We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1. Genel Hususlar <ol><li> Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın. </li><li> FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C&#39;de FBS, 50 ml&#39;lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız). Not: FBS ısı inaktive edilmeden kullanıldığında, epitel benzeri fenotip SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri içinde daha hızlı bir şekilde ilerler. </li><li> Kullanımdan önce, ortam ısınmaya bırakılmış ve her adımda önce uygun bir pH dengesini oluşturmak için bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye gelmeye bırakın. Örnek olarak, ortam, 50 ml tam dengelenmeye yaklaşık bir saat sürer (pH 7, 37 ° C,% 5 CO2). Not: Bu protokol, tripsinize edilmiş ve yeniden kaplanacak kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri gerektiren iki aşamalı bir ayırma prosedürü kullanılır. Bu stresliBu son derece kırılgan hücreler için süreç. Nedenle, en az zaman miktarı için tripsin hücreleri inkübe etmek önemlidir. Bu hala çanak bağlı epitel benzeri hücreleri bırakarak nöronların tercihli bir hareket başlangıcı sağlayacaktır. </li><li> yavaş yavaş hücreleri içeren konik tüp alt karşı ucu ile 10 ml plastik pipet ile farklılaşmış hücrelerin öğütme gerçekleştirin. yukarı ve aşağı hayır, yavaş hızda daha fazla beş kez öğütme gerçekleştirin. </li></ol> SH-SY5Y Bakım Kültürlerin 2. Passage <ol><li> Hücreler% 70-80 birikime ulaşmış ve 10 ila 15 pasajlar aşmamaktadır bölünmüş bakım kültürleri. Kültürler, tipik olarak (varsayarak kültürler bölme sırasında 5 kat daha seyreltildi değildir) her 3-5 günde geçirilmiş olması gerekir. </li><li> T-75 balonuna geçişin hücreleri, ardından PBS 1X yaklaşık 10 ml ile yıkayın, ortam aspire. Not: SH-SY5Y bakım kültürleri fu yarma önermiyoruz1&#39;den rther: 5 Pasajlanması sırasında bu hücreler düşük confluency nedeniyle ölmesine neden olabilir, çünkü. </li><li> PBS aspire ve daha sonra 2.5 ml% 0.05 tripsin-EDTA (1 x) ekleyin. </li><li> inkübatör 2-3 dakika içinde inkübe ve balonun yüzeyindeki hücrelerin serbest bırakmak için yavaşça ucu. </li><li> 10 ml temel büyüme ortamında ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 1-2 kez Karışım. </li><li> 1000 xg&#39;de 2 dakika aşağı Spin, aspirat medya, daha sonra 5 ml Temel Büyüme Medya pelletini. </li><li> T-75 balonuna normal kaplama için 20 ml&#39;lik bir toplam hacim içinde 5 veya farklılaşması (Bölüm 5) saymak ve plaka: 1 ila 3: 1 hücreleri ile seyreltilir. </li></ol> 3. Dondurucu SH-SY5Y hücreleri <ol><li> % 5 (h / h) DMSO ile desteklenmiş temel büyüme ortamında SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin erken pasajlar dondurun. </li><li> Başlangıçta, 24 saat süre ile, -80 ° C&#39;de alikot sonra dondurularak uzun süreli depolama için sıvı azot transfer. Not: Başvuru için konfluent (% 75-85), T-75 şişesi beş verecektirdondurma için SH-SY5Y hücrelerinin 1 ml&#39;lik eş payları. Bu alikotları her biri toplam bir yerde 2-5 milyon hücre içermelidir. </li></ol> 4. Çözülme ve Kültür ayrım yapılmamış SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri <ol><li> Temel Büyüme Medya hazırlayın. </li><li> Hızla bir 37 ° C su banyosu (yaklaşık 2 dakika) donmuş hücrelerini eritin. </li><li> 15 ml konik bir tüp içinde 9 ml temel büyüme ortamında yeniden süspanse hücreleri ve daha sonra 1,000 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Süpernatant aspire 10 ml Temel Büyüme Medya pelet hücreleri, ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olurken. </li><li> T-25 balonuna veya 60 mm 2 tabağa plaka hücreleri. </li><li> Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak için ortamı değiştirin. </li></ol> 5. Gün: 0 Farklılaşma için Kaplama Hücreler <ol><li> Farklılaşma programı için Bkz: Şekil 1. </li><li> 1x PBS, aspirat ile farklılaşmamış hücreler durulayın ve sonra 1-2 ml ısındı kullanarak trypsinize1x% 0.05 Tripsin-EDTA. </li><li> Hücreler tripsin içinde olduğunda, bir kuluçka makinesi içinde, yaklaşık 3 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> , 10 ml Temel Büyüme Medya ekleyerek tripsin Quench şişeye ya da yemeğin kenarlarını durulayın ve nazikçe 1-3 kez çiğnemek. 