Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

בעוד הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים היא פשוטה בדרך כלל, ההדבקות כמה מושגים בסיסיים וטכניקות יכולות לשפר את הדיוק של מדידות ביו-הפצה. אורכי גל קצרים של ניסיון אור רמה גבוהה של פיזור וספיגה ברוב הרקמות, אשר באופן משמעותי משפיע על השירות של fluorophores-אורך הגל הקצר. fluorophores אלה מוגבלות יישום במחקרי רקמות עמוקות, אבל הם שמשו ביעילות בניסויים מסתכלים רקמות משטח או לתוך העין. לעומת זאת, אורכי גל ארוכים של אור לעבור באופן משמעותי פחות פיזור וספיגה, וכתוצאה מכך חדירה רבות יותר ותוצאות מדויקות יותר עם רקמות עבות 10. Fluorophores אשר נופל רחוק אינפרא אדום-אדום הקרוב (NIR) הטווח (עירור ~ 600 ננומטר) של הספקטרום נבחר בדרך כלל לבעלי חיים שלמים או רקמות גדולות. בניסויים באמצעות fluorophores ארוך הגל אלה, הקרינה האוטומטית של tis בפרטתובעת או חומרים הוא שיקול מרכזי סביר. לדוגמה, המרה בתוך כיס המרה של מכרסמים מאוד אוטומטי פלורסנט באורכי גל של 500 - טווח ננומטר 600. בגלל זה יכול מאוד להטות ערכים כבדים, הוא לעתים קרובות טוב ביותר כדי להסיר את כיס המרה לפני ההדמיה. לחלופין, אם הכבד השלם כיס מרה נדרש, בחירת fluorophore עם גל עירור בסוף רחוק מאוד של הספקטרום יכולה להגביל את השפעתם של פלואורסצנציה האוטומטית המרה. בנוסף, חלק ניכר מן Chows המכרסם הנפוץ לכלול אספסת unpurified, אשר מאירה מאוד ברחבי אמצע ומרחיקות הטווחים של הספקטרום. אם התוויות נבחרו לנפול בתוך באורכי גל אלה ואת מערכת העיכול היא להיות צלמה, שינוי בתזונה הוא האפשרות הטובה ביותר סביר. בעוד מערכות הדמיה לחיות נועדו למדוד רקמות עבות במדויק, עם הלא הומוגנית עבות במיוחד רקמות (למשל, כבדי עכברוש שלמים), מדידות מדויקות יותר יכולות לעתים קרובותen להיות מושגת על ידי הפצת ממחטת נייר, כך האונות של הכבד חופפים מעט ככל האפשר. כמו כן, במקרים בם יש רקמות חלוקות מוטה מאוד של מולקולות שכותרתו, הדמיה מן מרובי צידי הרקמה והעמידו ממוצע מדידות אלה עשויות לשפר את רמת הדיוק. בסופו של דבר, סוגי הרקמות להיות צלמו, את הקרינה האוטומטית של חומרים הקשורים ברקמות אלו, ואת ההפצה פוטנציאל של מולקולות שכותרתו מנוהלות יש לשקול בזהירות על מנת לבחור fluorophore עם אורכי גל העירור ופליטה המתאימים מגביל התערבות רבה ככל האפשר. בעת ביצוע היסטולוגיה רקמה כמוני, ישנם מספר פרטים חשובים שכדאי לזכור. על מנת להשיג את התוצאות לדייק, פרוסות חייבות להילקח ברחבי הרקמה או האזור כולו להיות מנותח. משמעות הדבר היא כי רקמות אלה לא תהיינה זמינות עבור תהליכים אחרים. ייתכן שניתן יהיה לתקן כתם לאחרסריקה, אבל זה בדרך כלל טוב ביותר כדי לאפשר את הפרוסות להתייבש מעט לפני שמכניס אותם לתוך הסורק, שעלול להשפיע מכתים בעתיד. כמו כן, הסריקה תגרום רמה מסוימת של צילום לבן, הפחתת אות הפוטנציאל בתהליכים הבאים. עבור יישומים במיקרוסקופ במורד הזרם, סעיפים מעולה בדרך כלל מושגות על ידי תיקון רקמות equilibrating אותן בתמיסה סוכרוז לפני חתך. עם זאת, תהליך זה הוא נמנע הטוב ביותר בפרוטוקול היסטולוגיה הכמותיים לעיל בשל השפעות של קיבעון ו / או סוכרוז ארוך נספג על עוצמת הקרינה. כמו כן, בהתאם לכמות של הווה אות, פרוסות עלולות להיתקל צילום הלבנה אם חשופות אפילו לרמות נמוכות של אור הסביבה. שמירה על השקופיות קרות הרחק מאור תשפר משמעותית את הדיוק של מדידות וכתוצאה מכך. בסך הכל, טיפול והכנה זהירים יכולים לשפר את התוצאה הסופית דרסטי. יש מגוון של אחריםהשיטות הננקטות לחקר ביו-הפצה הפרמקוקינטיקה של מקרומולקולות מנוהל המשתנות נרחב הקושי הטכני, תפוקה, דיוק, ואת הציוד הנדרש 11. immunoassays כמוני מבחני פעילות ביולוגיים הן יכולים להיות מסובכים טכניות ודורשים נוגדנים או חומרים כימיים ספציפיים המולקולות המנוהלות, מוסיפים תוספת משמעותית את העלות והעבודה. שיטות מרובות המבוססות על תיוג רדיואיזוטופיים שמשו בעבר, עם משתנה דיוק, אבל השילוב של רדיואיזוטופים אל מקרומולקולות, כמו גם האוסף של המידע עצמו, יכול דורש הכנה משמעותית ולעתים קרובות יכול לדקלם רקמות שמישות לחלוטין עבור מנתח 12 נוסף. לבסוף, שיטות אחרות כיעילה, כולל טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים ו ספקטרומטריית מסה, הם בדרך כלל מנועה פשוט בגלל חוסר הציוד הנדרש. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש בשתי שיטות בשיתוף לקביעה ביעילות הדואר ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו בצורה מהירה, חסכונית, מדויק, ונגיש בשל availably הקבוע של הציוד הנדרש. שיטה זו שימשה כדי להפיק את הנתונים לעיל, זיהוי המסלול וקטור ומינהל הטוב ביותר עבור משלוח של מולקולות שכותרתו אל מערכת העצבים המרכזית. מהנתונים vivo לשעבר, ELP מנוהל ו ELP מנוהל IV זוהו לאפיון נוסף באמצעות היסטולוגיה רקמה כמותית. היסטולוגיה רקמה כמותי אז סיפק הריכוזים של מולקולות שכותרתו באזורים ספציפיים של מערכת העצבים המרכזית, המאפשר להיגרר המסקנות הסופיות. שתי השיטות יחד מייצגות דרך מהירה ויעילה כדי לבצע בחינה מפורטת של ביו-ההפצה של תרכובות מסוימות מרובות.

תיוג פלורסנט הוא שיטה מנוצלת בקלות ויעילה לקביעת החלוקה-ביו של תרכובות, באמצעות מגוון של ציוד המשותף במעבדות רבות. Fluorophores זמין באופן נרחב, יחסית לא יקר, מגיע במגוון של אורכי גל, כך מולקולות שכותרתו מרובות ניתן להשתמש בו זמנית ללא הפרעה. לרובם יש fluorophores מגוון של כימיות עבור נטייה לקבוצות תגובתי שונות על תרכובות מטרה, ותהליך הנטייה הוא פשוט בדרך כלל על מרבית סוגי אתרים תגובתי. בנוסף, הציוד הדרוש לשם המדידות של תרכובות שכותרתו fluorescently נפוצים במעבדות רבות. מיקרוסקופים פלורסנט, הדמיה, וסורקים שקופיות יכולים לשמש בנסיבות שונות, מה שהופך את השימוש של תיוג פלורסנט נגיש מאוד. תוויות פלורסנט משמשים לעתים קרובות כדי לקבוע את חלוקת-ביו קינטיקה של תרכובות הן in vivo לשעבר vivo עם מכשירי הדמיה לחיות, כגון Imager ספקטרום IVIS, ועל ידי היסטולוגיה רקמה כמותית 2,3. שימוש הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים באמצעות התקני הדמיה חיה במהלך השנים גדלות בשל קלות שימוש שלהם ואת היכולת ליצור השוואה מדויקת במהירות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו ללא צורך בעיבוד הנוסף של tissues4. עם זאת, בעוד הדמית vivo לשעבר שלם-איבר יכולה לאפשר ניתוח קל והשוואה, זה לא ליצור מדד כמותי של ריכוזי מתחם מוחלטים בתוך רקמה. זאת בשל תופעות פיזור אור בתוך איברים שלמים. מאז פיזור אור (ו, במידה, ספיגה פחותה) משתנה לפי גודל רקמות צפיפות, הדמיה כולו באיברים יכולה לזלזל רמות רקמות באיברים גדולים או צפופים. גיבוש סטנדרטים מתאימים למדידות ריכוז מוחלטות הוא גם קשה כי צריך לחקות את העוביוצפיפות של כל איבר יחיד. מצד השני, הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה קבלת רמות הרקמות היחסיות של סוכן, והוא אידיאלי עבור השוואה ביו-ההפצה היחסית של מולקולות הקשורות מרובות (כגון במחקרי מיקוד סמים). אסטרטגיה חלופית היא להשתמש היסטולוגיה הקרינה כמותי, טכניקה נגזר שיטת autoradiography כמותיים, כדי להשיג רמות רקמות מוחלט של סוכן הבדיקה 5,6. במקום למקם חיה או איבר שלמה לתוך מכשיר דמיון, היסטולוגיה רקמה כמוני דורשת שכל רקמה להיות פרוסה, רכוב על שקופיות, סרק, ונותחה בנפרד. התקנים של סוכן הבדיקה ערוכים ופרוסים באותו עובי כמו דגימות איברים. על ידי גזירה כל האיברים ותקנים באותו עובי, השתנות עקב פיזור או ספיגת האור מתבטלת, ועוצמת הקרינה ברקמות יכול להיות בכושר כדי עקומת סטנדרט לקבוע concent מוחלטמָנָה. אמנם שיטה זו, כאשר נעשה כראוי, הוא כמוני, הוא גם עתירי עבודה כשלה בקלות. בהתחשב באופי מורכב יותר של היסטולוגיה כמותיים העלות הגבוהה יותר באופן משמעותי של עבודה בהשוואת הדמיה כולו באיברים, הוא הופך להיות כדאי לבחון היכן כל תהליך הוא הכי פרקטי להשתמש כאשר בוחן את ההתפלגות ביו של תרכובות שכותרתו fluorescently. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך שיטות אלה יכולים לשמש יחד כדי להשוות את ביו-הפצה יעילה של פוליפפטיד אלסטין דמוי שכותרתו rhodamine (ELP), עם או בלי תוספת של פפטידים התא חודר SynB1 או טאט, דרך אפי (IN) ו תוך ורידי (IV) נתיבי ממשל.

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;Reagents&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimide derivitized fluorophors (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Buffer for rinsing</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Used for freezing and mounting</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Equipment&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For &lt;em&gt;ex vivo&lt;/em&gt; whole organ imaging</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>For cryosectioning</td></tr><tr><td>Fluorescence slide scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For slide scanning</td></tr></tbody></table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

תיוג פלורסנט הוא תהליך ומבוסס לבחינת גורלו של מולקולות שכותרתו תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי הוא במבחנת in vivo. בדיקות ניאון הם שימושיות במיוחד בקביעה-ההפצה ביו של מולקולות גדולות מנוהלות, שבו התוספת של תווית ניאון מולקולות קטנות, ישפיע על קינטיקה או ביו-הפצה של המתחם. מגוון שיטות קיימים לבחון ביו-הפצה להשתנות באופן משמעותי את כמות המאמץ הנדרשת והאם המדידות וכתוצאה מכך הם כמוני מלאים, אבל בשיטות מרובות בשיתוף יכולות לספק מערכת מהירה ויעילה לניתוח ביו-הפצות. Ex vivo הדמיה-איבר שלם היא שיטה שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את הריכוזים היחסיים במהירות של מולקולות ניאון בתוך רקמות ובין סוגים שונים של רקמות או קבוצות הטיפול. שימוש plat הדמיהטופס מיועד-חי או הדמיה כולו באיברים, קרינה בתוך רקמות שלמות ניתן לקבוע ללא עיבוד נוסף, תוך חיסכון בזמן עבודה תוך מתן תמונה מדויקת של ביו-ההפצה הכוללת. תהליך זה הנו אידיאלי בניסויים מנסים לקבוע את הספציפיות רקמות של תרכובת או עבור ההשוואה של תרכובות שונות מרובות. היסטולוגיה רקמו כמוני המצד השני דורשת עיבוד נוסף נרחב של רקמות על מנת ליצור מדד כמותי של התרכובות שכותרתו. כדי להעריך ביו-הפצה מדויקת, כל הרקמות של עניין חייבות להיות פרוסות, סרק, ונותחו ביחס עקומות סטנדרטיות כדי לערוך השוואות בין רקמות או קבוצות. היסטולוגיה רקמו כמוני הוא תקן זהב להחלטת ריכוזים מתחמים מוחלטים בתוך רקמות. כאן אנו מתארים כיצד שתי השיטות ניתן להשתמש יחד ביעילות כדי להעריך את היכולת של שיטות ממשל שונות בתnd שינויים במתחם למקד ולספק מולקולות שכותרתו fluorescently למערכת העצבים המרכזית 1.

הנתונים שלהלן מתארים את המסירה של שלושת המתחמים: וקטור להולכת תרופות המכונה ELP ואת שתי גרסאות של ELP שונה עם פפטידים חודר תאים (SynB1-ELP ו טאט-ELP) 9. כל שלושת המתחמים תויגו עם tetramethylrhodamine-5-maleimide ונמסרו באמצעות שני מסלולים הממשל (IN ו- IV). מטרת המחקרים הללו הייתה לקבוע אילו מתחם ותוואי ממשל יביא החדירה הכי הטובה למערכת העצבים המרכזית (CNS) 3. איור מציג 1A נציג לשעבר vivo תמונות-איבר שלם של איברים קבוצת החיות שטופלה. ההצגה על גבי המפה החומה מראה את רמות הקרינה יעילה קורנים בתוך הרקמות. על ידי ציור ROIs סביב רקמות פרט על ידי התוויית הערכים האלה על עקומת הסטנדרט המתאימה, ערכי קרינה סטנדרטיים באיור 1B נוצרים. Fluorescen הסטנדרטיתערכים ce לאחר מכן ניתן להשתמש להשוואות מדויקות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שונות. נתונים אלה לתאר במדויק הם את השפעת שינוי ELP על החדירה לרקמות ספציפיות, כמו גם את ההשפעה של מסלול ממשל על כל מתחם. עם תוצאות אלה, ברור מיד כי משלוח ELP באמצעות הממשל הוא השילוב היעיל ביותר להגיע CNS. למרות שתוצאות אלה לעזור לקבוע את שיטת המתחם המסירה הטובה ביותר חודר, הם לא מתארים את הריכוז בפועל או לוקליזציה האזורי של תרכובות בתוך מערכת העצבים המרכזית. היסטולוגיה כמותי ולכן הוא מתאים ביותר כדי להשלים את התיאור של ביו-ההפצה של תרכובות אלה, שכן היא מאפשרת מדידות כמותיות של האזורים במוח שנבחרו. איור 2 א מציג פרוסה נציג החיות שטופלו לפי ELP, ואיור 2B מתאר כימות של ROIs הפרדתנורה חוש ריח, ההמיספרות, ואת המוח קטן. מנתונים אלו, ברור כי בעוד ממשל ELP ידי התוואי עלול לגרום בריכוזים גבוהים CNS, הוא עושה זאת בעיקר נורה המוח הקטן חוש ריח. לעומת זאת, ELP נמסר יש IV ריכוזים כוללים נמוכים יותר, אבל זה מחולק באופן שווה בכל רחבי המוח. בהתאם ליעד של תרכובות המנוהלות אלה פוטנציאל תופעות באיברים אחרים, דרך או ממשל IV עשוי להיות הבחירה הטובה יותר. זה לא יכול להסתיים בלי התוספת של היסטולוגיה כמותית. מבחינה טכנית, היסטולוגיה כמותיים אפשר היה לנצל בכל רקמות של כל קבוצה, אלא על ידי ניצול שתי השיטות יחד, הרבה זמן ועבודה ניצל ועדיין וכתוצאה מכך לאותה מסקנה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig1.jpg" /> איור 1: Ex Vivo Whole-איבר קרינהמידות. א) נציג תמונות מקבוצת ELP. סולם מפת החום נקבע ליום יעילות קורן. B) ערכים יעילים קורנים ממוצע המתקבלים יצירת ROIs סביב רקמות הפרט כי נותחו על עקומת סטנדרט כדי ליצור את ערכי קרינה הסטנדרטיים המשמשים להשוואה של הפצות ביו. ברי שגיאה מייצגים SEM. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. (השתנה מ מקגואן, ואח &#39;;. והתרופות עיצוב, פיתוח, ותרפיה; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig2.jpg" /> איור 2: מדידות היסטולוגיה רקמות כמוני. א) תמונת נציג ELP-או חיות שטופל IV נוצרו על ידי מוח חיתוך 20 מיקרומטר עבים לתלייה הפרוסה oשקופיות n, ולאחר מכן סריקה אלה שקופיות באמצעות סורק שקופיות קרינה. B) ערכים ממוצעים המתקבלים יצירת ROIs סביב הנורה חוש הריח, ההמיספרות, המוח הקטן, נמדד כערך האפור המרושע לנכון עקומת סטנדרט ליצור מדידות ריכוז מיקרוגרם / מיליליטר. ברי שגיאה מייצגים SEM. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. (השתנה מ מקגואן, ואח &#39;;. והתרופות עיצוב, פיתוח, ותרפיה; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכותרתו.

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Views.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכ?...

Video: The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Bioengineering

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Cancer Research

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

מעקב אחר פתוגן של איברים שלמים באמצעות כימות כתב פלואורסצנטי

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

מחבר זרקור: חשיפת תגובות חיידקים לאנטיביוטיקה ולמערכת החיסון ברקמות

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

השימוש של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

רומן ברזולוציה גבוהה

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים