Name: an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Toutes les expériences et les procédures animales ont été approuvées par Institutional Care Committee et l&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de Tulane (IACUC). 1. Configuration de la procédure chirurgicale <ol><li> instruments autoclaves, des fournitures chirurgicales et les fournitures de culture avant la chirurgie. fournitures chirurgicales pour chaque rat comprennent: 1 drap, 1 drap avec trou prédécoupé (0,5 po x 1,5 po) dans le centre, des tampons de gaze, et 1 underpad absorbant. Les instruments chirurgicaux comprennent: 1 scalpel avec une lame numéro 10, 2 paires de pinces, et une paire de ciseaux fins. fournitures de culture comprennent: 1 drap, 1 paire de pinces, et préparés à 6 puits inserts de plaque avec des filtres en polycarbonate. </li><li> Stériliser une plate-forme en plexiglas, une étape chirurgicale et un espace de paillasse chirurgical avec 70% d&#39;éthanol. Gardez l&#39;étape chirurgicale dans un bol stérile jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Créer une étape chirurgicale par le forage d&#39;un environ 2 par 1 dans le trou dans le centre d&#39;une boîte de culture de 100 mm. Ensuite, utilisez du papier de verre pour lisserles arêtes coupantes et ajouter une couche de colle silicone sur les bords du trou pour créer une surface surélevée pour les tissus. </li><li> Vous pouvez également concevoir la scène chirurgicale en utilisant un logiciel de CAO et de faire en 3-D impression (Figure 1). </li></ol></li><li> Placer un underpad absorbant stérile et posez une plate-forme de plexiglass sur le dessus de celui-ci. Placez le drap, sans un trou pré-coupé, sur un coussin chauffant à côté de la thibaude absorbant. </li><li> Préchauffer une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), les médias et une solution saline à 37 ° C. La place des médias et du PBS dans des boîtes de culture séparées au sommet du coussin chauffant et lieu de solution saline dans un tube de 50 ml conique à côté de la configuration chirurgicale. </li><li> Assurez-vous que tous les paquets sont ouverts avant le début de la chirurgie pour assurer une manipulation stérile de tous les matériaux. Une liste complète des outils communs utilisés dans cette procédure sont répertoriés dans la Table des matières et outils chirurgicaux spécifiques. </li></ol> 2. MesenterLa récolte de tissus y <ol><li> Utiliser des rats adultes mâles Wistar (350 ± 25 g; 6 - 8 semaines d&#39;âge). D&#39;autres souches et l&#39;âge des rats peuvent être substitués. </li><li> Anesthésier le rat par une injection intramusculaire de kétamine (80 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (8 mg / kg de poids corporel). Vérifiez que le rat est sous anesthésie par pincement entre les orteils pour vérifier une réponse réflexe; il devrait y avoir aucun. analgésie préemptive pour cette procédure terminal est pas nécessaire. </li><li> Rasez la région abdominale et enlever restante cheveux à l&#39;aide de la crème d&#39;épilation. Essuyer la peau abdominale deux fois avec 70% d&#39;alcool isopropylique suivie povidone-iode. Pour les lingettes, le chirurgien doit commencer au centre du site chirurgical et de se déplacer vers l&#39;extérieur de la zone préparée de manière circulaire pour ne pas recouvrir les zones qui ont été préalablement lavés avec le même morceau de gaze stérile ou un tampon de coton stérile. Puis transfert animal à l&#39;installation chirurgicale stérile et placer au sommet de la plate plexiglassforme. </li><li> En utilisant une lame de scalpel, faire un 0,75 - 1,25 en incision dans l&#39;intestin à partir du 1 au-dessous du sternum. Veillez à ne pas percer l&#39;intestin ou mésentère (1 couche de la peau, 1 couche de tissu conjonctif, et 1 couche de muscle). </li><li> Placez un drap avec un trou pré-découpé sur l&#39;incision et placez un stade chirurgical stérile au-dessus du drap. Assurer l&#39;ouverture aligne avec l&#39;incision. Utiliser des applicateurs de coton-tige stérile pour localiser et extraire l&#39;iléon à travers l&#39;ouverture de scène chirurgicale. </li><li> Tirez 6 - 8 fenêtres mésentériques à travers la scène en utilisant des applicateurs de coton-tige, et faire attention à ne pas toucher les fenêtres (Figure 1). Les tissus sont généralement récoltées à partir de la zone de l&#39;iléon de l&#39;intestin grêle, en commençant près du caecum. Gardez les tissus exposés humide avec une solution saline stérile chauffée au besoin à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile au goutte à goutte la solution. </li><li> Euthanasier le rat par injection intracardiaque de pentobarbital sodique (0,2 ml par rat). Avant de me retirerfenêtres senteric, assurent le rat est euthanasié en palpant le cœur; il devrait y avoir aucune impulsion. </li><li> Retirer les tissus mésentère souhaités à l&#39;aide des pinces pour saisir le coussinet adipeux et des ciseaux fins pour couper la fenêtre. Laissez une bordure de graisse (2 mm) autour de la fenêtre. Laver les tissus une fois dans réchauffé PBS stérile et une fois dans les médias. </li><li> Retour iléon extériorisé à la cavité abdominale et de disposer des animaux selon les directives institutionnelles. </li></ol> 3. Mesentery Tissue Culture d&#39;études de time-lapse <ol><li> Transfert des fournitures autoclavés de culture (voir section 1.1) et les tissus à une hotte à flux laminaire stérile. </li><li> Utilisez des pinces pour transférer chaque tissu au sommet d&#39;une membrane filtrante de polycarbonate. tissus d&#39;appui par le coussinet adipeux pour éviter d&#39;endommager le système vasculaire. </li><li> répandre rapidement le tissu en utilisant le coussinet adipeux, en faisant attention à ne pas toucher la fenêtre. Inversez l&#39;insert avec le tissu dans le fond d&#39;une plaque à 6 puits et couvrir avec 3 ml de médias (Figure 1 </strong&gt;). média typique utilisé pour cette procédure comprend Essential Media minimum (MEM) avec 1% de pénicilline streptomycine (Penstrep) et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Les médias peuvent être complétés par d&#39;autres sérums et / ou des facteurs de croissance pour stimuler l&#39;angiogenèse. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.3 pour chaque tissu et de la culture dans des conditions d&#39;incubation standards (5% de CO 2, 37 ° C) pendant 5 jours. </li></ol> 4. Time-Lapse Imaging de Mesentery Tissue <ol><li> Le jour de l&#39;imagerie, de compléter les supports dans chaque puits avec des conjugués BSI lectine et incuber dans des conditions standard de culture pendant 30 min. Laver les tissus à deux reprises avec des médias libres lectine. BSI-lectine tache restera visible sur le tissu mésentère pour 3 jours de culture. </li><li> Transférer la plaque à un étage de microscope. Identifier les vaisseaux sanguins et lymphatiques en fonction de leur morphologie et la structure de réseau. </li><li> Localiser une région de réseau souhaité sur chaque tissu et prendre des images. Prendre note de l&#39;imagerieemplacement pour assurer la même région sera capturé pour les images suivantes. Si vous utilisez une platine motorisée, documenter les coordonnées. </li><li> tissus Retour à l&#39;incubateur et continuer à la culture jusqu&#39;au point final souhaité. Répétez les étapes 4/1 à 4/3, au besoin en fonction des points souhaités de temps expérimentaux. </li></ol> 5. Tissue immunomarquage <ol><li> BSI-lectine Étiquetage <ol><li> Incuber les tissus pendant 30 min à 37 ° C avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans les médias (solution d&#39;anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias. Pour rinçages, ajouter des médias, puis remplacer immédiatement. </li></ol></li><li> Étiquetage en direct / Dead <ol><li> Incuber les tissus pendant 10 min à 37 ° C avec 1: 500 mM éthidium 2 homodimère-1 et 1: 500 1 mM calcéine AM dans les médias (solution d&#39;anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias. </li></ol></li><li> BSI-lectine / NG2 Étiquetage <ol><li> tissus Spread sur un microscope glissaiente (1 - 2 tissus / slide) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Pour l&#39;étiquetage des anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 lapin anticorps polyclonaux de NG2 et 5% de sérum de chèvre normal (NGS). Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Pour l&#39;étiquetage des anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 chèvre anti-lapin CY2 conjugué anticorps (GAR-CY2) et 5% NGS. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. Pour rinçages, ajouter du PBS, puis remplacer immédiatement. </li><li> Pour monter les diapositives, couvrir les tissus avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM étiquetage<ol><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: anticorps monoclonal biotinylé anticorps CD31 200 de souris et 1: 100 polyclonal de lapin LYVE-1 anticorps dans du PBS + 0,1% de saponine + 2% de sérum albumine bovine (BSA) + 5% de NGS . Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 500 d&#39;anticorps streptavidine conjugué à Cy3 et 1: 100 GAR-CY2 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et de glycérol solution et placer une lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectine Étiquetage <ol><li> Ajouter 1 mg / mL BrdU aux médias et remplacer le support de tissu avec une solution de BrdU. Incuber pendant 2 h à 37 ° C. </li><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn). </li><li> Dénaturer l&#39;ADN de tissu dans du HCl 2 M pendant 1 h à 37 ° C. Laver les tissus dans du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire, l&#39;incubation des tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 monoclonal de souris anti-BrdU dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 d&#39;anticorps de chèvre anti-souris conjugué à Cy3 (GAM-Cy3) dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li&gt; Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li><li> BSI-lectine / étiquetage CD11b <ol><li> Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l&#39;excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse. </li><li> Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage de l&#39;anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 souris anti-CD11b rat dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn). </li><li> Pour le marquage d&#39;un anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 GAM-Cy3 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS+ 0,1% saponine (3 x 10 mn). </li><li> Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. </li><li> Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. </li></ol></li></ol>

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	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress.">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+forces+control+endothelial+sprouting.">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li><li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting.">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).</li><li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis.">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li><li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks.">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li><li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks.">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels.">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li><li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate.">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li><li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks.">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108 (2013).</li><li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth.">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7 (2012).</li><li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling.">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li><li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival.">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li><li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+shear+stress,+angiogenesis,+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo.">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li><li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages:+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis.">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce protocole documente une méthode pour utiliser le modèle de culture de mésentère de rat comme un ex vivo outil pour imagerie time-lapse de la croissance du réseau microvasculaire. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a établi l&#39;utilisation de notre modèle pour 1) l&#39; angiogenèse 8, 2) lymphangiogenèse 8, 3) les interactions cellulaires péricytes-endothélial 8, et 4) le dépistage des drogues anti-angiogénique 9. La possibilité pour l&#39;imagerie des tissus mésentère de rat en culture à de multiples points de temps offre un dosage quantitatif pour évaluer les réponses de croissance à spécificité tissulaire et le suivi des interactions entre les cellules lors de divers stimuli angiogéniques. La prolifération accrue des cellules endothéliales lors de l&#39; angiogenèse et la présence de péricytes sont compatibles avec nos travaux précédents 8 et valider les interactions dynamiques entre plusieurs types de cellules au cours de l&#39; angiogenèse dans les tissus mésentériques de rat en culture. dans les systèmes de culture cellulaire in vitro, le mésentère modèle de culture de rat est unique parce que la croissance se produit au sein d&#39; un, réseau réel microvasculaire intact. Considérons au contraire le test de l&#39; anneau aortique, qui a été créé pour étudier la germination angiogénique à partir de segments de l&#39; aorte dans un gel de collagène 10. Alors que la germination dans l&#39;anneau aortique implique plusieurs types de cellules, les germes capillaires se développent hors des segments excisés de l&#39;aorte, qui est très différent du scénario in vivo. Le modèle de tranches de cerveau est un autre modèle ex vivo, mais il est dépourvu de vaisseaux lymphatiques. En outre, le modèle de tranche de cerveau n&#39;a pas été montré pour être capable d&#39;imagerie time-lapse avant et après stimulation angiogénique 11. Un autre modèle ex vivo qui a été récemment mis en place est le modèle de culture rétine. L&#39;avantage du modèle de rétine est que l&#39;angiogenèse se produit à partir microvascu intacteréseaux lar dans le tissu 12, 13. Pour ces modèles, les souches de souris GFP transgénique peuvent être utilisés pour être en mesure d&#39;observer capillaire germination au fil du temps, mais malheureusement, le mésentère de la souris est avasculaire 14, ce qui élimine la substitution des souris mésentère GFP-transgénique pour mésentère de rat, tel qu&#39;il est utilisé dans notre modèle. De plus, nous montrons qu&#39;un étiquetage lectine simple des tissus du mésentère de rat en culture est suffisante pour déterminer la croissance du réseau à différents points de temps et par rapport aux autres modèles ex vivo, notre modèle permet l&#39;observation simultanée de sang et des cellules endothéliales lymphatiques. BSI-lectine a été utilisé dans le présent document pour visualiser les réseaux microvasculaires et détecter les réponses angiogéniques. Lectine est une structure de protéine qui se lie à des glycoprotéines sur les cellules endothéliales et a été choisi pour ce protocole en raison de sa courte durée d&#39;incubation par rapport à ANTIB endothélialmarqueurs ody. Lectine est moins coûteux que des anticorps, et elle ne nécessite pas de fixation; il peut aussi être facilement mélangé dans les milieux de culture et remplacé par un milieu frais après la fin de la période d&#39;incubation. Alors que les études futures sont nécessaires pour élucider les effets potentiels de la technique de marquage lectine sur le processus angiogénique, nos résultats représentatifs (figure 4) montrent que l&#39; angiogenèse robuste peut être induite et les travaux antérieurs 9 démontre que l&#39; angiogenèse dans les réseaux de lectine marqué peut être inhibée par ciblage Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). des marqueurs d&#39;anticorps peuvent potentiellement être utilisés en tant que méthode d&#39;étiquetage alternative quand il y a un besoin pour des marqueurs plus spécifiques, ou quand il est nécessaire d&#39;examiner les autres types de cellules qui sont présentes dans les réseaux microvasculaires telles que les cellules musculaires lisses, des pericytes et des nerfs. Une autre méthode potentielle pour les cellules de visualisation serait transfection génique. L&#39;avantage d&#39;utiliser le modèle de mésentère de rat time-lapse a été mis en évidence dans les résultats représentatifs pour ce protocole. La comparaison des images avant et après le traitement réduit les problèmes de variabilité qui influent sur l&#39;analyse statistique non apparié. Les réponses spécifiques aux explants ont varié de 20% à 233% d&#39;augmentation de la densité des vaisseaux et de 40% à 3500% d&#39;augmentation de la densité de graines germées. Les causes spécifiques de cette variation restent inconnues, mais la mesure de la croissance dans le même tissu au fil du temps présentent la capacité de confirmer les réponses spécifiques des tissus. analyse comparative des images à différents moments au cours de la croissance microvasculaire permet également le suivi des cellules endothéliales. Par exemple, notre laboratoire a identifié les îles vasculaires que les segments de cellules endothéliales dans le voisinage des réseaux microvasculaires qui sont déconnectés des réseaux à proximité 15, 16. Pour confirmer que ces îles se connectent au networ à proximiték en réponse à des stimuli angiogéniques, le modèle de culture mésentère de rat a été utilisé. Comme on le voit sur la figure 5, les îles vasculaires ont été suivies après la stimulation de tissu avec le facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) ou du facteur de croissance VEGF , plus de dérivé des plaquettes (PDGF). Nous avons également montré des résultats similaires stimulation post sérique (données non présentées ici). Après la stimulation de l&#39;angiogenèse, les îles vasculaires à l&#39;origine déconnectés se trouvent connectés à des réseaux à proximité. D&#39;autres applications potentielles du mésentère modèle de culture de rat pourrait tirer parti de la capacité d&#39;enquêter sur les relations entre les lymphatiques et les vaisseaux sanguins et leurs cellules endothéliales respectives et le suivi du sort des cellules interstitielles. Images Time-lapse des mêmes réseaux microvasculaires avant et après stimulation avec du sérum de 10% dans ce modèle ont fourni des exemples d&#39;intégration potentielle lymphatique à des vaisseaux sanguins (figure 6). Avant stimulation, lymphatique et sanguin vessels ont été distingués en fonction de la morphologie navire. Après stimulation, lymphatique contre l&#39;identité des vaisseaux sanguins est devenu moins clair. Le potentiel d&#39;interactions cellules endothéliales lymphatiques / sanguins est prise en charge par l&#39;observation de PECAM cellules + / LYVE-1- sang endothéliales liaison avec PECAM + / LYVE-1 + cellules endothéliales lymphatiques (données non présentées ici). Ces observations confirment l&#39;utilisation du modèle de culture mésentère de rat pour étudier lymphatique / sang cellule endothéliale plasticité. La figure 6A souligne également l&#39;étiquetage de la lectine des cellules interstitielles apparentes. Bien que cette étiquette est incohérente et hétérogène de tissu à l&#39;autre, cela souligne la présence de cellules résidentes du tissu endogène. Étiquetage CD11b des tissus cultivés (figure 7) suggère que ces cellules interstitielles lectine positif pourrait être un sous-ensemble de macrophages. Compte tenu de l&#39;intérêt croissant de l&#39;implication des macrophages dans l&#39; angiogenèse 20, une résistance supplémentaire de lamodèle pourrait être son utilisation pour suivre la dynamique du macrophage au fil du temps. Tout comme d&#39; autres modèles ex vivo, une limitation du courant d&#39;étudier l&#39; angiogenèse dans le modèle de culture mésentérique du rat est l&#39;absence de flux sanguin. Contrainte de cisaillement causée par le flux sanguin a été montré à jouer un rôle dans la morphologie des cellules endothéliales et la prolifération, ainsi que l&#39; angiogenèse 17, 18, 19. Pour les résultats représentatifs présentés dans la figure 4, l&#39;absence de contrainte de cisaillement seul a pu être suffisante pour induire une réponse angiogénique dans les réseaux de culture. Cependant, nous savons que sur la base de notre publication initiale caractérisant le modèle de culture mésentère de rat 8, que les causes de supplémentation des médias ont augmenté par rapport angiogenèse seuls médias. Les études futures intégrant flux au sein des réseaux microvasculaires cultivées sont sans aucun doute nécessaires pour imiter plus étroitement ladans le scénario vivo. Les approches potentielles pour l&#39;écoulement incorporant pourraient inclure canulation des artérioles d&#39;alimentation du réseau ou même cathétérisme d&#39;autres artères en amont à l&#39;intérieur de la frontière graisse des fenêtres mésentériques. Cependant, en dépit de l&#39;absence d&#39;écoulement, la viabilité de plusieurs types de cellules, le maintien du sang et des réseaux microvasculaires lymphatiques et la prolifération cellulaire au cours de l&#39; angiogenèse supporte par rapport niveau accru du modèle de culture mésentère de rat de la complexité par rapport à la base des modèles in vitro cellulaire. En conclusion, ce protocole décrit une reproductibilité ex vivo méthode simple, pour l&#39; imagerie des réponses angiogéniques dans les réseaux microvasculaires intacts. Une telle méthode offre une alternative à base de cellules dans des modèles in vitro pour évaluer la dynamique des cellules angiogéniques à des emplacements spécifiques dans un environnement réseau. La méthode propose également un nouvel outil pour étudier l&#39;angiogenèse, la lymphangiogenèse et de sang / lymphatique mal bagoutning simultanément.

La croissance du réseau microvasculaire et le remodelage des dénominateurs communs pour la fonction des tissus, la cicatrisation des plaies, et de multiples pathologies et un processus clé est l&#39; angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux qui existent déjà 1, 2. Pour les tissus d&#39;ingénierie de nouveaux navires ou la conception de thérapies angiogéniques, la compréhension de l&#39;importance de la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse est critique. Cependant, ce procédé est complexe. Elle peut varier à des emplacements spécifiques à l&#39; intérieur d&#39; un réseau microvasculaire et implique plusieurs types de cellules ( par exemple les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes, des macrophages, des cellules souches) et plusieurs systèmes (réseaux lymphatiques et des réseaux de neurones). Bien que les modèles in vitro ont contribué énormément à l&#39; examen de la relation entre les différentes cellules impliquées dans l&#39; angiogenèse 3, leur pertinence physiologique peut être compromise en raison de Thei<html> r complexité limitée et le fait qu&#39;ils ne reflètent pas étroitement un scénario in vivo. Pour surmonter ces limitations, les systèmes de culture en trois dimensions 3 modèles de tissus, ex vivo 4, les systèmes microfluidiques 5, 6 et 7 modèles de calcul ont été élaborés et mis en place au cours des dernières années. Cependant, il existe encore un besoin d&#39;un modèle avec une capacité time-lapse pour étudier l&#39; angiogenèse dans les réseaux microvasculaires intacts ex vivo. La mise en place de nouveaux modèles time-lapse pour les études de l&#39;angiogenèse avec ce niveau de complexité fournira un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent l&#39;angiogenèse et d&#39;améliorer les thérapies. Un modèle de potentiel qui permet à l&#39;étude ex vivo de l&#39; angiogenèse à travers un réseau microvasculaire intacte est le mésentère modèle de culture de rat&gt; 8. Dans des travaux récents, nous avons démontré que le sang et les réseaux microvasculaires lymphatiques restent viables après culture. Plus important encore, le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour étudier les interactions fonctionnelles de péricytes-endothélial cellulaires, le sang et les connexions des cellules endothéliales lymphatiques et imagerie time-lapse. L&#39;objectif de ce document est de fournir notre protocole pour la méthode d&#39;imagerie time-lapse. Nos résultats représentatifs de documenter les multiples types de cellules qui demeurent viables après la stimulation de l&#39;angiogenèse avec du sérum et offrent des exemples d&#39;utilisation de cette méthode pour quantifier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus ainsi que des études de suivi des cellules endothéliales.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&amp;rdquo; x 12&amp;rdquo; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Scalpel Handle, #3; Solid; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Sterile Surgical Blade</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Stainless Steel; Size 10</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (curved tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (straight tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5130</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;&lt;br/&gt; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2&quot; Overall Length</td></tr><tr><td>Gauze Pads</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4&quot; x 4&quot; 12-Ply</td></tr><tr><td>Cotton-Tippled Applicators</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6&quot; Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td></tr><tr><td>6-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td></tr><tr><td>Sterile Syring 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td></tr><tr><td>6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td></tr><tr><td>Polycarbonate Filter Membrane</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&amp;nbsp;&amp;micro;m, 47&amp;nbsp;mm, White Plain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine</td><td>Operand</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Lectin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antibody</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&#039;-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Rat CD11b&amp;nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks

Angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, implique des cellules endothéliales, péricytes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires, et la coordination avec les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Le multi-cellulaire, les interactions multi-système nécessite l&#39;enquête de l&#39;angiogenèse dans un environnement physiologiquement pertinents. Ainsi, alors que l&#39;utilisation de modèles in vitro de cultures cellulaires ont fourni des indications mécanistes, une critique commune est qu&#39;ils ne récapitulent la complexité associée à un réseau microvasculaire. L&#39;objectif de ce protocole est de démontrer la capacité de faire des comparaisons time-lapse de réseaux microvasculaires intacts avant et après stimulation de l&#39;angiogenèse dans les tissus mésentère de rat en culture. tissus de culture contiennent des réseaux microvasculaires qui maintiennent leur hiérarchie. marquage immunohistochimique confirme la présence de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les pericytes, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques. Dans unddition, marquage de tissus avec une lectine BSI permet de comparer le temps écoulé des régions du réseau local avant et après la stimulation du facteur de croissance ou du sérum, caractérisé par une augmentation de la germination et de la densité capillaire du récipient. En comparaison avec les modèles de culture cellulaire communs, cette méthode fournit un outil pour les études endothéliales de la lignée cellulaire et évaluation du médicament angiogénique spécifique de tissu dans les réseaux microvasculaires physiologiquement pertinents.

Après 3 jours de culture, les tissus ont été marqués avec un kit mort en direct / viabilité / cytotoxicité pour démontrer la viabilité de la microvascularisation dans le modèle de culture mésentère de rat (figure 2A). La majorité des cellules présentes dans le mésentère est restée viable dans la culture où les cellules endothéliales ont été identifiées en fonction de leur emplacement dans les segments microvasculaires. La prolifération des cellules endothéliales a également été confirmée par marquage lectine / BrdU (figure 2D). Cellule musculaire lisse et la présence de péricytes le long des vaisseaux a été confirmé avec l&#39; étiquetage des NG2 (figure 2B). Étiquetage pour LYVE1 et PECAM identifiés ramification des réseaux lymphatiques et microvasculaires du sang et a confirmé le phénotype maintenu lymphatique contre des cellules endothéliales de sang (figure 2C). La fonction time-lapse de ce modèle a été utilisé par l&#39;étiquetage de la microvaréseaux scular avec BSI-lectine à différents points de temps et l&#39;imagerie de la même région au sein du réseau au fil du temps; cette capacité est particulièrement utile pour étudier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus. La supplémentation de milieux avec 10% de sérum a provoqué une réponse angiogénique solide après 3 jours de stimulation. En outre, de nouveaux segments de vaisseaux et les pousses capillaires ont été identifiés par jour 5 de stimulation (Figure 3). Procédé d&#39;imagerie time-lapse a permis la comparaison quantitative des régions du réseau avant et après la stimulation (figure 4). Pour cette étude représentative, ce qui corrobore nos résultats précédents 9, le nombre de navires par zone vasculaire et le nombre de germes capillaires par zone vasculaire ont été quantifiées d&#39;une image 4X par le tissu. segments de vaisseaux sanguins ont été définis comme des segments de cellules endothéliales de sang lectine positifs présents entre deux points de branchement et les pousses capillaires ont été définis comme aveugle terminé<html> des segments provenant d&#39;un vaisseau hôte. Comparaison Time-lapse des régions de réseau a également permis le suivi des segments de cellules endothéliales (Figure 5) et de l&#39; identification de sang / vaisseaux lymphatiques mal motif (figure 6). Étiquetage des tissus cultivés pour lectine et CD11b en outre confirmé la présence de macrophages résidents interstitiels (figure 7) dans les réseaux de remodelage. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig1.jpg" /> Figure 1. fenêtres mésentériques étaient situées en tirant de l&#39;intestin grêle par une étape chirurgicale. L&#39;étape chirurgicale a été conçu et réalisé par l&#39;impression 3-D. Le trou elliptique dans le centre est d&#39; environ 2 par 1 (A). Les fenêtres mésentériques ont ensuite été étalés sur le dessus d&#39;un insert de membrane, et l&#39;insert a été inversées et placées dans un puits (B). Barre d&#39;échelle = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig2.jpg" /> Figure 2. Les vaisseaux sanguins restent viables dans le modèle de culture mésentère de rat. Test Live / morts effectuée après la culture a montré un taux élevé de cellules vivantes (vert) à cellules mortes (rouges) spécifiquement le long des vaisseaux sanguins (A). Tissus Mésentère ont été marqués avec lectine et anti-NG2, pour identifier les péricytes (rouge) aux côtés de navires (vert) et de confirmer que les différents types de cellules sont présentes dans les tissus post-culture (B). Les tissus ont été également marqués contre PECAM / LYVE-1 pour identifier le sang (rouge) les navires de lymphatique (vert) des navires (C). Pour étudier si les cellules microvasculaires subissent une prolifération dans la culture, les tissus mésentère ont été marquées avec lectine / anti-BrdU<html> . Sur les segments capillaires marqués avec lectine (vert), plusieurs cellules ont été confirmées comme proliférative (rouge) (D). Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig3.jpg" /> Figure 3. Time-lapse imagerie du mésentère de rat permet l&#39; observation de remodelage microvasculaire au cours de la culture. Une réponse angiogénique solide a été observée après 3 (B) et 5 jours (C) de la culture avec une stimulation sérique de 10%. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> fichiers / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Les réseaux microvasculaires dans le modèle de culture mésentère de rat ont été imagées avant et après l&#39; angiogenèse. Comparaison du même réseau marqué avec lectine le jour 0 et le jour 3 (A, B) post-stimulation avec 10% de sérum identifie de nouveaux navires. Lectine marque également une population de cellules interstitielles non identifiés. La quantification de la densité de la cuve (C, D) et le nombre de pousses capillaires par unité de surface vasculaire (E, F) a confirmé une augmentation des paramètres pour chaque tissu. C, E) Avant (jour 0) et après (jour 3) les comparaisons par les tissus. D, F) Comparaison entre le jour 0 et le jour 3 en moyenne en utilisant un test t de Student apparié a confirmé une différence significative dans le nombre moyen de segments de vaisseaux (p &lt;0,0001) et le nombre moyen de germes (p &lt;0,00001) par zone vasculaire . Les barres blanches représentent jour 0, et les barres noires représentent jour 3. Values sont des moyennes ± SEM. Pour cette analyse représentative, 13 tissus ont été récoltés à partir de 2 rats. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig5.jpg" /> Figure 5. Le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour enquêter sur le sort vasculaire de l&#39; île et l&#39; incorporation dans les réseaux à proximité. En utilisant l&#39;imagerie time-lapse, îles vasculaires, défini comme segments endothéliales déconnectés, ont été identifiés le jour 0 et leur connexion au réseau à proximité a été confirmé par jour 3 stimulation post-angiogénique. Mésentère tissus ont été stimulées avec bFGF (A, B) et le VEGF / PDFG-BB (C, D). flèches creuses montrent des segments déconnectés le jour 0 et flèches pleines représentent la connexion de l&#39;île à l&#39;network. Arrowheads indiquent l&#39;emplacement des connexions entre une île vasculaire et le réseau à proximité. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig6.jpg" /> Figure 6. images Time-lapse démontrent la capacité d&#39;observer lymphatique et des vaisseaux sanguins patterning. Lymphatique (l) des navires peut être distingué des artérioles (a) et veinules (v) basée sur l&#39; étiquetage morphologie au jour 0 (A). Au jour 5 après stimulation avec 10% de sérum, la morphologie lymphatique est perdue et les vaisseaux semblent avoir intégré les vaisseaux sanguins angiogéniques voisines (B). Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande</a>version de ce chiffre. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig7.jpg" /> Figure 7. Macrophages restent présents dans les tissus mésentériques de rat en culture. Lectine / CD11b co-marquage des tissus cultivés pendant 3 jours avec 10% de sérum suggèrent que les cellules interstitielles positives lectine sont un sous-ensemble des macrophages. (A) Une image représentative de l&#39; étiquetage BSI-lectine. Étiquetage (B) CD11b dans le même champ de vision. (C) L&#39;image fusionnée. Les flèches identifient des exemples de co-marquage. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

6.8K vues.  Tulane University. Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis. 

Vidéo: An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Recherche

Immunologie et infection

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologie

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Médecine

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Un

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

In vitro et in vivo modèle pour étudier l'adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Assay Rat angiogenèse Mésentère

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l'angiogenèse

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour

Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca

Microperfusion Technique chargé d'enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Développement et caractérisation de