Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

NOT: Bu protokol tüm hayvan kullanımı Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar ve Doku 1. Tedavi <ol><li> Yönetim ve Kurban <ol><li> 5 dakika için% 3 izofluran ile hayvanların anestezisi ve ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu gözlemleyerek anestezi derinliğini kontrol edin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere veteriner merhem sürün. </li><li> hayvan tartılır ve 1.5 ml tüp içine ya da rodamin etiketli ELP, SynB1-ELP veya Tat-ELP bir 50 mg / kg dozda pipetle. sonraki adımda standart eğrilerin formülasyonu için tatbik edilen işaretlenmiş bileşiklerin 100 uL kaydedin. Not: standartlar floresan etiketleme etkinliğindeki değişkenlik nedeniyle farklılıklarını önlemek amacıyla hayvanlara uygulanabilir etiketli protein, aynı partiden elde edilmiş olması çok önemlidir. düzgün bir arka Fluores ortadan kaldırmak içinDaha sonra fluoresans ölçümleri ile ilgili artmasına neden olmuştur, işlem görmemiş hayvanlar ile tedavi edilen hayvanlarda da aynı yöntemler / reaktifler kullanılarak kurban gerekir. </li><li> Daha önce kuyruk ven ya da (kasıkta 1 cm kesi üzerinden erişilen) femoral ven kullanılarak 1 açıklandığı gibi bir IV enjeksiyon yönetme. kasık kesi durumunda analjezi için, 5 mg / kg bir dozda deri altından karprofen uygulanması ve yara bandı ile kapatılmasından önce insizyon noktasına sensorcaine uygulanır. burun (IN) yoldan yönetmek için, yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. </li><li> 2 uL pipet kullanarak, etiketli bileşim bir 1-ul damla yaparlar. Kısaca burun erişmesine izin vermek için anestezi yaka hayvanın kafasını kaydırın. </li><li> Tek bir Nare açılması pipet ucu yerleştirin ve yavaşça damlacık burun boşluğuna Nare aşağı çalışmasına izin veren, piston bastırın. tam doz reklamı kadar burun her damla alternatif, her 1 dakikada bir tekrarlayınızhizmet ettiler. Not: IN üzerinden uygulanan maksimum hacmi 10 geçmemelidir - fareler için 15 mcL. </li><li> bağımsız bir kafes içine, her hareket önce son uygulamadan sonra 10 dakika süre ile anestezi altında yatar pozisyonda hayvanlar bırakın. Not: sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. </li><li> 1 saat sonra, daha önce olduğu gibi hayvanlar yeniden anestezi en (PO4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 .7H 2 O 210.0 mg / l KH 2) PBS kullanarak transcardial perfüzyon yoluyla kurban 20 ml&#39;lik bir toplam 10 mL / dakika. Not: kurban perfüzyonundan dokular tüm kan çıkarmak için etiketli bileşiklerin ekstravasküler konsantrasyonlarını belirlemek için gereklidir. Perfüzyon reaktifler eşiğe değişikliklere neden olabilir ve tutarlı tutulmalıdır. Kurban yöntem tutarlı olmalıdırgruplar içinde. Kurban farklı yöntemler, damar içindeki kan düzeyleri değişen dokuların arka floresan değiştirerek neden olabilir. </li></ol></li><li> Dokuların Koleksiyonu <ol><li> dokularının durulanması için yukarıda tarif edildiği gibi PBS hazırlayın. Not: başka bir tampon perfüzyon sıvısı olarak kullanılır ise, aynı tampon içinde doku yıkayın. </li><li> Basit diseksiyon ile kalp, akciğerler, mide, karaciğer, dalak, böbrekler ve çıkarın. laboratuvarı kullanarak kurulayın veya aşırı nem fitil ve görüntüleme hasır üzerine dokuları yerleştirerek mendil kısa bir süre önce PBS içinde yıkayın. </li><li> fare başını kesmek ve kemik kesiciler veya rongeurs kullanarak kafatasının üst kaldırın. forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde bozulmamış koku ampuller tutarak, beyin kaldırmak. Kuru durulayın ve sağlanan görüntüleme mat üzerine yerleştirin. </li><li> Hızlı ejeksiyon 7 vasıtasıyla omurilik kaldırmak için, PBS ile 10 ml şırınga doldurun ve bir dulled 18-iğne takın. Not: 18 ayar uyuyorBirçok fare hatları yetişkin spinal kanal. gerekli çap boyutu, hayvan ile değişecektir. </li><li> decapitation yerinde spinal kanalın açılması temiz kesilmiş ve kan serbest edilmesini sağlamak, yüzükoyun pozisyonda hayvan yerleştirin. </li><li> omurga çevresindeki deri çıkarın. keskin kemik kesiciler veya makas kullanarak, kalça doğrudan rostral bel bölümünde omurga kesti. </li><li> Kısaca spinal kanalı görselleştirmek için PBS ile durulayın. Yavaşça spinal kanal içine iğne takın. Not: İğne rahat hissetmeniz gerekir ve ileri geri yerleştirilmesi sırasında bazı yavaş haddeleme gerekebilir. İğne gevşek hissetmeniz gerekir, bir daha rostral kesim yapılabilir ya da daha geniş çaplı bir iğne gerekebilir. </li><li> başparmak ve işaret parmağı kullanarak, eklenen iğnenin etrafında omuriliğe baskı uygulamak. orta ve sabit basınç ile piston bastırın. Omurilik spinal rostral açıklığın bozulmamış out çıkarırsütun. Not: uygun 5 içinde tamamlanabilir tüm önemli organların tamamen çıkarılmasını, durulama ve kurutma - 7 dakika. Bu kısa süre, aşırı ışığa maruz kalma ve dokudan etiketli proteinlerin liç neden olabilir PBS içinde genişletilmiş depolama ihtiyacını engeller. </li></ol></li></ol> 2. Tüm organ Ex Vivo Floresans Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme Parametreleri <ol><li> görüntü elde etme yazılımını başlatın. iktisap kontrol panelinin sağ alt tarafındaki, &quot;başlatılamadı.&quot; tıklayın </li><li> Altında &quot;görüntüleme modu,&quot; &quot;floresan&quot; onay kutusunu işaretleyin. Altında &quot;maruz kalma süresi&quot;, &quot;AUTO&quot; i seçin. </li><li> Altında &quot;binning&quot;, &quot;küçük&quot; seçin ve 2 F / Stop ayarlayın. </li><li> 535-nm uyarma ve 580 nm emisyon filtreleri seçin. Not: Bu, kullanılan etiket bağlı olarak değişecektir. </li><li> &quot;Görünüm B Alan&quot; seçin ve targe ayarlamak0.3 cm t yüksekliği. Not: Bu, görüntülenecek doku bağlı olarak değişecektir. </li><li> sıcaklık göstergesi (makine anlamına tamamen başlatılmış olan) yeşil döndüğünde, dokular tamamen birbirinden ayrılır sağlanması, sağlanan siyah arka plan hasır üzerine dokuları yerleştirin. Tüm dokular Seçilen alan ızgara içinde olmasını sağlamak, kamera içinde mat yerleştirin. lobların örtüşme azaltacak şekilde bu tür bütün karaciğer gibi büyük ve homojen olmayan dokular, ortaya konmalıdır. Not: Dokular, tek bir hayvan veya benzer tipteki tüm dokularını karşılamak için bir resim izin tek bir grupta birlikte düzenlenebilir. Bu daha kolay, daha sonra analiz ve organizasyon yapar. floresans yoğunluğunu büyük farklılıklar, çeşitli dokular arasında varsa, tek bir maruz kalma süresi tüm doku yoğunlukları için ideal olmayabilir gibi, bu görüntü bunları ayrı ayrı ya da aynı doku tipindeki grupları en iyisidir. </li><li> Tıklayın &quot;edinin.&quot; </li><li> görüntüleme hemen sonra, dokuların kaldırmak ve saklamak veya 4. adımda belirtildiği gibi, nicel histoloji için onları dondurmak. </li></ol></li></ol> 3. Standartlar ve Görüntü İşleme <ol><li> Standartlar <ol><li> PBS içinde 15 dilüsyonları toplam orijinal konsantrasyonda başlayarak hayvanların tedavisinde kullanılan her proteininin iki kat seri dilüsyonları oluşturabilir. Not: konsantrasyon aralığı, beklenen doku konsantrasyonları içerir hedeflemelidir ve başlangıç ​​konsantrasyonuna bağlı olarak, orijinal numune ek seyreltmeler gerektirebilir. </li><li> siyah 96 oyuklu plakanın her oyuğuna her bir standart Pipet 100 uL. eşiğe bir ölçü elde etmek için saf PBS bir kuyu yer alır. </li><li> Görüntü doku görüntüleme için kullanılan aynı parametrelerle standartları. </li><li> görüntü elde etme yazılımı altında &quot;Aracı Paleti&quot; &quot;ROI Araçları&quot; seçeneğini İlgi &quot;Bölge (ROI) &quot;Daire ve iyi birinin etrafında ROI çizin. ROI diğer dolu kuyulara tüm kopyalamak ve tıklayın &quot;İB&#39;leri ölçün.&quot; </li><li> diğer standartlar değerlerden saf PBS ortalama radyant verimlilik değeri çıkarma; Bu arka plan floresan kaldırır. Bir dağılım arsa üzerinde bilinen konsantrasyonda karşı değerleri çizilir. Not: Doğrusal eğilim çizgisinin ortaya çıkan denklem daha sonra göreceli floresan değerini hesaplamak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Görüntü işleme <ol><li> görüntü elde etme yazılımı olarak, serbest biçimli ROI aracını seçin ve bireysel dokuların her etrafında İB&#39;leri çizin. &quot;Önlem&quot; i tıklayın. </li><li> Elde edilen ortalama radyant verimlilik ölçümleri ile, her bir doku tipi işlenmemiş hayvandan ölçülen değerleri çıkarmak ve önceden oluşturulan standart eğri üzerinde bu değerleri çizmek. Not: Elde edilen nispi floresan değerleri hızlı ve doğru bir anlık sağlamaketiketli bileşimin biyolojik dağılım. </li></ol></li></ol> 4. Kantitatif Doku Histoloji <ol><li> Dilimleme için Dokuların hazırlanması ve Donma <ol><li> Oluşturma veya kullanım için yeterli seçilen dokular donmaya boyut ve kriyostat kapları satın. uygun büyüklükte bir ve şekilli nesnenin etrafında sarma alüminyum folyo iyi çalışıyor. </li><li> kuru buz ile 500 ml beher yarısını dolduran kısmen dondurma kabı daldırın kuru buz üzerinde yeterli miktarda sıvı olacak şekilde izopropanol ~ 350 mL ilave edilerek izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlayın. Not: Sıvı azot genellikle optimum kesim sıcaklık bileşik (OKT) ve gömülü dokuların kırık sonuçlanır ve kaçınılmalıdır. </li><li> Mevcut hiçbir kabarcıkları vardır sağlanması, OCT ile kısmen dondurma doldurun. kabarcıkları varsa, forseps kullanarak çözümün dışına kabarcıklar çalışmak ya da benzer bir uygulamaya. </li><li> doku çıkarmakPBS ve kuru iyice ya nazikçe mendil bir laboratuar ya da bir laboratuara hassas dokuların kenarları silin dokunmadan ve sıvı uzak fitil izin vererek onu okşamaya. </li><li> dokuda altında kabarcıklar tanıtmak için sağlanması, dondurma kabının içine OCT içine yavaşça doku yerleştirin. Doku yerleştirildikten sonra doku tamamen kaplıdır kadar, OCT ekleyin. </li><li> izopropanol kabın içinde maruz OCT ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğu kadar dondurma kabı Batmak. gerektiği sürece için -80 ° C&#39;de depolamadan önce, tamamen donmasına OKT ve doku için 90 s (ya da daha büyük dokular için potansiyel olarak daha fazla) - 30 izin verir. </li></ol></li><li> Dilimleme Standartlar hazırlanması. <ol><li> Hazırlama ve uygun haznenin ucunu kaldırarak 1 mL&#39;lik tek kullanımlık şırıngalar etiket, şırınga tüm uzunluğu bir çapı olacak şekilde. Bu donmuş silindir daha sonra dışarı itti olmasını sağlayacaktır. </li><li> BizeDaha önce PBS ile yapıldı okt, uygulanan bileşiklerin bir 15 adımlı, iki kat seri seyreltme oluşturmak ing fakat 1 mL&#39;lik bir son elde edilen hacmi. eşiğe değerleri çıkarmak için saf OCT bir örnek sayılabilir. </li><li> OCT viskozitesi yeterli karıştırma zorlaştırır. tüpleri ters çevirin ve Ekim tamamen yeniden tersini önce yerleşmek için izin verir. homojen bir karışım sağlamak için 20 kez - bu 10 tekrarlayın. Karıştırma sırasında ışıktan 4 ° C&#39;de ve uzak standart çözümler tutun. </li><li> Karıştırma işleminden sonra, daha önce olduğu gibi, izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlandı. Not: Sıvı azot da izopropanol / kuru buz karışımı yerine kullanılan bu donup sonra şırınga hızlı bir şekilde çıkarılır sağlanabilir. </li><li> mümkün olduğunca az kabarcıklar tanıtmak için özen, enjektöre Ekim standardını çizin. Ekim çözümü çizdikten sonra, hemen izopropanol doğrudan şırınga daldırma ve çözüm tamamen donmasına izin20 sn - 10 şırınga içinde. gerektiği kadar -80 ° C &#39;de şırınga saklayın. </li></ol></li><li> Dokuların ve Standartların Kesme <ol><li> -20 ° C hem de doku ve standartlar yerleştirin ve tüm numuneler sıcaklığına gelmesi için yeterli bir zaman tanır. Not: ideal kesme sıcaklığı genellikle en dokular için -10 ° C aralığında etrafında düşer, ama sonuçta doku boyutu ve yağ içeriğine bağlıdır ve ampirik olarak rafine edilmesi gerekir. </li><li> Daha önce 8 açıklandığı gibi bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron kalınlığında dilimler halinde dokuları kesmek ve slaytlar üzerine takar. -20 ° C&#39;de slaytlar Mağaza ve kesme sırasında ve tarama kadar uzakta mümkün olduğunca ışık onları tutmak. Not: Bölümler uygun doku bütün kalınlığı boyunca dağıtılan ölçülecek burada önemlidir. </li><li> Kriyostat mandren üzerine standartları monte etmek için, dondurucudan şırıngayı alıp 3 dışında sıcak - hol ile 5 sding o elinde. Ekim silindir kısa bir bölüm (~ 1 cm) kadar pistonu itin şırınga dışındadır. <ol><li> Bir jilet kullanarak, silindir kesti ve yerinde tutmak için OCT kullanarak, aynanın üzerine dik ortaya çıkan silindir bölümüne yerleştirin. iyi tanımlanmış çevreler yol açmalıdır Bu yapılandırma kesilmiş. </li></ol></li><li> bir slayt tüm standart eğri temsil edecek şekilde, tek bir slayt üzerine her seyreltme birer dilim yerleştirerek, 20 mikron silindir dilimleyin. Tarama için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li></ol></li><li> Tarama ve miktar tayini <ol><li> Tarama dizi yazılımını başlatın ve lazer başlangıç ​​prosedürü başlatmak için &quot;543 lazer&quot; i tıklayın. Lazer hazır hale getirilmesi için 15 dakika bekleyin. </li><li> Lazer hazır olduğunda, -20 ° slaytlar kaldırmak ve sıcaklığına gelmesi için büyük bir ışık korumalı konteyner içine taşıyın ve 3 dakika boyunca kurumaya. Bu sli nem oluşumunu engellerde tarayıcı. </li><li> slayt tarayıcı slayt yuvasına slayt yükleyin. Click &quot;tarama&quot; ve &quot;kolay tarama çalıştırın.&quot; </li><li> 50 um tarama çözünürlüğünü ayarlayın. </li><li> &quot;Florofor&quot; altındaki ilk &quot;kullan&quot; onay kutusunu seçin ve &quot;TRITC.&quot;% 80 PMT Gain ayarlayın. Not: Bu ayarlar florofor ve işaretli moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. </li><li> Sol tarafta, tarama alanı tüm slayt içerdiğinden emin olun. Tıklayın &quot;başlatın.&quot; </li><li> Taramadan sonra, &quot;Dosya&quot; seçin ve &quot;olarak kaydetmek&quot; ve sonra bir .tif olarak kaydetmek. Not: Doku ve standartların Slaytlar aynı ayarlara taranmalıdır. </li><li> ImageJ içine sonuçlanan görüntüleri yüklemek ve dokular ve standartları çevresinde İB&#39;leri seçin. &quot;Analiz&quot; sekmesi altında, &quot;ölçümleri set&quot; i seçin ve &quot;gri ortalama değer.&quot; Tıklayın220; tedbir &quot;. Not: Önceki tekniği gibi, arka plan flüoresan tüm ölçülen değerlerden çıkarılmalıdır. </li><li> bir standart eğri oluşturmak için bilinen konsantrasyonuna karşı standartları ortalama gri değeri ölçümleri çizilir. Not: dokulardan elde edilen ölçümler, her doku içinde ortalaması ve doku içinde konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri çizilmiştir olmalıdır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

Ex vivo bütün organ görüntüleme genellikle basit olmakla birlikte, bazı temel kavram ve tekniklerine bağlılık biyo-dağıtım ölçümlerin doğruluğunu artırabilir. Işık deneyimi kısa dalga boyları çoğu dokularda saçılma ve absorbans yüksek derecede anlamlı olan etkileri kısa dalga boylu fluorophores yarar. Bu fluorophores derin doku çalışmalarında uygulama sınırlı, ama onlar yüzey dokuları ya da göz içine bakarak deneylerde etkin olarak kullanılmaktadır. Tersine, ışığın uzun dalga boyları daha penetrasyon ve daha kalın dokular 10 ile daha doğru sonuçlar sonuçlanan önemli ölçüde daha az saçılma ve absorbansı tabi. spektrumun uzak kırmızı ve yakın kızılötesi (NIR) aralık (uyarma ~ 600 nm) düşmek fluorophores yaygın tüm hayvanlar veya daha büyük dokular için tercih edilmektedir. Bu uzun dalga boyu florofor, özellikle tis otomatik floresan kullanarak deneyler içinsues veya malzeme olasılıkla önemli bir husustur. 600 nm aralığında - örneğin, kemirgenler safra kesesinde içinde safra son derece otomatik floresan 500 dalga boylarında olduğunu. Bu büyük ölçüde karaciğer değerleri çarpık olabilir, çünkü görüntüleme önce safra kesesi kaldırmak için sık sık en iyisidir. bozulmamış karaciğer ve safra kesesi gerekli Alternatif olarak, spektrumun çok uzak ucunda bir uyarım dalga boyu ile bir flüorofor seçerek safra otomatik floresan etkisi sınırlayabilir. Ayrıca, ortak kemirgen Chows birçok spektrumun orta ve uzak-aralıkları boyunca yüksek fluoresces saflaştırılmamış yonca, içerirler. seçilmiş etiketler bu dalga boyları giren ve sindirim sistemi yansıması ise, diyet değişikliği muhtemelen en iyi seçenektir. Canlı görüntüleme sistemleri doğru olmayan homojen ve özellikle kalın dokuları ile kalın dokular (örneğin, bütün sıçan karaciğeri) ölçmek için tasarlanmış olsa da, daha doğru ölçümler sık sık canen karaciğer lobları mümkün olan en az üst üste gelecek şekilde, üzerinden doku yayılma elde edilebilir. Ayrıca, durumlarda dokular doku birden taraftan son derece çarpık işaretli moleküllerin dağılımı, görüntüleme ve bu ölçümlerin ortalama doğruluğunu artırmak nerede. Son olarak, doku tipi, görüntülenecek, dokulara ve tatbik işaretli moleküllerin potansiyel dağılımı ile ilişkili malzemelerin otomatik floresans dikkatle sınırlayan, uygun uyarım ve emisyon dalga boyları ile bir flüorofor seçmek için dikkate alınmalıdır mümkün olduğu kadar çok girişim. kantitatif doku histolojisi yaparken, akılda tutulması gereken birkaç önemli detay vardır. Sonuçlar doğru olduğu için, dilim tam doku veya bölgede alınmalıdır analiz edilecek. Bu dokular diğer işlemler için uygun olmayacak demektir. Düzeltmek ve leke sonra mümkün olabilirtarama, ancak dilim gelecek boyama etkileyebilecek tarayıcı, içine koyarak önce biraz kurumasını bekleyin, genellikle en iyisidir. Aynı şekilde, tarama sonraki işlemlerde potansiyel sinyali azaltarak, foto-ağartma belli bir düzeyde neden olacaktır. alt mikroskop uygulamalarında, üst bölümleri tipik haliyle dokuları sabitlemek ve kesit önce bir sükroz solüsyonunda dengelenmesi ile elde edilir. Bununla birlikte, bu işlem, en iyi sonucu tespit ve / veya uzun sükroz etkileri yukarıdaki ölçüm histoloji protokolünde flüoresans yoğunluğuna ıslatır önlenir. ortam ışığının bile düşük düzeyde maruz Ayrıca, sinyal miktarına bağlı olarak, dilim fotoğraf ağartma karşılaşabilirsiniz. Soğuk ve ışıktan uzak slaytlar tutulması önemli ölçüde ortaya çıkan ölçümlerin doğruluğunu artıracaktır. Genel olarak, dikkatli kullanım ve hazırlık ölçüde nihai sonucu artırabilir. Diğer çeşitli vardıryöntemleri biyo-dağılımı ve teknik zorluk, verim, doğruluğu büyük ölçüde değişmektedir uygulanan makromoleküllerin farmakokinetiğini incelemek için kullanılan ve ekipman 11 gerektiriyordu. Kantitatif immüno biyoaktivitenin deneyleri hem teknik karmaşık ve maliyeti ve iş gücü önemli ölçüde ilave tatbik moleküllere ya da antikorlar gerektirebilir. Radyoizotop etiketleme dayalı birden çok yöntem doğruluğu değişen, geçmişte kullanılmıştır, ancak makromoleküllere radyoizotopların entegrasyonu yanı sıra veri kendisi toplanması, önemli bir hazırlık gerektirir ve genellikle daha 12 analizleri için tamamen kullanılamaz dokuları hale getirebilir. Son olarak, pozitron emisyon tomografisi ve kütle spektrometrisi gibi etkili olduğu gösterilmiştir, diğer yöntemler, tipik olarak gerekli olan ekipmanın eksikliği, sadece önceden engellenmektedir. Yukarıda tarif edilen protokol etkin th belirlenmesi için birlikte iki yöntem kullanannedeniyle gerekli olan ekipmanların düzenli availably hızlı, düşük maliyetli, doğru ve kolay erişilebilir bir şekilde etiketlenmiş moleküllerin e biyo-dağılımı. Bu yöntem, merkezi sinir sistemine işaretli moleküllerin uygulanması için en iyi ve en vektörü ve uygulama yolunun belirlenmesi, yukarıdaki verileri üretmek için kullanıldı. Ex vivo verilerden ELP IN idare ve ELP IV kantitatif doku histolojisi yoluyla ileri karakterizasyon için tespit edilmiştir uyguladı. Kantitatif doku histolojisi nihai sonuçlar çıkarılabilir sağlayan MSS belirli bölgelerde işaretli moleküllerin konsantrasyonları sağladı. iki yöntem birlikte birden fazla spesifik bileşiklerin biyo-dağılımının detaylı bir muayene için hızlı ve etkili bir şekilde temsil etmektedir.

Floresan etiketleme bileşiklerin biyo-dağılımını belirlemek birçok laboratuvar için ortak olan bir ekipman kullanılarak çeşitli için kolaylıkla kullanılabilir ve etkili bir yöntemdir. Fluorophores nispeten ucuz, yaygın olarak kullanılabilir ve birden etiketli moleküller müdahalesi olmadan aynı anda kullanılabilir şekilde dalga boylarında, çeşitli gelir. Çoğu fluorophores hedef bileşiklere farklı reaktif gruplara konjugasyon için kimyaları bir dizi var ve konjugasyon süreci reaktif sitelerin çoğu türleri için genellikle basittir. Buna ek olarak, floresan etiketli bileşiklerin ölçümü için gerekli olan ekipmanın birçok laboratuvar yaygındır. Floresan mikroskoplar, kameralar, ve slayt tarayıcıları tüm florasan etiketleme kullanımı son derece erişilebilir hale farklı durumlarda kullanılabilir. Floresan etiketler sıklıkla viv in vivo ve ex hem bileşiklerin biyo-dağılımı ve kinetiklerini belirlemek için kullanılırBöyle IVIS Spektrum Imager olarak ve kantitatif doku histolojisi 2,3 canlı görüntüleme cihazları ile o. Canlı görüntüleme cihazları kullanılarak ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kullanımı nedeniyle kullanımı ve hızlı bir şekilde tissues4 daha işlem gerektirmeden etiketli bileşiklerin nispi konsantrasyonlarının doğru bir karşılaştırma oluşturma yeteneği kolaylıklan zamanla artmıştır. Ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kolay analiz ve karşılaştırma için izin verebilir ancak bununla birlikte, bir doku içinde, mutlak bileşik konsantrasyonları bir nicel ölçümünü oluşturmaz. Bu dokunulmamış organlar içindeki ışık dağıtma etkilerine bağlıdır. (Daha az bir ölçüde, absorbans ve) ışık saçılımı doku büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre değiştiğinden, bütün organın görüntülenmesi büyük veya yoğun organlarda doku düzeylerini hafife. bir kalınlığa taklit gerekir çünkü mutlak konsantrasyon ölçümleri için uygun standartlar formüle da zordurve her bir organ yoğunluğu. Diğer taraftan, bütün organın görüntülenmesi bir maddenin göreli doku seviyelerini elde etmek için bir hızlı bir yöntemdir ve bu (örneğin ilaç hedefleme çalışmalarda olduğu gibi) çok sayıda ilgili moleküllerin nispi biyo-dağılımı karşılaştırma için idealdir. Alternatif bir diğer strateji, kantitatif fluoresans histolojisi, kantitatif otoradyografi için açıklanan yöntemle elde edilen bir teknik kullanmak için bir deney maddesinin 5,6 mutlak doku düzeylerini elde etmektir. Aksine bir hayal cihaz içine bütün bir hayvan ya da bir organ yerleştirerek daha, nicel doku histolojisi her doku taranan slaytlar, üzerine monte edilmiş, dilimlenmiş ve bireysel analiz gerektirir. Test maddesinin Standartları hazırlanmış ve organ örnekleri gibi aynı kalınlıkta dilimlenir. Aynı kalınlığa tüm organ ve standartlar keserek ışını tarama ya da emiş nedeniyle değişkenlik ortadan kalkar, ve doku floresan yoğunluğu, mutlak konsantrasyonlarda belirlemek için standart eğriye uydurulmuş olabilirrasyon. doğru yapılan bu yöntem, kantitatif olsa da, aynı zamanda, emek-yoğun ve kolay bir şekilde hatalı olduğunu. Bütün organ görüntüleme ile karşılaştırıldığında nicel histoloji ve emek önemli ölçüde daha yüksek maliyetle daha karmaşık doğası göz önüne alındığında, her süreç floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını incelerken kullanmak en pratik olduğu incelemek için değerli hale gelir. Bu protokol ile, bu yöntemler ya da SynB1 veya TAT hücre nüfuz peptitlerinin ilavesi olmadan etkili bir şekilde rodamin etiketli elastin gibi polipeptit (ELP) biyo-dağılımı karşılaştırma birlikte kullanılabilir dair ayrıntılı bir açıklama sağlar intranazal (İN) ve damar içi (IV) uygulama yolları.

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;Reagents&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimide derivitized fluorophors (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Buffer for rinsing</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Used for freezing and mounting</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Equipment&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For &lt;em&gt;ex vivo&lt;/em&gt; whole organ imaging</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>For cryosectioning</td></tr><tr><td>Fluorescence slide scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For slide scanning</td></tr></tbody></table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Floresan etiketleme in vitro ve hem de in vivo deneysel koşullar altında çeşitli işaretli moleküllerin kaderini incelemek için iyi bilinen bir işlemdir. Floresan probları bir küçük moleküllü floresan işarete ilave kinetiği ya da bu bileşiğin biyo-dağılımı etkileyecek olası değildir tatbik büyük moleküllerin biyolojik dağılımını belirlenmesinde özellikle yararlıdır. çeşitli yöntemler gerekli çaba miktarda önemli ölçüde değişebilir ve biyo-dağılımını incelemek ana kadar elde edilen ölçümler, tam miktar, ancak biyo-dağılımı analiz etmek için hızlı ve etkili bir sistem sağlayabilir bağlantılı olarak, çeşitli yöntemler kullanılarak ister. Ex vivo bütün organ görüntüleme hızlı doku içinde ve doku veya tedavi gruplarının çok tip arasındaki flüoresan moleküllerinin görece konsantrasyonlarının karşılaştırma kullanılabilecek bir yöntemdir. Bir görüntüleme plat kullanılmasıdokulara içinde canlı hayvan veya bütün organ görüntüleme, floresan için tasarlanmış form genel biyo-dağılımının doğru bir resim sağlarken zamandan ve işçilikten tasarruf, başka bir işleme tabi belirlenebilir. Bu işlem, bir bileşiğin doku özgüllüğünü belirlemeye çalışan deneylerde veya birden fazla farklı bileşiklerin karşılaştırma için idealdir. Öte yandan kantitatif doku histolojisi etiketli bileşiklerin nicel ölçü oluşturmak üzere dokuların detaylı ilave işlem gerektirmektedir. doğru biyo-dağılımını değerlendirmek için, ilgilenilen tüm dokular, dilimlenmiş taranır ve dokular veya gruplar arasında karşılaştırmalar yapmak için standart eğrileri göreli analiz edilmelidir. Kantitatif doku histoloji dokuları içinde mutlak bileşik konsantrasyonlarını belirlemek için altın standarttır. Burada, her iki yöntem, farklı uygulama yöntemleri, bir yeteneğinin tayin edilmesi için bir arada etkin bir kullanım şeklini açıklarnd bileşik değişiklikler hedef ve merkezi sinir sisteminde 1&#39;e floresan etiketli molekülleri teslim etmek.

Hücre nüfuz peptidler (SynB1-ELP ve Tat-ELP) 9 ile modifiye ELP ve ELP iki sürümü olarak bilinen bir ilaç aktarım vektörü: Bu veriler, üç bileşiğin verilmesini açıklamaktadır. Her üç bileşikler tetramethylrhodamine-5-maleimid ile etiketlenmiş ve iki uygulama yolları aracılığıyla teslim edildi (IN ve IV). Bu deneylerin amacı, merkezi sinir sistemi (MSS) 3 içine en iyi nüfuz neden olur, bu bileşik ve uygulama yoluna belirlemekti. Şekil 1A görüntüler temsilcisi ex vivo tedavi edilen hayvanlardan elde organlarının bütün organ görüntüler. ısı haritası bindirme dokuları içinde radyant verimlilik floresan seviyelerini gösterir. Bireysel dokular çevresinde ve bunlara karşılık gelen standart bir eğri ile bu değerlerin konulması sureti ile ROI&#39;ler çizerek, Şekil 1B de gösterilen standart floresan değerleri oluşturulur. standart flüoresance değerleri daha sonra farklı terkiplerin göreli konsantrasyonları doğru karşılaştırma için kullanılabilir. Bu veriler, doğru belirli dokulara nüfuz ilgili ELP modifikasyonunun etkisi, hem de her bir bileşik ilgili uygulama yolunun etkisini hem de açıklar. Bu sonuçlarla, IN uygulama yoluyla ELP teslim MSS ulaşmak için en etkili kombinasyon olduğunu hemen açıktır. Bu sonuçlar iyi nüfuz bileşik ve dağıtım yöntemini belirlemenize yardımcı olsa da, gerçek konsantrasyon veya merkezi sinir sistemi içinde bileşiklerin bölgesel lokalizasyonu tarif yoktur. seçilen beyin bölgelerinin sayısal ölçümler için izin verdiği niceliksel histoloji, bu bileşiklerin biyo-dağılımının açıklamasını tamamlamak için idealdir. Şekil 2A ELP IN ile tedavi edilen hayvanların temsili bir dilim görüntüler ve Şekil 2B ROI ayıran kantifikasyonunu açıklarkoku ampuller, hemisfer ve beyincik. Bu verilerden, IN yoluyla ELP yönetiminin yüksek MSS konsantrasyonlarda neden olabilir iken, öncelikle koku ampuller ve beyincik yapar açıktır. Tersine, ELP IV daha düşük toplam konsantrasyonlarını vardır, ama eşit beyinde boyunca dağıtılır teslim. Bu verilen bileşiklerin hedef ve diğer organlarda etki potansiyeli bağlı olarak, IN veya IV yönetim ya daha iyi bir seçim olabilir. Bu nicel histoloji ilavesi olmaksızın sonucuna olamazdı. Teknik olarak, kantitatif histoloji her grup her dokuda kullanılmış olabilir, ama yine de aynı sonuca neden olurken bu iki yöntem birlikte kullanılarak, zaman ve emek büyük bir kurtuldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig1.jpg" /> Şekil 1: Ex Vivo Tüm organ FloresanÖlçümler. A) ELP grubundan Temsilcisi görüntüler. ısı haritası ölçeği radyant verimlilik olarak belirlendi. B) Ortalama ışıma etkinlik değerleri biyo-dağılımının karşılaştırılması için kullanılan standart bir floresan değerleri üretmek için bir standart eğri ile analiz edildi Bireysel dokular yaklaşık ROI oluşturulması ile elde edilmiştir. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (McGowan gelen Modifiye, vd;. İlaç Tasarımı, Geliştirilmesi ve Terapisi; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig2.jpg" /> Şekil 2: Kantitatif Doku Histoloji Ölçümleri. Dilimleri O monte ELP içi veya 20 um kalınlıkta dilimleme beyinleri tarafından oluşturulan IV ile tedavi edilen hayvanların A) Örnek görüntün slaytlar ve daha sonra bir floresan slayt tarayıcı kullanarak bu slaytları tarama. B) | ig / ml konsantrasyon ölçümlerini üretmek için standart bir eğri ile ortalama gri değeri olarak ölçülen ve uyum, koku ampul, hemisfer ve beyincik yaklaşık İB&#39;nin oluşturulması ile elde edilen ortalama değerler. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (McGowan gelen Modifiye, vd;. İlaç Tasarımı, Geliştirilmesi ve Terapisi; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Görüntüleme.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir. 

Video: The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Tıp

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Hibrid uCT-FMT görüntüleme ve görüntü analizi

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Biyomühendislik

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Kanser Araştırmaları

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Floresan Reporter miktar tayini ile tüm organ patojen takibi

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Yazar Spotlight: Dokularda Antibiyotiklere ve Bağışıklık Sistemine Bakteriyel Tepkilerin Çözülmesi

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Kullanımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü

Hibrid uCT-FMT görüntüleme ve görüntü analizi

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi