Name: an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Cerrahi Prosedür Kurulumu <ol><li> Otoklav aletleri, cerrahi malzemeleri, ve ameliyat öncesinde kültür malzemeleri. Her sıçan için Cerrahi sarf malzemeleri şunlardır: 1 drape, önceden kesilmiş delik ile 1 örtüyü (0.5 x 1.5) merkezinde, gazlı bez ve 1 emici underpad. Cerrahi aletler şunlardır: bir sayı 10 bıçak ile 1 neşter, cımbız 2 çift ve ince bir makas. 1 drape, cımbız 1 çift ve polikarbonat filtreler ile 6-plaka ekler hazırlandı: Kültür malzemeleri bulunmaktadır. </li><li> pleksiglas platformu, cerrahi bir evre ve% 70 etanol ile cerrahi tezgah üstü alan sterilize edin. steril bir kapta kullanıma kadar cerrahi sahne tutun. <ol><li> 100 mm kültür çanağı merkezi deliğe 1 ile yaklaşık 2 sondaj cerrahi alanı oluşturur. Sonra, pürüzsüz zımpara kağıdı kullanınherhangi bir keskin kenarları ve dokular için yükseltilmiş yüzey oluşturmak için deliğin kenarlarına silikon yapıştırıcı katman ekleyin. </li><li> Alternatif olarak, CAD yazılımı kullanarak cerrahi sahne tasarım ve 3-D baskı (Şekil 1) yapmak. </li></ol></li><li> aşağı steril emici underpad yerleştirin ve bunun üstüne bir pleksiglas platformu yatıyordu. Emici underpad yanındaki ısıtılmış bir yastık üzerinde, bir önceden kesilmiş deliksiz, örtü yerleştirin. </li><li> Steril bir fosfat tamponlu salin (PBS) önceden sıcak ortam, 37 ° C&#39;ye kadar tuz. Bir sonraki cerrahi kurulum için bir 50 ml konik tüp ısıtma pedi ve yer tuzlu üstünde ayrı kültür kaplarına yerleştirin medya ve PBS. </li><li> tüm paketler tüm malzemelerin steril kullanımını sağlamak için cerrahi başlamadan önce açılmış olduğundan emin olun. Bu prosedürde kullanılan yaygın araçların tam listesi listelenir Spesifik Cerrahi Malzemeler ve Araçlar Tablo. </li></ol> 2. mezentery Doku Hasat <ol><li> Kullanım erişkin erkek Wistar sıçanları (350 ± 25 g; 6 - yaş 8 hafta). Diğer suşlar ve sıçanların yaşları ikame edilebilir. </li><li> Ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (8 mg / kg vücut ağırlığı) bir kas içi enjeksiyon ile sıçan anestezisi. sıçan bir refleks yanıt denetlemek için ayak parmakları arasında sıkıştırarak anestezi altında olduğunu teyit; hiçbiri olmalıdır. bu terminal prosedür için rüçhan analjezi gerekli değildir. </li><li> Karın bölgesini Tıraş ve epilasyon kremi kullanarak kalan tüylerden. povidon-iyot, ardından% 70 izopropil alkol ile iki kez karın cildi silin. mendil cerrah cerrahi bölgenin merkezinde başlamalı ve daha önce steril gazlı bez veya steril pamuklu çubuk aynı parça ile temizlendi olan alanların üst üste olarak dairesel şekilde hazırlanan alanın dışına taşıyın. Sonra steril cerrahi kurulum hayvan transferi ve pleksiglas plat üstünde yerform. </li><li> sternum altında 1 ile başlayan gut 1.25 kesi - Bir neşter bıçak kullanarak, bir 0.75 yapmak. bağırsak veya mezenter (cilt 1 kat, bağ dokusu 1 kat, ve kas 1 kat) delmek için dikkatli olun. </li><li> kesi üzerinde önceden kesilmiş delik olan bir örtü koyun ve örtü üstünde bir steril cerrahi sahne yerleştirin. kesi ile açılış Uyum Gösterir olun. bulmak ve cerrahi evre delikten ileum çekin steril pamuk uçlu aplikatör kullanın. </li><li> Pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak aşamasında 8 mezenterik pencereleri ve açılır pencere (Şekil 1) dokunmamaya dikkat - 6 çekin. Dokular, tipik haliyle çekum yakınındaki itibaren ince bağırsak ileum bölgesinden toplanır. çözeltisi damla steril bir şırınga kullanılarak gerektiği kadar ısıtılmış steril tuzlu su ile nemli maruz kalan dokuların tutun. </li><li> Pentobarbital sodyum intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan (sıçan başına 0.2 mL) ile öldürülür. Beni çıkartmadan öncesenteric pencereler, sıçan kalbi palpe ötenazi sağlamak; Puls olmalıdır. </li><li> pencere kesmek için yağ yastığı ve ince makas kapmak için cımbız kullanarak istediğiniz mezenter dokuları çıkarın. pencerenin çevresinde yağ (2 mm) bir sınır bırakın. medya içinde bir defa ısıtılmış, steril PBS içinde bir kez dokuları yıkayın. </li><li> karın boşluğuna batın ileum dönün ve kurumsal kurallarına göre hayvanın imha edin. </li></ol> Time-Lapse Çalışmaları 3. Mezenter Doku Kültürü <ol><li> Steril bir laminer akış kaputu Transfer otoklava kültür malzemeleri (bölüm 1.1) ve dokular. </li><li> polikarbonat filtre zarı tepesinde her doku aktarmak için cımbız kullanın. yağ yastığı ile tut dokular damarsal hasar görmesini önlemek için. </li><li> Hızla pencere dokunmamaya dikkat ederek, yağ yastığı kullanılarak doku yayıldı. 6-çukurlu plaka altına doku ile ekleme ters çevirin ve ortam 3 ml (Şekil 1 ile kapak </stRong&gt;). Bu prosedür için kullanılan tipik ortam,% 1 penisilin streptomisin (Penstrep ile tedarik edilmiş) ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Minimum Esansiyel Ortamı (MEM) içerir. Ortam anjiyojenezi teşvik etmek için diğer serumlar ve / veya büyüme faktörleri ile desteklenebilir. </li><li> En fazla 5 gün boyunca, standart inkübatör koşullarında her doku ve kültür (% 5 CO2, 37 ° C) 3.3 - Tekrar 3.2 adımları tekrarlayın. </li></ol> Mezenter Doku 4. Time-Lapse Görüntüleme <ol><li> görüntüleme gününde, konjuge BSI-lektin iyi her ortam katkısı ve 30 dakika boyunca, standart kültür koşulları altında inkübe edilir. lektin özgür medya ile iki kez dokuları yıkayın. BSI-lektin leke kültüründe en fazla 3 gün süreyle mezenter dokusu üzerinde görünür kalacaktır. </li><li> Bir mikroskop aşamasına plaka aktarın. kendi morfolojisi ve ağ yapısına dayalı kan ve lenf damarlarına belirleyin. </li><li> Her doku üzerinde istenen ağ bölgesini bulun ve görüntü alabilir. görüntüleme dikkat edinAynı bölgeyi sağlamak için konum sonraki görüntüler için Çekilecek. Bir motorlu sahne kullanılıyorsa, koordinatları belge. </li><li> inkübatör dokuları dönün ve istenen son noktaya kadar kültüre devam edin. Tekrarlayın 4.1 adımları - 4.3 istenilen deneysel zaman noktalarında bağlı gerektiği gibi. </li></ol> 5. Doku ile immün <ol><li> BSI-lektin Etiketleme <ol><li> ortam ile iki durulama ardından ortam içinde 1:40 FITC ile konjüge edilmiş lektin (6-gözlü plaka içinde çukur başına 2.5 ml antikor çözeltisi) 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, medya ekleyin ve sonra hemen değiştirin. </li></ol></li><li> Live / Dead Etiketleme <ol><li> 1 ile 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca doku inkübe: 500, 2 mM etidyum homodimer-1 ve 1: ortamı ile iki durulama sonra ortam 500, 1 mM Calcein AM (6-gözlü plaka içinde oyuk başına 2.5 ml antikor çözeltisi). </li></ol></li><li> BSI-lektin / NG2 Etiketleme <ol><li> Bir mikroskop yayılmış dokular kaydırdıe (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> 100 tavşan poliklonal NG2 antikor ve% 5 normal keçi serumu (NGS): Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-tavşan CY2 bağlı antikor (GAR-Cy2) ve% 5 NGS. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, PBS ekleyin ve sonra hemen değiştirin. </li><li> slaytlar monte etmek için, üst 50:50 PBS ile doku ve gliserol çözeltisi ve yer lamel kapsamaktadır. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Etiketleme<ol><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 200 fare monoklonal biyotinile CD31 antikoru ve 1: Primer antikor etiketlemesi için 1, oda sıcaklığında 1 saat boyunca dokular inkübe 100 tavşan poliklonal LYVE-1 antikoru, PBS +% 0.1 saponin +% 2 sığır serum albümini (BSA) +% 5 NGS . PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 500 Cy3-konjüge edilmiş streptavidin antikoru ve 1: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAR-Cy2 ikincil antikor etiketlemesi için, 1 1, oda sıcaklığında st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> 50:50 PBS ve gliserol çözeltisi ile slaytlar, kapak dokularını mount ve üstüne bir lamel yerleştirin. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lektin Etiketleme <ol><li> ortam 1 mg / ml BrdU ekleme ve BrdU çözeltisi doku ortamı değiştirin. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2M HCI doku DNA&#39;yı denatüre. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) dokuları yıkayın. </li><li> PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 monoklonal fare anti-BrdU: Primer antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-fare Cy3-konjüge edilmiş antikor, PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS (GAM-Cy3). PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li&gt; PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. </li><li> üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li><li> BSI-lektin / CD11b etiketleme <ol><li> bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 farede anti-fare CD11b. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAM-Cy3. PBS ile dokuları yıkayın+% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika). </li><li> PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. </li><li> üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress.">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+forces+control+endothelial+sprouting.">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li><li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting.">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).</li><li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis.">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li><li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks.">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li><li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks.">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels.">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li><li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate.">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li><li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks.">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108 (2013).</li><li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth.">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7 (2012).</li><li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling.">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li><li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival.">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li><li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+shear+stress,+angiogenesis,+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo.">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li><li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages:+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis.">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol mikrovasküler ağ büyüme time-lapse görüntüleme için bir ex vivo aracı olarak sıçan mezenter kültür modeli kullanılarak için bir yöntem belgelemektedir. Laboratuvarımızda Önceki çalışmaları, 1 yönelik modeli) anjiyojenez 8, 2) lenfanjiyogenez 8, 3) perisit-endotelyal hücre etkileşimleri 8 ve 4), anti-anjiyojenik madde testi 9&#39;a göre bir kullanım oluşturmuştur. Birden çok zaman noktalarında kültürlenmiş sıçan mezenter dokuların görüntülenmesi için yeteneği dokuya spesifik büyüme tepkileri ve çeşitli angiogenik stimuli sırasında hücre-hücre etkileşimleri izleme değerlendirmek için niceliksel tahlili bulunmaktadır. Anjiyogenez sırasında endotel hücrelerinin artan çoğalması ve perisitlere varlığı bizim daha önceki çalışmaları 8 ile tutarlı ve kültürlü sıçan mezenterik dokularında anjiyojenez sırasında birden fazla hücre tipleri arasındaki dinamik etkileşimleri doğrulamak. in vitro hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Sıçan mezenter kültürü modeli benzersizdir. Aksine bir kollajen jel 10 aort segmentlerden anjiyojenik filizlenmesini incelemek için kurulmuştur aort halka tahlil, düşünün. Aort ringde çimlenme birden hücre tipleri içerirken, kılcal filizi in vivo senaryo çok farklı aorta, eksize kesimleri dışında büyür. Beyin dilim modeli başka ex vivo model, ancak lenfatik damarların geçersizdir. Ayrıca, beyin dilim modeli öncesi ve anjiyojenik stimülasyon 11 sonra time-lapse görüntüleme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir olmamıştır. En son katılan diğer bir eks vivo modeli, retina kültürü modelidir. Retina modelin avantajı anjiyojenez sağlam microvascu meydana gelir kidokuda 12, 13 içinde lar ağlar. Bu modellerde, GFP transgenik fare suşları, zaman içinde çimlenme kılcal gözlemleyebilecektir için kullanılabilir, ancak modelinde kullanıldığı gibi, ne yazık ki, fare mezenter, sıçan mezenter GFP transgenik farenin mezenter ikame elimine avasküler 14&#39;tür. Ayrıca, kültür sıçan mezenter dokuların basit lektin etiketleme, farklı zaman noktalarında ve in vivo modellerde diğer ex göre ağ oluşumunu belirlemek için yeterli olduğunu göstermektedir, modeli kan ve lenfatik endotel hücreleri hem de eş zamanlı gözlem sağlar. BSI-lektin mikrovasküler ağları görselleştirmek ve anjiyojenik tepkileri algılamak için bu yazıda kullanılmıştır. Lektin endotel hücreleri üzerinde glikoproteinler bağlanır ve endotel antib kıyasla nedeniyle kısa inkübasyon süresi için bu protokol seçildi bir protein yapısıody belirteçler. Lektin antikorlar daha az pahalı ve sabitleme gerektirmez; aynı zamanda kolayca kültür ortamı içinde karıştırılmış ve inkübasyon süresi sona erdikten sonra taze ortam ile ikame edilmiş olabilir. Gelecekteki çalışmalar anjiyogenik süreci lektin etiketleme tekniğinin potansiyel etkilerini aydınlatmak için gerekli olsa da, bizim temsilcisi sonuçları (Şekil 4) göstermek sağlam anjiyogenez kaynaklı olabilir ve önceki çalışma 9 lektin etiketli ağlarda anjiyogenez hedef yoluyla önlenebileceğini gösteriyor ki Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) bulunmaktadır. Antikor belirteçler potansiyel olarak daha spesifik belirteçler için bir ihtiyaç olduğunda, alternatif etiketleme yaklaşımı olarak kullanılabilir, ya da örneğin düz kas hücreleri, perisitler, destek ve sinirler gibi mikrovasküler ağlar içinde mevcut olan diğer hücre tipleri araştırmak için bir ihtiyaç olduğunda. görselleştirme hücreler için başka bir potansiyel yöntem gene olacaktır. Time-lapse sıçan mezenter modeli kullanmanın avantajı bu protokol için temsilci sonuçlar vurgulanmıştır. Tedaviden önce ve sonra görüntü karşılaştırması olmayan ikili istatistiksel analiz etkileyen değişkenliği sorunları azaltır. eksplant spesifik yanıtlar damar yoğunluğu% 20 233% artış ve filiz yoğunluğu% 40 3.500 ila% artış değişiyordu. Bu varyasyon için özel nedenleri bilinmemektedir, ancak zamanla aynı dokuda büyüme ölçme dokuya özgü yanıtları onaylamak için yeteneği sunar. mikrovasküler büyüme sırasında farklı zaman noktalarında görüntü karşılaştırmalı analizi, aynı zamanda, endotelyal hücrelerin izleme sağlar. Örneğin, laboratuar yakındaki ağların 15, 16 kesilir mikrovasküler ağların yakınında endotel hücre kesimleri gibi vasküler adaları belirlemiştir. Bu adalar yakınında networ bağlanmak onaylamak içinanjiyojenik uyarıcıya tepki olarak k, sıçan mezenter kültürü modeli kullanılmıştır. Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, vasküler adalar temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) veya VEGF artı trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF), doku uyarıldıktan sonra izlenmiştir. Biz de (veri burada gösterilmemiştir) benzer sonuçlar sonrası serum stimülasyonu göstermiştir. anjiyogenez uyarılmasından sonra, başlangıçta bağlantısız vasküler adaları yakınında ağlara bağlanabilir bulunabilir. Sıçan mezenter kültür modelinin diğer potansiyel uygulamalar lenfatik ve kan damarları ve kendi endotel hücreleri ve interstisyel hücre kader takibi arasındaki ilişkileri araştırmak için yeteneği kaldıraç olabilir. Önce ve bu modelde% 10 serum ile uyarıldıktan sonra aynı mikrovasküler ağların Time-lapse görüntüleri potansiyel lenfatik-to-kan damar entegrasyonu (Şekil 6) örnekler verdi. stimülasyon, lenfatik ve kan Vess önceels damar morfolojisi dayalı ayırt edildi. uyarıldıktan sonra, kan damarı kimlik karşı lenfatik az netleşti. Lenfatik / kan-Endotelyal Hücre Etkileşimlerinin potansiyel PECAM bir gözlemle desteklenmektedir PECAM bağlantı + / LYVE-1 kan endotelyal hücreler + / LYVE-1 + lenfatik endotel hücreleri (burada veriler gösterilmemiştir). Bu gözlemler lenfatik / kan endotel hücre plastisite araştırmak için sıçan mezenter kültür modelinin kullanımını desteklemektedir. Şekil 6A da belirgin interstisyel hücre lektin etiketleme vurgulamaktadır. Bu etiketleme tutarsız ve dokudan dokuya heterojen bir birlikte, endojen doku yerleşik hücrelerin varlığını vurgulamak mı. Kültürlü dokuların CD11b etiketleme (Şekil 7), bu lektin-pozitif interstisyel hücreler makrofajların bir alt kümesi olabileceğini düşündürmektedir. Makrofaj tutulum ortaya çıkan faiz anjiyogenez 20, ek bir gücü göz önüne alındığındaModel zamanla makrofaj dinamiklerini izlemek için kullanımı olabilir. Çok ex vivo modelleri gibi, sıçan mezenter kültürü modelinde anjiyojenezi okuyan bir akım sınırlama kan akışının olmaması. Kan akışının neden olduğu kesme stresi endotel hücre morfolojisi ve proliferasyonu olarak anjiyojenez 17, 18, 19 bir rol oynadığı gösterilmiştir. Şekil 4&#39;de yer alan Örnek sonuçlar için, kesme geriliminin yokluğu sadece kültür ağlarda anjiyojenik tepki meydana getirmeye yeterli olabilir. Ancak, sıçan mezenter kültür modeli 8 karakterize eden ilk yayına dayalı olduğunu biliyoruz, bu ortam takviyesi nedenleri yalnız medya karşı anjiyogenez arttı. kültürlü mikrovasküler ağ içinde akışını içeren gelecekteki çalışmalarda şüphesiz daha yakından taklit etmek için gerekli olanin vivo senaryoda. içeren akışı için potansiyel yaklaşımlar ağ besleyen arteriollerin kanül veya mezenterik pencerelerin yağ sınırları içinde daha yukarı arterlerin bile kanülasyon içerebilir. Ancak, akış olmamasına rağmen, birden fazla hücre tiplerinin canlılığı, anjiyogenez sırasında kan ve lenfatik mikrovasküler ağlar ve hücre çoğalması bakım in vitro modellerinde merkezli hücreye kıyasla karmaşıklık sıçan mezenter kültür modelin göreli artış düzeyini destekler. Sonuç olarak, bu protokol, dokunulmamış mikrovasküler şebekelerinde anjiyojenik yanıtlar görüntülenmesi için basit ve tekrarlanabilir ex vivo usul tarif eder. Bu gibi bir yöntem olup, bir ağ ortamında belirli yerlerde anjiyojenik hücre dinamikleri değerlendirilmesi için in vitro bir model esas hücreye bir alternatif sunar. yöntem aynı zamanda anjiyogenez, lenfanjiogenetik ve kan / lenf araştırmak için yeni bir araç sunar mis-pıtırAynı anda ning.

Mikrovasküler ağ büyüme ve yeniden doku işlevi için ortak paydası, yara iyileşmesi, ve birden çok patoloji ve önemli bir proses, mevcut olanlar 1, 2, yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, anjiyojenez ise. yeni gemiler mühendislik veya anjiyogenez katılan hücresel dinamiklerin önemini anlayarak, anjiyogenik dayalı tedaviler tasarımı dokuya için kritik öneme sahiptir. Ancak, bu işlem karmaşıktır. Bir mikrovasküler ağ içinde belirli yerlerde değişiklik ve çoklu hücre tipleri (örneğin endotel hücrelerini, düz kas hücreleri perisitleri, makrofajlar, kök hücreler) ve birden fazla sistemi (lenfatik ağları ve yapay sinir ağları) içerir olabilir. In vitro modeller anjiyogenez 3 katılan farklı hücreler arasındaki ilişkiyi inceleyen çok büyük katkıları olmasına rağmen, onların fizyolojik alaka thei nedeniyle zarar olabilir<html> Sınırlı karmaşıklığı ve yakından in vivo senaryoyu yansıtmayan gerçeğini r. Bu sınırlamaları, üç boyutlu kültür sistemleri üstesinden gelmek için 3, ex vivo doku modelleri 4, mikroakışkan sistemleri 5, 6, ve son yıllarda geliştirilmiş ve tanıtılmıştır 7 hesaplama modelleri. Bununla birlikte, sağlam mikrovasküler ağ ex vivo anjiyojenezi araştırmak için hızlandırılmış yeteneğine sahip bir model için hala bir ihtiyaç vardır. karmaşıklık düzeyi ile anjiyogenez çalışmaları için yeni time-lapse modellerinin kurulması anjiyogenez düzenleyen altında yatan mekanizmaları anlamak için paha biçilmez bir araç sağlayacak ve tedavileri geliştirmek. Sağlam bir mikrovasküler ağ üzerinden anjiyogenez ex vivo soruşturma sağlayan bir potansiyel modeli sıçan mezenter kültür modeli&gt; 8. Son çalışmada, kan ve lenfatik mikrovasküler ağları kültür sonra canlı kalır olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, sıçan mezenter kültür modeli fonksiyonel pericyte-endotel hücre etkileşimleri, kan ve lenfatik endotel hücre bağlantıları ve zaman atlamalı görüntüleme araştırmak için kullanılabilir. Bu makalenin amacı time-lapse görüntüleme yöntemi için protokol sağlamaktır. Bizim Örnek sonuçlar serumu ile anjiyojenezin uyarılmasında sonra canlı kalır ve dokuya özel anjiyojenik yanıtlar gibi endotel hücre takibi çalışmaları ölçülmesi için bu yöntemi kullanarak örnekleri sunmaktadır çok sayıda hücre türleri belge.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&amp;rdquo; x 12&amp;rdquo; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Scalpel Handle, #3; Solid; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Sterile Surgical Blade</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Stainless Steel; Size 10</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (curved tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (straight tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5130</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;&lt;br/&gt; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2&quot; Overall Length</td></tr><tr><td>Gauze Pads</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4&quot; x 4&quot; 12-Ply</td></tr><tr><td>Cotton-Tippled Applicators</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6&quot; Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td></tr><tr><td>6-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td></tr><tr><td>Sterile Syring 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td></tr><tr><td>6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td></tr><tr><td>Polycarbonate Filter Membrane</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&amp;nbsp;&amp;micro;m, 47&amp;nbsp;mm, White Plain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine</td><td>Operand</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Lectin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antibody</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&#039;-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Rat CD11b&amp;nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks

Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, endotel hücreleri, perisitler, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve lenf damarları ve sinirler koordinasyon içinde yapılmalıdır. çok hücreli, multi-sistem etkileşimleri fizyolojik ilgili bir ortamda anjiyogenezisteki soruşturma gerektirmektedir. In vitro hücre kültürü modelleri kullanımı bakış açıları sağladı Böylece, ortak bir eleştiri bir mikrovasküler ağı ile ortaya çıkan karmaşıklık özetlemek kalmamasıdır. Bu protokolün amacı, öncesi ve kültürlü sıçan mezenter dokularında anjiyogenez uyarılmasından sonra bozulmamış mikrovasküler ağlarının zaman atlamalı karşılaştırmalar yapabilme yeteneği göstermektir. Kültürlü dokuların hiyerarşi korumak mikrovasküler ağları içerir. İmmünohistokimyasal markalama endotel hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, kan damarları ve lenf damarlarının varlığını teyit. İçindeAyrıca bu yöntem, BSI-lektin ile dokuları etiketleme önce ve artan kapiller filizlenmesi ve damar yoğunluğu ile karakterize serum veya büyüme faktörü uyarılmasından sonra yerel ağ bölgelerin time-lapse karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Ortak hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, fizyolojik olarak uygun mikrovasküler ağlarda endoteliyal hücre soyu çalışmaları ve dokuya özel anjiyojenik madde değerlendirilmesi için bir araç sağlar.

Kültür içinde 3 gün sonra, dokular sıçan mezenter kültürü modeli (Şekil 2a) mikro-damar canlılığını gösteren bir ölü / canlı canlılığı / sitotoksisite kiti ile etiketlenmiştir. mezenterinde mevcut hücrelerin çoğu endotel hücrelerinin mikrovasküler segmentlerde konumlarına göre belirlenen edildi kültürde canlı kalmıştır. Endotel hücre çoğalması ayrıca lektin / BrdU etiketleme (Şekil 2D) ile teyit edilmiştir. Damarlar boyunca düz kas hücresi ve perisit varlığı NG2 etiketleme (Şekil 2B) ile teyit edilmiştir. LYVE1 ve PECAM için etiketleme lenfatik ve kan mikrovasküler ağları dallanma belirlenen ve kan endotel hücre fenotipi (Şekil 2C) karşı lenfatik muhafaza doğruladı. Bu modelin time-lapse özelliği microva etiketleme ile kullanılmıştırfarklı zaman noktalarında BSI-lektin ve zamanla ağ içinde aynı bölgeyi görüntüleme ile scular ağlar; Bu özelliği dokuya özgü anjiyojenik tepkileri araştırmak için özellikle değerlidir. % 10 serum ile ortam takviyesi uyarımı 3 gün sonra güçlü bir anjiyojenik tepki neden oldu. Buna ek olarak, yeni damar segmentleri ve kılcal filizler 5 gün stimülasyon (Şekil 3) ile tanımlanmıştır. (Şekil 4) önce ve stimülasyon sonrasında ağ bölgelerin Kantitatif karşılaştırma için izin verilen zaman atlamalı görüntüleme yöntemi. Daha önceki sonuçları 9 doğrular bu temsili çalışmada, için, vasküler alana düşen damar sayısı ve vasküler alanı başına kılcal filizi sayısı dokusu başına bir 4X görüntüden ölçüldü. Kan damarı segmentleri iki şube noktaları ve kılcal filizi arasındaki mevcut lektin-pozitif kan endotel hücre segmentleri olarak tanımlandı sona kör olarak tanımlandı<html> Bir ana bilgisayar geminin kaynaklanan segmentleri. Ağ bölgelerin Time-lapse karşılaştırma da (Şekil 6) endotel hücre bölümlerinin izleme (Şekil 5) ve kan / lenf damarı yanlış desen belirlenmesini sağladı. Lektin ve CD11b kültürlendi dokuların Etiketleme ek yeniden modelleme şebekelerinde geçiş yerleşik makrofajların varlığını (Şekil 7) doğruladı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig1.jpg" /> Şekil 1. Mezenterik pencereler cerrahi bir aşamasında ince bağırsağı dışarı çekerek bulunurdu. Cerrahi evre 3-D baskı tarafından tasarlanan ve yapıldı. Merkezi eliptik bir delik (A) yaklaşık 2 1 ile bulunmaktadır. Mezenterik pencereleri bir membran ucun üstüne yayılmış, sonra vardı ve uç ters ve iyi (B) konulmuştur. Ölçek çubuğu = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig2.jpg" /> Şekil 2. Kan damarları sıçan mezenter kültür modelinde canlı kalır. Kültürden sonra gerçekleştirilen ölü / canlı deney, özellikle kan damarları (A) boyunca, ölü hücreler (kırmızı) için canlı hücreler (yeşil) yüksek bir oranını gösterdi. Mezenter dokular gemiler (yeşil) yanında perisitler (kırmızı) tespit etmek ve hücrelerin bu farklı kültür sonrası dokularında (B) &#39;de mevcuttur teyit etmek için, lektin ve anti-NG2 ile etiketlenmiştir. Dokular da PECAM karşı etiketli / LYVE-1 lenfatik kan (kırmızı) damarları tanımlamak için (yeşil) gemiler (C). mikrovasküler hücreler kültürde çoğalması tabi eğer araştırmak, mezenter dokular lektin / anti-BrdU ile etiketlenmiş<html> . Lektin (yeşil) ile etiketlenmiş kılcal segmentlerde, birden fazla hücre çoğalma (kırmızı) (D) olarak teyit edildi. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55183/55183fig3.jpg" /> Sıçan mezenter Şekil 3. Time-lapse görüntüleme kültürünün boyunca mikrovasküler remodeling gözlemleyerek sağlar. Güçlü bir anjiyojenik tepki% 10 serum stimülasyonu ile kültür Şekil 3 (b) ve 5 gün boyunca (° C) sonra gözlenmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> dosyaları / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg &quot;/&gt; Sıçan mezenter kültür modelinde Şekil 4. Mikrovasküler ağları öncesi ve anjiyogenez sonra görüntülendi. % 10 serum ile gün 0 ve 3 (A, B) ile ilgili lektin ile etiketlenmiş aynı ağ sonrası uyarım karşılaştırması yeni damarlar tanımlar. Lektin da tanımlanamayan interstisyel hücre popülasyonu etiketler. Damar yoğunluğu (C, D) ve vasküler alanı (E, F) her kılcal filizlerin sayısının nicelleştirilmesi, her doku için, her iki metrik bir artış doğruladı. Önce c, e) (gün 0) ve doku başına sonra (3 gün) karşılaştırılması. D, F) Karşılaştırma gün 0 ile gündüz arasındaki eşleştirilmiş Student t-testi kullanılarak 3 ortalamaları damar alanı başına damar segmentlerinin ortalama sayısı (p &lt;0.0001) ve filizi ortalama sayısı (p &lt;0.00001 hem de önemli bir fark) doğruladı . Beyaz barlar gün 0 temsil ve siyah çubuklar 3. günde Valu temsiles ± SEM ortalamasıdır. Bu Örnek analiz için, 13 dokular 2 sıçandan toplandı. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55183/55183fig5.jpg" /> Sıçan mezenter kültür modeli 5. Şekil yakındaki ağların içine damar ada kaderi ve birleşme araştırmak için de kullanılabilir. bağlantısız endotel segmentler olarak tanımlanan time-lapse görüntüleme, vasküler adaları, kullanma, 0. günde tespit edildi ve yakındaki ağa bunların bağlantı gün 3 sonrası anjiyogenik uyarımı ile doğrulandı. Mezenter dokular bFGF (A, B) ve VEGF / PDFG-BB (C, D) ile uyarıldı. Içi boş oklar 0. günde bağlantısız segmentleri göstermek ve katı oklar networ ada bağlantıyı temsilk. Ok uçları bir damar ada ve yakındaki ağ arasındaki bağlantıların yerini göstermektedir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55183/55183fig6.jpg" /> Şekil 6. Time-lapse görüntüleri lenfatik ve kan damarı desenlendirme gözlemlemek için yeteneğini göstermek. Lenfatik (l) gemiler arteriyollerdeki (a) ve venüllerden ayırt edilebilir (v) gün 0 (A) üzerine etiketleme morfolojiye göre. % 10 serum ile 5 gün sonra stimülasyon üzerine, lenfatik morfoloji kaybetti ve damarlar yakın anjiyojenik kan damarlarının (B) ile entegre görünmektedir edilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig6large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/55183/55183fig7.jpg" /> Şekil 7. Makrofajlar kültürlü sıçan mezenterik dokularda mevcut kalır. % 10 serum ile 3 gün süre ile kültüre dokuların lektin / CD11b eş markalama lektin pozitif geçiş hücreler, makrofajların bir alt olduğunu göstermektedir. (A) BSI-lektin etiketleme bir temsilcisi görüntü. Aynı görüş alanında (B) CD11b etiketleme. (C) Birleştirilmiş görüntü. oklar ko-etiketleme örneklerini tespit. Ölçek çubukları 100 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks at JoVE.com

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

6.8K Görüntüleme.  Tulane University. Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis. 

Video: An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biyoloji

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Tıp

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler