Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز غير واضحة عموما، والتمسك بعض المفاهيم والتقنيات الأساسية يمكن أن يحسن من دقة القياسات توزيع الحيوي. موجات قصيرة من الخبرة الخفيفة على درجة عالية من التشتت والامتصاص في معظم الأنسجة، والتي كثيرا يؤثر على فائدة fluorophores الطول الموجي القصير. وهذه fluorophores تطبيق في دراسات عميقة الأنسجة محدودة، ولكنها كانت تستخدم على نحو فعال في التجارب تبحث في الأنسجة السطحية أو في العين. على العكس من ذلك، موجات طويلة من ضوء تخضع أقل بكثير نثر والامتصاصية، مما أدى إلى مزيد من الاختراق والنتائج أكثر دقة مع الأنسجة سمكا 10. Fluorophores التي تقع في الأشعة تحت الحمراء بعيدة الحمراء وبالقرب من (الجرد) مجموعة (الإثارة ~ 600 نانومتر) من الطيف يتم اختيار عادة للحيوانات كلها أو الأنسجة أكبر. في تجارب تستخدم هذه fluorophores الطول الموجي الطويل، لصناعة السيارات في مضان تيس معينيقاضي أو مواد من المحتمل أن تكون الاعتبارات الرئيسية. على سبيل المثال، الصفراء داخل المرارة من القوارض هي غاية لصناعة السيارات في فلوري في موجات في 500 - مجموعة نانومتر 600. لأن هذا يمكن أن تحرف كثيرا القيم الكبد، غالبا ما يكون أفضل لإزالة المرارة قبل التصوير. بدلا من ذلك، إذا طلب من الكبد سليمة والمرارة، واختيار fluorophore مع الطول الموجي الإثارة في مكان ناء جدا من الطيف يمكن أن تحد من نفوذ الصفراء لصناعة السيارات في مضان. بالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من الأطعمة القوارض المشتركة يحتوي البرسيم غير المكرر، الذي تتفلور للغاية في جميع أنحاء بعيدة نطاقات المتوسطة ومن الطيف. اذا انخفضت التسميات المختار ضمن تلك الموجات والجهاز الهضمي هي للتصوير، وتغيير في النظام الغذائي هو على الأرجح أفضل خيار. في حين نظم التصوير الحية تهدف إلى قياس دقيق الأنسجة السميكة، مع الأنسجة غير متجانسة وسميكة بشكل خاص (على سبيل المثال، كبد الفئران كلها)، يمكن قياسات أكثر دقة كثيرايتم أون الحصول عليها عن طريق نشر الأنسجة خارج، بحيث فصوص الكبد تتداخل بأقل قدر ممكن. أيضا، في الحالات التي تكون فيها الأنسجة توزيع انحراف كبير من الجزيئات المسمى، والتصوير من الجانبين متعددة من الأنسجة ومتوسط ​​تلك المقاييس قد تزيد من دقة. في نهاية المطاف، وأنواع من الأنسجة ليمكن تصوير، لصناعة السيارات في مضان من المواد المرتبطة بتلك الأنسجة، والتوزيع المحتمل للجزيئات المسمى تدار ينبغي النظر بعناية من أجل اختيار fluorophore مع الإثارة وانبعاث موجات المناسبة التي تحد من التدخل قدر الإمكان. عند تنفيذ الأنسجة الأنسجة الكمية، وهناك العديد من التفاصيل المهمة أن نأخذ في الاعتبار. من أجل أن تكون النتائج دقيقة، يجب أن تؤخذ شرائح في جميع أنحاء الأنسجة بأكملها أو المنطقة المراد تحليلها. وهذا يعني أن هذه الأنسجة لن تكون متاحة لعمليات أخرى. قد يكون من الممكن لإصلاح وصمة عار بعدالمسح الضوئي، وإنما هو عادة أفضل للسماح للشرائح حتى يجف قليلا قبل وضعها في الماسح الضوئي، والتي يمكن أن تؤثر على تلطيخ المستقبل. وبالمثل، فإن المسح يسبب بعض مستوى من الصور وتبييض، والحد من إشارة محتملة في العمليات اللاحقة. لتطبيقات المجهر المصب، وتتحقق أقسام متفوقة عادة عن طريق تحديد الأنسجة وتوازنه لهم في محلول السكروز قبل باجتزاء. ومع ذلك، فإن هذه العملية هو الأفضل تجنبها في أعلاه بروتوكول الأنسجة الكمي بسبب آثار تثبيت و / أو السكروز طويلة تتسرب على كثافة مضان. أيضا، اعتمادا على كمية من إشارة الحاضر، شرائح قد تواجه الصور وتبييض إذا تعرضت لحتى مستويات منخفضة من الضوء المحيط. والحفاظ على الشرائح البرد وبعيدا عن الضوء تحسن ملحوظ في دقة القياسات الناتجة عن ذلك. وبشكل عام، معالجة دقيقة وإعداد يمكن أن تحسن بشكل كبير من النتيجة النهائية. وهناك مجموعة متنوعة من الآخرالطرق المستخدمة لدراسة توزيع الحيوية والدوائية من الجزيئات تدار التي تختلف على نطاق واسع في الصعوبة التقنية، والإنتاجية، والدقة، والمعدات المطلوبة 11. المناعية الكمية والمقايسات النشاط الحيوي على حد سواء يمكن أن تكون معقدة فنيا وتتطلب الأجسام المضادة أو الكواشف محددة لجزيئات تدار، مضيفا إلى حد كبير في التكاليف والعمل. وقد استخدمت طرق متعددة على أساس وضع العلامات النظائر المشعة في الماضي، مع اختلاف دقة، ولكن التكامل بين النظائر المشعة للجزيئات، فضلا عن مجموعة من البيانات نفسها، يمكن أن تتطلب إعداد كبير ويمكن في كثير من الأحيان تجعل الأنسجة غير صالحة للاستعمال تماما لإجراء المزيد من التحليلات 12. وأخيرا، وأساليب أخرى أظهرت أن تكون فعالة، بما في ذلك التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ومطياف الكتلة، وعادة ما يمنع ببساطة بسبب عدم وجود المعدات اللازمة. يستخدم بروتوكول المذكورة أعلاه طريقتين بالتعاون لتحديد ال بكفاءةه الحيوي توزيع الجزيئات المسمى بطريقة سريعة، ودقيقة، ويمكن الوصول إليها بسهولة فعالة من حيث التكلفة نظرا لavailably العادية للمعدات المطلوبة. وقد استخدم هذا الأسلوب لتوليد البيانات الواردة أعلاه، وتحديد أفضل النواقل وإدارة الطريق لإيصال الجزيئات المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي. من البيانات خارج الحي، ELP تدار في وELP تدار تم تحديد الرابع لمزيد من توصيف عبر الأنسجة الأنسجة الكمية. ثم قدمت الأنسجة الأنسجة الكمية تركيزات الجزيئات المسمى في مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مما يتيح للاستنتاجات نهائية التي يمكن استخلاصها. طريقتين تمثل معا وسيلة سريعة وفعالة لإجراء دراسة مفصلة للتوزيع الحيوي لمركبات محددة متعددة.

وضع العلامات الفلورية هو طريقة استخدامها وفعالة بسهولة لتحديد التوزيع الحيوي للمركبات، وذلك باستخدام مجموعة من المعدات التي هي مشتركة بين العديد من المختبرات. وFluorophores على نطاق واسع، وغير مكلفة نسبيا، ويأتي في مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية، بحيث متعددة وصفت الجزيئات يمكن استخدامها في وقت واحد دون أي تدخل. معظم fluorophores لديها مجموعة من كيمياء لتصريف الافعال لمختلف المجموعات رد الفعل على المركبات المستهدفة، وعملية اقتران واضح ومباشر عموما لمعظم أنواع المواقع التفاعلية. بالإضافة إلى ذلك، المعدات اللازمة لقياس المركبات fluorescently المسمى شائعة في العديد من المعامل. المجهر الفلورسنت، والتصوير، والماسحات الضوئية الشرائح يمكن لجميع استخدامها في ظروف مختلفة، مما يجعل استخدام العلامات الفلورية الوصول للغاية. وكثيرا ما تستخدم تسميات الفلورسنت لتحديد توزيع الحيوية وحركية من المركبات على حد سواء في الجسم الحي وخارج فيفس مع أجهزة التصوير الحية، مثل الطيف IVIS تصوير، والأنسجة الأنسجة الكمية 2،3. وقد زاد استخدام خارج الجسم الحي التصوير كامل الجهاز باستخدام أجهزة الحية التصوير مع مرور الوقت نظرا لسهولة استخدامها والقدرة على خلق بسرعة إجراء مقارنة دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات وصفت دون الحاجة إلى مزيد من المعالجة tissues4. ومع ذلك، في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز يمكن أن تسمح لتحليل سهلة والمقارنة، فإنه لا تولد مقياس كمي للتركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. ويرجع ذلك إلى آثار تشتت الخفيفة داخل أجهزة سليمة هذا. منذ تشتت الضوء (وإلى حد أقل، الامتصاصية) يختلف حسب حجم الأنسجة وكثافة، ويمكن تصوير كامل الجهاز يقلل مستويات الأنسجة في أجهزة كبيرة أو الكثيفة. وضع معايير مناسبة لقياس تركيز المطلقة هي أيضا صعبة لأن واحدا يجب أن تحاكي سمكوكثافة كل جهاز على حدة. من ناحية أخرى، والتصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة للحصول على مستويات الأنسجة النسبية للعامل، وأنها مثالية للمقارنة بين النسبي الحيوي توزيع ذات الصلة متعددة الجزيئات (كما هو الحال في الدراسات التي تستهدف المخدرات). استراتيجية بديلة هو استخدام الأنسجة مضان الكمية، وهي تقنية مشتقة من طريقة تصوير الإشعاع الذاتي الكمي، للحصول على مستويات الأنسجة المطلقة من وكيل اختبار 5،6. بدلا من وضع كامل الحيوان أو جهاز إلى جهاز تخيل، تتطلب الأنسجة الأنسجة الكمية التي يتم شرائح كل الأنسجة، التي شنت على الشرائح، وفحصها، وتحليلها بشكل فردي. يتم إعداد معايير وكيل اختبار وشرائح في سمك نفس العينات الجهاز. من خلال قطع جميع الأجهزة ومعايير لنفس السمك، والقضاء على التباين يرجع ذلك إلى تشتت الضوء أو الامتصاصية، وكثافة مضان الأنسجة يمكن أن يكون لائقا لمنحنى القياسية لتحديد تناسق المطلقحصة. في حين أن هذا الأسلوب عندما يوظف بشكل صحيح، هو الكمي، كما أنها كثيفة العمالة وأسيء التعامل معها بسهولة. ونظرا لطبيعة أكثر تعقيدا من الأنسجة الكمية والتكلفة أعلى بكثير من العمل بالمقارنة مع التصوير كامل الجهاز، فإنه يصبح من المفيد دراسة حيث كل عملية هي الأكثر عملية لاستخدامها عند النظر في توزيع الحيوي لمركبات fluorescently المسمى. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية هذه الأساليب يمكن أن تستخدم جنبا إلى جنب لمقارنة كفاءة توزيع الحيوي من المسمى رودامين الإيلاستين مثل ببتيد (ELP)، مع أو بدون إضافة SynB1 أو تات الببتيدات اختراق الخلية، عن طريق الأنف (IN) وعن طريق الوريد (IV) طرق الإدارة.

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;Reagents&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimide derivitized fluorophors (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Buffer for rinsing</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Used for freezing and mounting</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Equipment&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For &lt;em&gt;ex vivo&lt;/em&gt; whole organ imaging</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>For cryosectioning</td></tr><tr><td>Fluorescence slide scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For slide scanning</td></tr></tbody></table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

وضع العلامات الفلورية هو عملية راسخة لدراسة مصير الجزيئات المسمى في إطار مجموعة من الظروف التجريبية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. تحقيقات الفلورسنت مفيدة بشكل خاص في تحديد التوزيع الحيوي من الجزيئات الكبيرة التي يديرها، حيث إضافة تسمية فلوري جزيء صغير من غير المحتمل أن تؤثر على حركية أو توزيع الحيوي للمجمع. مجموعة متنوعة من أساليب وجود لدراسة توزيع الحيوية التي تختلف بشكل كبير في مقدار الجهد المطلوب وعما إذا كانت القياسات الناتجة بشكل كامل الكمية، ولكن باستخدام أساليب متعددة بالتزامن يمكن توفير نظام سريع وفعال لتحليل-توزيعات الحيوي. فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو الطريقة التي يمكن استخدامها لمقارنة بسرعة تركيزات النسبية للجزيئات الفلورسنت داخل أنسجة وبين أنواع متعددة من الأنسجة أو مجموعات العلاج. باستخدام بلات التصويرالنموذج المعد لالحيوانات الحية أو التصوير كامل الجهاز، مضان داخل أنسجة سليمة يمكن تحديد دون مزيد من المعالجة، وتوفير الوقت والعمل في الوقت الذي توفر صورة دقيقة عن مجمل توزيع الحيوي. هذه العملية هي مثالية في التجارب محاولة تحديد خصوصية نسيج مركب أو المقارنة بين مركبات مختلفة متعددة. الأنسجة الأنسجة الكمية من ناحية أخرى تتطلب مزيد من المعالجة واسعة من الأنسجة من أجل إنشاء مقياس كمي للمركبات المسمى. إجراء تقييم دقيق الحيوي التوزيع، جميع أنسجة الفائدة يجب أن تكون شرائح، مسح، وتحليل نسبة إلى منحنيات القياسية من أجل إجراء مقارنات بين الأنسجة أو مجموعات. الأنسجة الأنسجة الكمية هي المعيار الذهبي لتحديد تركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. هنا، نحن تصف كيف كلتا الطريقتين يمكن استخدامها معا بشكل فعال لتقييم قدرة أساليب إدارة مختلفةالثانية التعديلات مجمع لاستهداف وتقديم جزيئات fluorescently المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي 1.

تصف البيانات دون تقديم ثلاث مركبات: متجه لتوصيل العقاقير المعروفة باسم ELP ونسختين من ELP تعديل مع الببتيدات اختراق الخلية (SynB1-ELP وتات-ELP) 9. وصفت كل المركبات الثلاث مع tetramethylrhodamine-5-maleimide وتسليمها عبر طريقين الإدارة (في والرابع). وكان الهدف من هذه التجارب لتحديد المركبة والطريق الإدارة من شأنه أن يؤدي في أفضل تغلغل في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 3. الشكل يعرض 1A ممثل فيفو السابقين الصور كامل الجهاز من الأجهزة من الحيوانات المعالجة. يظهر خريطة الحرارة تراكب مستويات مضان في كفاءة مشع داخل الأنسجة. عن طريق رسم رويس في جميع أنحاء الأنسجة الفردية والتآمر تلك القيم على منحنى معيار المقابلة، ويتم إنشاؤها القيم مضان موحدة موضح في الشكل 1B. وfluorescen موحدويمكن بعد ذلك قيم م استخدامها لإجراء مقارنات دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات مختلفة. هذه البيانات تصف بدقة كل من تأثير تعديل ELP على اختراق أنسجة معينة، فضلا عن تأثير مسار الإدارة في كل مجمع. مع هذه النتائج، فمن الواضح على الفور أن تسليم ELP عبر الإدارة في هو مزيج الأكثر فعالية للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي. في حين أن هذه النتائج تساعد على تحديد أفضل اختراق المجمع وتسليم طريقة، أنها لا تصف التركيز الفعلي أو توطين الإقليمي للمركبات داخل الجهاز العصبي المركزي. الأنسجة الكمية هي بالتالي مثالية لاستكمال وصف للتوزيع الحيوي من هذه المركبات، لأنها تسمح لقياس الكمية من مناطق الدماغ المحدد. يعرض الشكل 2A شريحة تمثيلية من الحيوانات المعالجة IN-ELP، ويصف الشكل 2B الكمي لرويس فصلبصيلات الشم، نصفي الكرة الأرضية، والمخيخ. من هذه المعطيات، فمن الواضح أنه في حين أن إدارة ELP من قبل في الطريق قد يؤدي إلى تركيزات عالية الجهاز العصبي المركزي، فإنه يفعل ذلك في المقام الأول في بصيلات الشم والمخيخ. على العكس من ذلك، سلمت ELP الرابع ديها تركيزات إجمالية أقل، ولكن يتم توزيعه بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ. اعتمادا على الهدف من هذه المركبات تدار واحتمال الآثار في الأجهزة الأخرى، سواء في أو الإدارة الرابع قد يكون الخيار الأفضل. لا يمكن اختتمت هذه دون إضافة الأنسجة الكمية. من الناحية الفنية، كان من الممكن استخدام الأنسجة الكمية في كل نسيج من كل مجموعة، ولكن عن طريق استخدام كلتا الطريقتين معا، وحفظ قدرا كبيرا من الوقت والعمل في حين لا يزال يؤدي إلى نفس النتيجة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig1.jpg" /> الشكل 1: فيفو السابقين الجامعة، الجهاز الإسفارقياسات. أ) صور الممثل من مجموعة ELP. تم تعيين مقياس الخريطة الحرارة وكفاءة مشع. ب) متوسط قيم الكفاءة مشع تم الحصول عليها من إنشاء رويس في جميع أنحاء الأنسجة الفردية التي تم تحليلها على منحنى قياسي من أجل توليد القيم مضان موحدة تستخدم للمقارنة-توزيعات الحيوي. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 5 ملم. (معدلة من مكجوان، وآخرون؛ تصميم المخدرات والتنمية، والعلاج، 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig2.jpg" /> الشكل 2: كمية الأنسجة القياسات الأنسجة. أ) صورة الممثل من ELP IN-أو معاملة الحيوانات الرابع إنشاؤها من قبل تشريح أدمغة 20 ميكرون سميكة، وتركيب شرائح سالشرائح n ومن ثم تفحص تلك الشرائح باستخدام ماسح ضوئي الشريحة مضان. ب) متوسط القيم التي تم الحصول عليها من إنشاء رويس حول البصلة الشمية، نصفي الكرة الأرضية، والمخيخ، ويقاس كقيمة رمادية يعني ويصلح لمنحنى القياسية لتوليد قياسات تركيز ميكروغرام / مل. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 5 ملم. (معدلة من مكجوان، وآخرون؛ تصميم المخدرات والتنمية، والعلاج، 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules at JoVE.com

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة لتحديد التركيزات النسبية للمركبات fluorescently المسمى داخل وبين الأنسجة أو مجموعات العلاج. على العكس من ذلك، كمية الأنسجة مضان، في حين أن أكثر كثيفة العمالة، يسمح لتقدير مستويات الأنسجة المطلقة من الجزيئات المسمى.

استخدام<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Views.  The University of Mississippi Medical Center.  فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة لتحديد التركيزات النسبية للمركبات fluorescently المسمى داخل وبين الأنسجة أو مجموعات العلاج. على العكس من ذلك، كمية الأنسجة مضان، في حين أن أكثر كثيفة العمالة، يسمح لتقدير مستويات الأنسجة ال?...

Video: The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

في الجسم الحي التصوير من ورم الأوعية الدموية باستخدام الإسفار متحد البؤر Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

رواية عالية الدقة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنية التصوير لدراسة الاستجابة الديناميكية للمنشآت داخل القحف لنمو الورم والتداوي

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Bioengineering

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

في فيفو التصوير الضوئي من أورام الدماغ والتهاب المفاصل عن طريق نيون SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

فحص المخدرات العضوية متعددة المعلمات للورم باستخدام تصوير الخلايا الحية واسع المجال للتحليل السائب والعضوي الفردي

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Cancer Research

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

فيفو تصوير لايف الرئة ورم خبيث والمكروية بهم

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

الأسفار بوساطة التصوير المقطعي للكشف والتحديد الكمي لالتهاب الأمعاء مورين المتصلة بلعم

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

تتبع مسببات الأمراض في الأعضاء الكاملة عبر القياس الكمي لمراسل الفلورسنت

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف الاستجابات البكتيرية للمضادات الحيوية والجهاز المناعي في الأنسجة

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأعضاء الكاملة للعدوى الميكروبية

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

استخدام

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في الجسم الحي التصوير من ورم الأوعية الدموية باستخدام الإسفار متحد البؤر Videomicroscopy

رواية عالية الدقة

الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

في فيفو التصوير الضوئي من أورام الدماغ والتهاب المفاصل عن طريق نيون SapC-DOPS Nanovesicles

فحص المخدرات العضوية متعددة المعلمات للورم باستخدام تصوير الخلايا الحية واسع المجال للتحليل السائب والعضوي الفردي

فيفو تصوير لايف الرئة ورم خبيث والمكروية بهم

إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

الأسفار بوساطة التصوير المقطعي للكشف والتحديد الكمي لالتهاب الأمعاء مورين المتصلة بلعم

التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأعضاء الكاملة للعدوى الميكروبية

التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأعضاء الكاملة للعدوى الميكروبية