısa konik) yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transtorasik enjeksiyon için:<ol>
<li>Steril su konsantrasyonu % 0.1 (w/v) CTB iktidarda geçiyoruz.</li>
		<li>CTB çözüm (% 0,1 w/v) steril bir 500-µl-insülin şırınga 20 µL eğimli 27 lik bir iğne her fare için yükleyin. Not: distile ve steril su kullanmaya dikkat edin ve düzgün CTB toz geçiyoruz. Çözüm 4 ° C'de bir ay tutulabilir (değil dondurma). Birkaç gün sonra bir çökelti şeklinde. Çözüm oda sıcaklığına getirmek ve iyi bir pipet kullanmadan önce kullanarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intrapleural enjeksiyonu öncesinde hazırlık
<ol><li>Otoklav veya cam boncuk Sterilizatör kullanarak ameliyat öncesi cerrahi .aletleri sterilize. Bir temiz tezgah kat ameliyatı yapmak ve cerrahi araçlar imha etmek hazırlamak. Not: cerrahi işlem sırasında kullanılan herhangi bir malzeme steril olmalıdır. Microsyringe bir dezenfektan (klorheksidin) silmiş ya da olması gerektiği gibi sterilize cant araçlar tek sadece kullanımı. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin bodur) ile onu/onun ellerini yıkamalısın. Cerrah steril eldiven, bir sağlamlılık ve temiz bir elbise giymek gerekir.</li>
	<li>Hayvan tartmak ve anestezi uygun bir doz: anestezi kokteyl mayi enjeksiyon (örneğin ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg).</li>
	<li>Ayak çimdik ve/veya fare düzgün anestezi olup olmadığını belirlemek için palpebral refleks kaybı için kontrol edin. Kornea korumak için bir veteriner merhem uygulamak.</li>
	<li>Dikkatle ventral cilt (için transdiaphragmatic yordam) veya elektrikli saç kesme makineleri kullanarak sağ taraflı göğüs cilde (Transtorasik yordam), tıraş. İyi ve yeterince geniş saç cerrahisi alanına alma önlemek için tıraş.</li>
	<li>Aseptik koşullar traş alan üzerinde % 10 iyot çözümün topikal uygulama tarafından emin olun. Cerrahi sitesi çevre doğru sitesinin Merkezi'nden fırçalayın için dikkatli olmak iyot solüsyonu ile fırçalayın.</li>
	<li>Hayvanın vücut ısısını korumak için ameliyat homeothermic takımını kullanın.</li>
</ol>3. Intrapleural Transdiaphragmatic yaklaşımı kullanarak enjeksiyonları
<ol><li>Bir Isıtma yastığı sırtüstü pozisyonda imzalat fare yatırmak. Hayvan boyun altında bir haddelenmiş gazlı bez yastık yerleştirin. Yetişkin bir fare için bir haddelenmiş gazlı bez takımını 0,5 inç kalınlığında kullanın. Hareket varsa önlemek için ameliyat yönetim kurulu bu yastık teyp.</li>
	<li>Bir neşter bıçak kullanarak deşmek orta çizgi boyunca ventral Cilt: deri gerin için yanal diğer el ile cilt germe sırasında xiphoid işleminden göbek bölgesine bir kesi yapmak. Çok fazla baskı üzerinde bıçak temel organlara zarar görmesini önlemek için geçerli değildir.</li>
	<li>Küçük makas kullanırken, dikkatle cilt kesi çevresinde karın kasları bağlantısını kesin. Bu yordam, kasları ve ameliyat sonunda ayrı deri dikiş yardımcı olur.</li>
	<li>Laparotomi küçük makas kullanarak gerçekleştirin. Karın boşluğu bir ilik kesi abdomenden düzeyde gerçekleştirerek açın. Beyaz hattı boyunca karın kasları deşmek ("linea alba") xiphoid süreci kadar.</li>
	<li>Diyafram karın yüzeyine görselleştirmek için karın kasları ticari veya ev yapımı traktör kullanarak geri çek. Not: Bu makaralara MIDI-boyut ataç L-kanca19şeklinde yapılabilir.</li>
	<li>Laparotomi ve bantlar makaralara tezgah kat için aşağı her iki uzatmayayeltenmişti. Görüş alanı aydınlatma diyafram karın yüzeyine penumbra içinde daha fazla en iyi duruma. Bu amaçla en güçlü aydınlatma aygıtının yönlendirilebilir bir ışık demeti ile LED Lamba vardır.</li>
	<li>Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldırın ve karaciğer (şekil 2A) yan lobları çekin. Diğer elinde küçük makas kullanırken dikkatle kesin suspensory bağ safra kesesi veya diyafram (şekil 2B) zarar vermeden.</li>
	<li>Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldır. Öte yandan Hamilton şırıngada kavramak. Üç siteleri değil hemidiyafram sırasıyla sternal, kapsayacak şekilde yerleştirmeye medial ve krural bölgeler (şekil 3A,) şekil 3B' iç metin hedef.</li>
	<li>Diyafram kalınlığı 0.37 mm fareler7civarında, iğne en fazla 1 veya 2 mm ötesinde sırasında nefes akciğer zararları önlemek için diyafram sayfası eklemek. 2.5 µL CTB çözüm (% 0,2 w/v), her sitede (şekil 4B) doğru diyafram aracılığıyla teslim. Diyafram istikrar gerekli değildir.</li>
	<li>Üç Ipsilateral siteleri enjeksiyon (şekil 1A) ve contralaterally bir ikili PhMN havuzu etiketleme için bu yordamı yineleyin.</li>
	<li>Laparotomi sitesini kapatmak için 4-0 dikiş karın kasları ile tekrar Emilebilen dikiş. Kesintiye uğramış dikiş 3 mm. tarafından elyaf cilt aralıklı kullanım 9.0 mm yara klipleri ile kapalı. Zımba zımba çekerek hayvan önlemek için sıkın. Alanı yaklaşık 5 mm ayrı zımba. Bu Engelli şifa için açabilir gibi yara klipler, aşırı sıkın değil.</li>
	<li>Temiz mikro şırınga tıkanma distile su ile. Yavaş yavaş çizme ve sınırdışı 2 - 3 kez. Hava şırınga çekiyor mu.</li>
</ol>4. Intrapleural Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjeksiyon
Not: Bu yöntem fareler4 ' te açıklanan yordamı gelen ilham ve fare için uyarlanmıştır.
<ol><li>İmzalat fareyi sol yanal dekübitus getirin, bir Isıtma yastığı (şekil 4A) yatırmak.</li>
	<li>Altıncı ve yedinci kaburga dirsek bölgesi altında el ile palpasyonla (şekil 4B) tanımlayın.</li>
	<li>Asistan sağ ön ve arka bacaklarda (şekil 5A) genişletir iken, şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm derin (şekil 1B ve şekil 5B) aşağı eğim ile deri altında yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça, kaburgaları kaldırarak bu iyi göğüs boşluğuna (şekil 5C, insets içinde şekil 1B) içine konumlandırılmış onaylamak için iğne yükseltmek.</li>
	<li>Göğüs duvarı üzerinde iki parmak ile hafif basınç uygulayarak göğüs hareketleri nefes stabilize etmek.</li>
	<li>Şırınga diğer elinde tutarak, tek bir enjeksiyon CTB çözüm (% 0,1 w/v) 20 µL teslim.</li>
</ol>5. ameliyat sonrası bakım
<ol><li>İşlemden sonra hemen, fareyi sağ yanal dekübitus pozisyonda kurtarma için homeothermic bir yastık üzerinde yatıyordu. Bu plevral boşluğu sağ tarafta yayıldı izleme sağlar ve hayvanın nefes izlenmesi için izin verir.</li>
	<li>1 mL steril serum fizyolojik çözüm ı.p. subkutan yönetmek. Hayvan susuz ve/veya ilgisiz görüntülenirse takip enjeksiyon sağlar.</li>
	<li>Subkutan 0.1 mg/kg buprenorfin, yönetmek herhangi bir potansiyel ağrı en aza indirmek için ilk iki gün sonrası ameliyat sırasında günde iki kez. Not: Birçok kurum multimodal analjezi burada tasvir laparotomi gibi invaziv prosedürler için tavsiye ederim. Bu bir non-steroid anti-enflamatuar (NSAİİ) ilaç ve/veya lokal anestezik Ajan kesi yerinde kullanımı içerebilir. Bu ilaçlar genellikle kurmalı ağrı en aza indirmek için belgili tanımlık ilk kesme önce teslim edilir.</li>
	<li>Hayvanlar her gün ötenazi kadar izlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol yetişkin fareler herhangi bir zorlanma veya diyafram-PhMN devresi bütünlüğünü değerlendirilmelidir deneysel herhangi bir paradigma için uygulanabilir. Örneğin, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında (CSCI) PhMN kaybı, frenik akson ve sonraki solunum uzlaşma anterograd dejenerasyonu ile ilişkilendirilmiş koşullardır. ALS veya CSCI hayvan modelleri insan hastalıkları gözlenen histopatolojik ve fonksiyonel solunum açıkları taklit. Bu modellerinde, histolojik teknikler genellikle PhMN hayatta kalma şu PhMN neuroprotection18,20,21, yönelik çeşitli tedavi müdahaleler değerlendirmek için uygulanır. Herhangi bir sorun alımı, NMJ diyafram veya aksonal transport şüphesiz CTB nöronal hücre gövdelerinde birikmiş miktarını tehlikeye sokacaktır. Frenik aksonlar veya PhMN dejenerasyon kaybı belli ki omurilik CTB retrotransported miktarını azaltacaktır.
Her bir yaklaşım intrapleural idarenin kendi artıları ve inşaat Transdiaphragmatic enjeksiyonları laparotomi ve dikkatli yırtılması ve organ çıkıntı önlemek için tüm deri katmanları dikiş gerektiren oldukça invaziv vardır. Laparotomi ile normal solunum22 engelleyen ve bir PhMN aktivite veya retro-aktarım verimliliği etkileyebilir göz ardı edemeyiz. Ancak, diyafram doğrudan görselleştirme enjeksiyon sırasında başarılı plevral boşluğu her zaman hedefleme sağlar. Transtorasik iğne transdiaphragmatic enjeksiyonu için göre minimal invaziv ve böylece bir prosedür olarak arıtma için "Üç Rs" kavramı ven düşünülebilir. Bir dezavantajı olma artış olasılığı kapalı-hedef bir deneyimsiz kullanıcı için (örneğin subkutan doku veya göğüs duvarı).
İntrapleural floresan CTB yönetim herhangi bir motor nöron plevral boşluğu astar kaslar projelendirme, PhMN, interkostal motor nöronlar veya beyin sapı motor nöronların farklı topluluklarda da dahil olmak üzere etiketi olur ki olasıdır. De yetişkin, fareler, Mantilla vd. interkostal motor nöronlar da torasik spinal kord yanı sıra bazı dorsal kök gangliyon nöronlar4ventral boynuz etiketli gösterdi. Biz asla CTB etiketli hücreleri servikal spinal kord farelerde daha diğer sitelerdeki varlığı kontrol ettirin.
Bağlı olarak deneysel ayarları/modeller, sonuç ölçümleri PhMNs sütunlu yerleşimi boyunca servikal spinal kord, geometrik veri her PhMN konumu hakkında ayrıntılı çözümlemesi içerebilir veya, burada, PhMN miktar olarak açıklanan numarası. Toplam PhMN sayısı doğru değerlendirilmesi teknik konuları ve arası değerlendirici güvenilirlik bağlıdır; CTB floresan yoğunluğu, nöron soma boyutu veya arka plan boyama değişkenlik nedeniyle. Transdiaphragmatic enjeksiyonu CTB-fluorophore kullanarak deneyim, biz fare hemicord 120 ve 180 hücreler, biraz daha az veri diğer grupları8daha bir dizi arasında bir aralıktaki başına PhMN sayısı tahmini. Gerçekten de, çalışmanın iki sınırlamalar vardır. İlk olarak, sınırlı sayıda hayvan, Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjekte edilir ve ikinci bir belirsizlik PhMN havuzu tam etiketleme var. (Sonra sinir transeksiyon) frenik sinir daldırma veya floresan nöroanatomik izleyici ile intraneural enjeksiyonları tüm PhMNs daha doğru bir şekilde etiketlemek için kullanılan tamamlayıcı teknikler vardır. Gelecekteki çalışmaları için bu PhMNs saymak için stereology gibi tarafsız yöntemler tarafından tavsiye edilir.
Deneyim, biz asla herhangi bir bariz solunum eksikliği ya da karışıklık (solunum) kanama veya aşağıdaki yordamı pnömotoraks gibi gözlemledim. Ancak, diyafram transdiaphragmatic enjeksiyon sırasında zarar görmüş bir iğne daha küçük çaplı veya daha net eğim ile kullanmaya dikkat edin.
Hayvan ölüm sırasında veya ameliyat sonrası önlemek için dikkatli kokteyl anestezi her bileşenin konsantrasyonları kontrol. Karaciğer, bağırsak, safra kesesi veya diyafram yüzeylerin üzerine yaralanmaları yapmaktan kaçının.
Hayır ya da düşük PhMN etiketleme çeşitli sorunları nedeniyle olabilir. Transtorasik enjeksiyon plevral boşluğu kaçırırsa, yeniden yapmak ve kontrol tarafından el ile palpasyonla iğne kaburga altında eklenir veya yok dışarı deri yoluyla açılır. Hava kabarcığı yok CTB çözüm enjeksiyon oluşturmalıdır. Ayrıca sinir hücresindeki CTB içselleştirilmesi pH bağımlı23olan hatırlıyorum: asidik ve nötr pH en uygun temel pH toksin alımını azaltır iken. Bu CTB tozu su, tuz veya PBS arabellek resuspend için tavsiye edilir. Sebat sürenin nöronal hücre vücuttaki etiketli toksini. Deneyim, bir zaman penceresi dört gün ve iki hafta sonra intrapleural teslim arasındaki hücrelerde CTB etiketli tespit olabilir. Taşıma retrograd için ayrılan süreyi kısaltır veya zaman intrapleural teslimat ve kurban arasındaki artan floresan-CTB doku optimal algılama tehlikeye atabilir.
Önlemek için solma Floresans uygun sabitleştirici yöntemini kullanın. Biz hayvanın vücut tamponlu %4 paraformaldehyde ile Ventriküler öneririz. Bir kez omurilik hasat edilir, aynı sabitleştirici gecede kuluçkaya. Cryoprotect kablosu batan kadar 72 saat boyunca Sükroz % 30 çözümde sonra O.C.T. orta servikal büyütme (yaklaşık 8 mm) gömün. Kurutmak veya örnek parafin içinde gömmek değil. Omurilik örnekleri veya doku bölümleri ışıktan bütün sonrası işleme sırasında koruma. Sabit bütün spinal kordonlar saklamadığını 4 ° C'de aylardır thimerosal cryoprotectant çözüme eklenir mı (floresan solma tahrik edecek gibi sodyum azid eklemeyin). Doku bölümler-20 ° C'de ay ışıktan uzak tutulabilir. Son olarak, bir anti-solma reaktif slaytlarla takmak için tavsiye ederiz. Floresans soluk olan ise, immünhistokimya kullanarak CTB algılamak mümkün.

Çalışmanın amacı frenik motor nöronlar (PhMN) fare omurilik bölümlerinde tanımlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bir floresan nöroanatomik izleyici plevral boşluğunda enjeksiyon frenik akson boyunca retrograd taşıma frenik hücre organları etiketlemek için kullanın ve frenik nöromüsküler projeksiyonlar üzerine diyafram ulaşmak için Teslimat yöntemi olarak seçildi. İntrapleural teslimat iki teknikleri açıklanmıştır: Transtorasik karşı transdiaphragmatic.
Frenik motor nöronlar olan akson sonuçta diyafram innervate frenik sinir yakınsama spinal geçiş hücrelerdir. Bu alt motor nöronlar inspiratory sürücü dan bulber solunum merkezlerinin alma ve diyafram sinir-kas kavşak (NMJ) geçişi vardır. PhMN içine iki motor sütun, bir Servikal Omurga çalışan her hemicord için yapılandırılmış. Memeli tür insanlar dahil çoğunda, frenik motor sütunları C3 düzeylerinden C61,2,3' e yaymak. Biz ve diğerleri PhMN C3-C5 düzeylerinde fare ve fare omurilik4,5,6,7,8yoğunlaşmıştır doğruladı. Topografik dağıtım frenik hücre değil rastgele; motor nöronlar krural bölümü innerve daha Kaudal (C5)9ise motor nöronlar diyafram göğüs parçası innerve daha yoğun frenik tamirhanede (C3), kafatası parçası olarak dağıtılır. Ayrıca, PhMN kümelenmiş değişik ventral boynuz bu gri konuda. C3 düzeyinde frenik hücre kümeleri yanal yalan, daha sonra ventrolateral bir yönde kayması ve en Kaudal düzeyleri10,,11ventromedially bulunur.
Kendi hayati rol ilham sırasında göz önüne alındığında, bu doğru bir şekilde PhMN sağlıklı omurilik tanımlamak ama Ayrıca dejeneratif hastalıklar veya omurilik travmatik yaralanmalar gibi patolojik koşulları sırasında kendi kaderini takip için son derece önemlidir. Beri morfolojik servikal diğer motorlu neurons PhMN farklı değildir, PhMN tanımlaması nöroanatomik izleyicileri ya düzeyinde birincil solunum merkezleri8, ya da diyafram NMJ7 ya da hedeflenen teslimini kullanır frenik sinir4. İzleyici sinir lifleri tarafından alınan ve Servikal Omurga frenik hücre gövdelerinde kadar yapılan doğrudan veya dolaylı tespit sistemleri kullanarak görüntülenmeyecektir nerede. Retrograd veya anterograd izleyiciler ticari geniş conjugates bir ile mevcuttur. Önemli, her izleyici no ile donatılmış olan trans sinaptik izleme için düşük veya yüksek yetenekleri.
Mevcut çalışmada, Alexa Fluor (bundan böyle CTB-fluorophore da adlandırılır) 555 ile functionalized kolera toksini (CTB) beta altünitesi floresan bir etiket olarak PhMN donmuş omurilik bölümlerinde doğrudan bir görselleştirme izin seçtik. Deneysel verilerin bir transneuronal geçit12göstermek eğiliminde olmasına rağmen CTB genellikle monosynaptic bir izleyici tanımlanır. CTB GM1 gangliosid sinir biten plazma zarı bağlamak için yeteneğine sahiptir. CTB clathrin bağımlı - bağımsız mekanizmaları ve trans-Golgi ağ üzerinden trafik üzerinden bir retrograd moda13,14endoplazmik retikulum içine içselleştirilmiş. İçselleştirilmesi ve retrograd taşıma bağımlı aktin sitoiskeleti15,16 yanı sıra Mikrotubul ağ17gibi görünüyor.
CTB kullanışlılığı diyafram-PhMN devresi etiketleme retrograd nöroanatomik izleme aygıtı olarak göstermek CTB-fluorophore intrapleurally teslim edildi. CTB yönetilen iki teknikleri kullanarak: İlki dahil laparatomi ve birden çok transdiaphragmatic iğneleri; İkincisi, daha az invazif bir benzersiz Transtorasik iğne kullanılır. Dört gün sonra fluorescently etiketli PhMNs servikal spinal kord her iki sağlıklı ve spinally yaralı (C4) hayvanlardan sayılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Frenik motor nöronlar servikal motor nöronlar en memeli türlerinde C6 düzeylere C3 kaynaklanan vardır. Aksonal projeksiyonlar solunum diyafram innerve frenik sinir gidiyor. Spinal kord dilimler halinde frenik motor nöronlar diğer motor nöronlar üzerinde morfolojik veya biyokimyasal ölçüt üzerinden tanımlanamıyor. Biz fare, bir fluorophore Birleşik kolera toksini alt birim beta (CTB) aşağıdaki intrapleural enjeksiyonu frenik motor nöron hücre gövdelerinde görüntülenmesi için yordamlar açıklamasını sağlar. Bu floresan nöroanatomik izleyici diyafram nöromüsküler kavşak yakalanmış, retrogradely frenik akson yapılacak ve frenik hücre cesetleri ulaşmak için yeteneği vardır. İntrapleural CTB teslimat iki metodolojik yaklaşım karşılaştırılır: Transtorasik iğne karşı transdiaphragmatic. Her iki yaklaşımın başarılı ve frenik motor nöronlar CTB etiketli benzer sayıda neden. Sonuç olarak, bu tekniklerin görselleştirmek veya bu diyafram frenik devre üzerinde duruldu gibi çeşitli deneysel çalışmalar frenik motor nöronlarda ölçmek için uygulanır.

Erkek C57bl/6J fareler (n = 18), 4 ay 3 yaşlı çalışmaya dahil edildi. Denemenin gün 0, 8 fareler yayımlanmış protokolü7,18göre bir tek taraflı C4 kontüzyonu, sağ taraflı uygulandı. Sham prosedür olarak C4 üzerine bir laminektomi kontüzyonu olmadan 10 fareler uygulandı. Gün 3, fareler CTB-fluorophore intrapleural enjeksiyonu için yukarıda açıklanan iki farklı yordamlara göre hazırlanmıştır. Gün 7, tüm fareler anestezi euthanized (ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg) ve kan kaybı.
Bütün spinal kordonlar, paraformaldehyde ve cryoprotected içinde % 30 Sükroz standart laboratuvar yordamlara göre sabit hasat edildi. Servikal genişleme, O.C.T. ve cryosectioned boyuna veya transversally 30 µm kalınlığında katıştırılmış izole edildi.
Uzunlamasına omurga bölümleri Floresans analiz için filtre küp ile donatılmış bir epifluorescent mikroskobu ile gözlendi (uyarma: 560/20nm; Emisyon: 635/30nm). Ventral boynuz floresan motor nöronlarda doğrusal sütun C3 hücre C5 düzeyleri (şekil 6A, üst panel) olarak tespit edilmiştir. Tüm etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji (şekil 6B) motor nöronlar ile tutarlı sergiledi. Yaralı hayvanlarda etiketli PhMN çarpıcı bir kaybı ile birlikte spinal doku bozulması (yıldız şekil 6A ve 6 C) C4 düzeyde gözlenmiştir. CTB+ PhMNs el ile (150 µm tarafından aralıklı) her beşinci enine bölümünde zarar görmemiş ve C4 yaralı spinal kabloları (şekil 6C) sayıldı. Bir tahmini etiketli PhMNs toplam sayısı 5 tarafından sayılan CTB+ hücre sayısı çarpılarak hesaplanır. Zarar görmemiş sağlıklı farelerde etiketli PhMNs hemicord başına toplam sayısı 151 ± 9 transdiaphragmatic (TDia) yaklaşım, 178 ± 9 Transtorasik (TTho) yaklaşımı (şekil 6D) kullanarak karşılaştırıldığında kullanırken tahmin edilmiştir. C4 yaralanma bu rakamlar sırasıyla 59 14 ve 70 ± ± 10 düştü. Bu çalışmada, intrapleural teslim iki yöntem arasında istatistiksel fark kanıtlanan (p > 0,05, Mann-Whitney U testi; TDia TTho karşı).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig1.jpg"> Şekil 1. Transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne kullanarak Intrapleural enjeksiyonları. Transdiaphragmatic yaklaşımı laparatomi, pozlama diyafram (pembe renkte) karın yüzey ve üç iğne göğüs, medial ve krural bölgelerde Aiçerir. Transtorasik yaklaşım için fareyi sol yanal dekübitus bulunduğu atıldı. Altıncı ve yedinci kaburga altında dirsek bölgesi manuel palpasyonla Btarafından tanımlanır. İğne deri, subkutan doku, göğüs kasları, interkostal kaslara ve plevral boşluğu (Asteriks) ulaşmak için parietal plevra eklenir. Lar, göğüs; m, medial; c, krural; S/SC, deri ve subkutan doku; TM, göğüs kasları; IC, interkostal kaslara; PP; parietal plevra; L, akciğer. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig2.jpg"> Şekil 2. Karaciğer, safra kesesi ve diyafram karın karşısında bir görünüm ile cerrahi alan. A. safra kesesi ve diyafram arasında suspensory bağ unutmayın. B. belgili tanımlık kiriş dikkatli bir şekilde kesilir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig3.jpg"> Şekil 3. Görünümü diyafram '. Sternum (s), medial (m) ve krural (c) alanlarında doğru hemidiyafram tanımlanır. A. krural bölge için karaciğer LOB posterior olduğuna dikkat edin. B. CTB plevral boşlukta enjekte için iğne 1 mm sağ hemi-diyafram ile derin ekleyin. Orta alanda enjeksiyon olduğunu resimli. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig4.jpg"> Şekil 4. Transtorasik yaklaşım. Fare sol yanal dekübitus Aiçinde yer alıyor. Diyafram ve dirsek bölgesi kostal marjı tanımlayın. B. altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig5.jpg"> Şekil 5. Altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. A. genişletilmiş ön ve arka bacaklarda. B. şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm eğim ters ile interkostal kasları ile derin altında eklenmiş. C. iğneyi yavaşça yükselmiş ve kaburga iğne göğüs boşluğuna iyi konumlandırılmış onaylamak için kalkar. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig6.jpg"> Şekil 6. Ventral boynuz gri madde intrapleurally enjeksiyonlu fare hücrelerinde CTB+ . A. spinally yaralanmamış fare, C5 için servikal spinal kord düzeyinde C3 gelen boyunca CTB+ frenik motor nöronlar dağıtın. Berelenmiş fare, doku bozulması CTB+ frenik motor nöronlar C4 düzeyinde (Asteriks) kaybı ile tek taraflı olarak görülmektedir. B. CTB+ etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji motor nöronlarile tutarlı sergiledi. C. spinal iplerden transvers kesitler CTB+ hücreleri zarar görmemiş (sol) ve yaralı (sağda) fareler spinal kord boyunca belirli mesafelerde ölçmek için kullanılmıştır. Ö. CTB miktar+ hücre transdiaphragmatic (TDia) veya intrapleural CTB teslimat Transtorasik (TTho) yaklaşım göre zarar görmemiş ya da yaralı farelerde Ipsilateral hemicord bulundu. Çubukları temsil 250 µm. veri (SEM) ortalama ortalama ± standart hatasını ifade. n = 5-7 fareler her TDia grubunda; n = 3 fareler her TTho grup. Sigara Lameller Mann-Whitney U testi gerçekleştirilen ve sonuçları kabul kadar önemli ölçüde farklı p için < 0,05. p < 0,001 için C4 yaralanma karşı yaralanmamış. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Görüntüleme.  Université de Namur. Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.

Video: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Denge kullanarak Fare Motor Denge ve Koordinasyon Değerlendirme

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Nörobilim

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

Farelerde Motor Koordinasyon Ölçüm

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...