15 ml konik tüp içeriği aktarın. </li><li> pelet rahatsız etmemek için dikkatli olurken 1,000 xg&#39;de 2 dakika süreyle santrifüj ve medya aspire. </li><li> Süspanse 5 ml Temel Büyüme Medya pelet ve 1-3 kez çiğnemek. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak, sonra / ml 50,000 hücrelere Temel Büyüme Medya kullanarak sulandırmak. </li><li> Plaka 2 çanak başına 100,000 hücre toplam 35 mm2 çanak başına hücre ml tekrar inkübatör içine yerleştirin. </li></ol> 6. Gün 1: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1) <ol><li> Farklılaşma Ortam # 1 kısım 50 mi (bakınız Tablo 2) ve 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir. </li><li> Ortam ısıtıldı olduğunda, (bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye 37 sağlar° C,% 5 CO2), en azından bir saat için, kullanımdan önce uygun bir pH dengesini kurmak. </li><li> Retinoik Asit (RA) ekleyin hemen yemekleri medya eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1). Not: Retinoik asit ışığa duyarlı ve 4 ° C&#39;de koyu renkli şişelerde muhafaza edilmelidir </li><li> Yavaşça eski medya aspire ve atın. </li><li> 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyin ve inkübatör dönmek. </li></ol> 7. Gün 3: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1) <ol><li> Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar) </li></ol> 8. Gün 5: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1) <ol><li> Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar) </li></ol> 9. Gün 7: Hücreleri Böl 1: 1 <ol><li> RA ısındı ekle ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce Farklılaşma Medya 1. dengelenmiş. </li><li> Yavaşça eski medya aspire ve atın. </li><li> 200 ul ekle35 mm 2 tabak başına% 0.05 1x tripsin EDTA ısındı ve yaklaşık 2-3 dakika ya da hücrelere kadar gözle görülür bir mikroskop altında gözlenen olarak plaka kaldırılır inkübatör sıcak. </li><li> 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyerek tripsin Quench ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın. Not: trypsinization aşamaları sırasında, aynı anda çok sayıda yemekleri trypsinize yok. Bu sitotoksik olabilir, nöronal kültürler için çok uzun tripsin inkübe değildir sağlamaya yardımcı olur. </li><li> 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve en fazla beş kez aşağı 10 ml plastik pipet ile yavaş yavaş çiğnemek. </li><li> Kısım 2 ml hücre taze 35 mm 2 kaplarına süspansiyon ve inkübatör dönmek. </li></ol> 10. 8. Gün: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 2) <ol><li> RA ekleyin (bkz &lt;strong&gt; Tablo 1) ısıtılır ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce medyayı dengelenmiş için. </li><li> Yavaşça eski medya aspire ve atın. </li><li> Yavaşça 2 ml farklılaşma medya # 2 (bakınız Tablo 2) ekleyin 35 mm 2 çanak ve inkübatör dönüş başına RA. izin verme nöronlar, hızlı bir şekilde kuru gibi uzun bir süre boyunca havaya maruz. </li></ol> 11. Gün 9: Ekstrasellüler Matrix (ECM) hazırlayın Kaplı Yemekleri <ol><li> buz üzerinde ECM çözümün bir şişe çözülme ve 1 sulandırmak: 100 soğuk DMEM içine. </li><li> Her 35 mm 2 çanak içine karışımı 2 ml dağıtın ve yemeğin tüm baz kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Bir inkübatör içerisinde yer (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat veya gece boyunca. </li><li> Aspire karışımı ve başlıkta yaklaşık olarak 1 saat süre ile kurumaya bırakın. en fazla 2 ay boyunca oda sıcaklığında saklayınız. </li></ol> 12. Gün 10: Aktarım Hücreler üzerineECM ile kaplı levhalar 1: 1 <ol><li> RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1). </li><li> Yavaşça medya aspire ve atın. </li><li> Her 35 mm2 çanak tripsin ısıtıldı 200 ul ilave edin ve yaklaşık 1-2 dakika boyunca ya da nöronlar gözle mikroskop altında görüldüğü gibi, çanak kaldırılıncaya kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Not: tripsin ile nöronların aşırı-inkübe ve hasara neden olmamak için oda sıcaklığında bu trypsinization adımı yürütün. Nöronlar bu aşamada epitel benzeri hücreler çok daha hızlı plakaları bırakın. </li><li> 35 mm 2 tabak başına 2 ml Farklılaşma Medya 2. ekleyerek tripsin gidermek ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın. </li><li> 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve sahip en fazla beş kez aşağı yavaşça çiğnemek10 ml&#39;lik plastik pipet. </li><li> ECM-kaplı 35 mm 2 yemekleri içine 2 ml hücre süspansiyonu koyun ve inkübatör dönmek. </li></ol> 13. Gün 11: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3) <ol><li> RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1). </li><li> Yavaşça eski medya aspire ve atın. </li><li> Yavaşça 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 3. (bakınız Tablo 2) ekleyin ve inkübatör dönmek. izin verme nöronlar uzun bir süre boyunca havaya maruz. </li></ol> 14. Gün 14: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3) <ol><li> Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları) </li></ol> 15. Gün 17: Son Medya Değişimi (Farklılaşma Medya # 3) <ol><li> Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları) </li></ol> 16. Gün 18: Kullanıma Hazır Nöronal Kültürleri <ol><li> Taze Diff bir ortam3 günde RA, farklılık yaratmak Medya 3. nöron sağlığını korumak için. Hücreler nöronlar içine ayırt edilmelidir ve nöronal fenotip sergilerler Not:. Kültürler, terminal farklılaşma, aşağıdaki sonra 14 gün boyunca, tipik olarak stabil, nöron canlılığının Ancak süresi farklılaşma başlangıcında farklılaşmamış hücreler geçiş sayısına bağlıdır. Daha yüksek geçiş sayıları kısa kullanım ömrü ile farklı nöronların verim. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler 1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgun yapışık nöronlar için seçin. Bu hücre hattı, yapışan ve asma hücre heterojen popülasyon olarak başlar. Bu protokol pasajlama veya medya değişiminden önce PBS yıkar stopaj hem nüfusu korumayı amaçlayan, ancak askıya bazı hücreler zarar ölü epitel hücrelerinin kaldırılmasına izin gereklidir. sunulan yöntem olup, ayrıca deney için ayırt edilen insan SH-SY5Y nöron bir homogenus popülasyonu verir. othe olmasına rağmenr ajanlar kolinerjik ve adrenerjik fenotip 16,17 içine nöronların farklılaşmasını rehberlik için kullanılabilir, RA kullanımı SH-SY5Y hücreleri bir dopaminerjik fenotip 37,38 ile nöronların üretmek için daha önce kullanılan olmuştur ayırt etmek. RA eklenmesi sikline bağımlı kinaz (CDK) inhibitörleri p21 ve p27 Kip1 ve anti-apoptotik proteinler, bcl artan G0 / G1 üzerinden hücre döngüsü ilerlemesini durdurma dahil mekanizmalar, bir numara ile hücresel farklılaşmayı indüklediği gösterilmiştir 2 ve Bcl-xL, ve nörit gelişimi ve farklılaşması 39 önemli bir rol oynar PI3K / AKT aktivitesi artar. SH-SY5Y hücreleri ani değişime çok hassas olarak bu protokolün yürütülmesi, nazik ve steril taşıma teknikleri kullanmak boyunca zorunlu bir durumdur. Çünkü kademeli serum yoksunluk protokolü med hızlı değişiklikler yapılmasını gerektirir protokolleri üzerinden tercih edilir, bu hassasiyeti olania kompozisyon. gün 7 ve 10 hücreleri yarma zaman, kısmen farklılaşmış nöronların tripsin geçirdikleri süreyi en aza indirmek için önemlidir. Bu zarar nöronların olasılığını azaltır ve ayırmak için daha uzun sürer epitel hücrelerinde karşı nöronların, tercihli serbest bırakılmasını teşvik etmektedir. Bu hücreler daha homojen bir nöronal nüfus oluşturulması ve çoğalan ve diferansiyasyon sergilemeyen epitelyal hücreleri ile kirlenmesini en aza indirmek için yardımcı olur. Süresiz olarak tutulması rutin olup değiştirilmelidir SH-SY5Y hücrelerinin kültür ve farklılaşması için kullanılan reaktifler dikkat etmek de önemlidir. Farklılaşma Medya sadece 2 hafta kadar tutulmalıdır Örneğin, Temel Büyüme Medya 6 haftaya kadar saklanabilir. Bu, dbcAMP ve BDNF olarak reaktifler taze ve istikrarlı olmasını sağlar. Buna ek olarak, yeni bir parti yapılmalıdır önce RA olduğunda, en fazla 6 hafta boyunca karanlıkta saklanmalıdır hazırlanabilir. Biz nöronal sonuçların fazla tutarlılık w gözlemledikBu önlemler i. Hücreler olgun nöronlar ayrışmıştır edildikten sonra, onlar 2 hafta sonrası terminal farklılaşma için muhafaza ve deney için kullanılabilir. terminal farklılaşmasına ardından, medya her 3-4 days (Farklılaşma Medya # 3) değiştirilmelidir. farklılaşmış nöronların aksine, farklılaşmamış SH-SY5Y hücre kültürleri ihtiva eden bakım şişelerinden normal pasaj birçok hafta boyunca muhafaza edilebilir. Bunu engellemek için, düzenli kanalı bakım kültürleri için önemli aşırı nüfus artık nöronlara ayırt edebilen epitel benzeri hücrelerin. bu hücreler nöro-potansiyeline sahip olanlar sayıca üstün olduğunda, serum açlık hücre ölümü orantısız miktarda neden olur. Farklılaşmamış kültürler sadece yaklaşık 15 pasajlar kadar muhafaza edilebilir. kültür 15 pasajlar etrafında aştı sonra, farklılaşmamış hücreler ölmeye başlar ve bir kaba, sağlıksız bir görünüme sahip. Buna ek olarak, ayırıcıdaha az hücre her split hayatta yüksek geçit SH-SY5Y hücrelerinin sokan daha zordur ve bunu o genellikle daha sonraki analizler daha zor hale hücre gövdeleri ve aksonlar hem agrega. Birçok hücre kaybolur veya bölme işlemi hayatta yok gibi farklılaşma sürecinde hücre sayısında belirgin bir azalma var. Bu nedenle, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri kapsayan herhangi bir deneyin başlangıcında bir nöron% 30-40 kaybı ~ hesaba ve hücrelerin uygun bir sayısı, istenen verim elde etmek için başlangıç ​​plakalandı sağlamalıdır. 100.000 hücre kaplama sağlıklı, olgun SH-SY5Y nöron bol üretirken, daha az ya da daha çok sayıda başlangıçta deneysel ihtiyaca göre kaplama olabilir. Tamamen farklılaşmış SH-SY5Y nöronlar göre daha in vivo bulundu olgun insan nöronlarının daha yakın bir sağlamak olduğu açıktır onların farklılaşmamış progenitör hücre muadilleri (Şekil 2). Bu nöronlar nörotopik virüslerdir çalışması için, bunların nörobiyolojinin gelecekteki karakterizasyonları için avantajlı bir örnek teşkil edecek ya da nöronlar kemoterapötik toksisite taranması için.

Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri 5, Neuro-2A, fare hücreleri 6 ve sıçan PC12 hücrelerinin 7 gibi sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda 8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe 13 göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir<html> 14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur. SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler 15 hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar 16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar. ontent &quot;&gt; Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların 18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda 2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli 2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) 4 olarak glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz 4 sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir. Subclone 1978 3 yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı 17, Alzheimer hastalığı 21 ve poliovirüsün 22 enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi 23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), 1, insan sitomegalovirüs 25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) 2,26. Özellikle neurovirology 27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin 2 giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir. insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden 1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">B-27</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">17504-044</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:141px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">D0627</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">DMSO</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">4-X</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:141px;">Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">M5650</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">GlutamaxI</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050-061</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Glutamine</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP366-1</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:141px;">MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">E0282</td>
			<td style="width:232px;">See step 11 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">21103-049</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:141px;">Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15140-122</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Retinoic acid (RA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">R2625</td>
			<td style="width:232px;">Should be stored in the dark at 4&#176; C because this reagent is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">SH-SY5Y Cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-2266</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">0.5% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15400-054</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:141px;">Falcon 35mm TC dishes</td>
			<td style="width:141px;">Falcon (A Corning Brand)</td>
			<td style="width:133px;">353001</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı 2 olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar 27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir ne iyi bir şekilde temsil verileri elde etmek üzere, nöronlar ayrılır kritiktir. sonraki biyokimyasal ve görüntüleme için kullanılabilir 18 gün içinde son derece canlı, homojen, farklılaştırılmış nöronal kültürlerin yukarıdaki protokol verimleri, analiz eder. Farklılaşmamış SH-SY5Y nöroblastom hücreleri (Şekil 2A) dışarı doğru uzanan çok sayıda kısa süreçlerle büyük, düz epitel benzeri fenotip gösteren farklılaştırılmış hücrenin ises çevreleyen hücreler (Şekil 2B) bağlanmak birkaç nöritik projeksiyonlar sahiptirler. SH-SY5Y hücreleri ayırt, hücreler sadece nöronlar çanak serbest olmasını sağlamak için en az zaman uzunluğu için tripsin ile inkübe edilmesi önemlidir. Bu, aksi farklı nöronal hücre popülasyonu kontamine olur diferansiyasyon sergilemeyen epitelyal hücreleri bırakır. Tamamen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin nöronal özellikleri gibi klasik nöronal belirteçlerin (Şekil 3) immünofloresan algılama gibi tekniklerle gösterilmiştir. SH-SY5Y hücreleri farklılaşması sırasında farklı fenotip çeşitli göstermektedir ve stresli olanlar sağlıklı nöronlar tespit edebilmek için önemlidir. Farklılaşma 1. gün, Farklılaşma Medya 1. tanıtımı öncesinde, hücreler kısa, kalın süreçler (Şekil 4A) ile düz, geri çekilmiş fenotip var.Serum mahrumiyeti 5 gün sonra, SH-SY5Y hücreleri, daha uzun çıkıntılarla geliştirmek ve daha nöronal fenotipine (Şekil 4B) göstermektedir başlar. Pasaj SH-SY5Y hücreleri için sert bir işlemdir ve hemen gerçekleşen pasajlanmasını da takip eden günlerde hücreler sağlıksız görünür. Bu hücre gövdesi topaklanma ve daha az, daha kısa işlemler varlığı ile belirlenir. (Görüntülerin önce Bkz: Şekil 4C ve 4E ve görüntüler sonrası: Şekil 4D ve 4F). Yaklaşık 48 saat bölünmüş ardından, hücreler kurtarmak için görünür ve tam olgun, farklılaşmış nöronlar Gün 18 (Şekil 2B) elde edilir. Bu hücre gövdesi topaklanma azalma ve ince sayısız uzantısı kanıtladığı, sık sık komşu hücrelere bağlanmak nevrotik süreçleri dallı. tekrarlanabilir ve canlı nöronal kültürlerin elde etmek önemlidir faktörler tripsin inkübasyon minimize ısı ile inaktive edilmiş FBS kullanılması yer alıyorZaman ve dikkatlice toz haline getirilerek. Önemli olarak, bu protokol, böylece hücrelerin bir seruma acıktırıldı duruma yumuşak bir geçiş oluşturmak hiFBS çeşitli konsantrasyonlarda, dört farklı medya formülasyonlann kullanımını göstermektedir. Olgun SH-SY5Y hücreleri sağlıklı olduklarında, çevredeki nöronların (Şekil 5A) bağlanmak sayısız projeksiyonlar göstermektedir. Farklılaşma sürecine (Şekil 5B) sırasında hatalı ise farklı bir epitel fenotipi nöron hücreleri geçeceği unutulmamalıdır. nöronlar ölmeye başlar, ayrıca, neurites geri çekilecektir, hücre gövdeleri bir araya gelme ve yuvarlak başlayacak ve nörit dejenerasyonu enkaz de ve hücre süreçleri etrafında birikir başlayacaktır. Şekil 5C, besin ve çevresel yoksunluk aşağıdaki hücre ölümü daha doğal bir ilerleme gösterir birlikte bu proses. Şekiller 5C ve 5D&#39;de gösterilmiştir ne benzer olduğunuŞekil 5D 10 6 PFU bir enfeksiyon (MOI) bir HSV-1 suşu kos ile farklılaştınlan SH-SY5Y nöron 4 saat şu enfeksiyon gösterir. Bu protokol iyice aşağı analiz ve deney için gerekli olan nöron laboratuar ve verimleri tekrarlanabilir, homojen toplumlarda, optimize edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig1.jpg" /> Şekil 1:. Farklılaşma prosedürünün Zaman Çizelgesi farklılaşma süreci 18 günlük süre boyunca yayılmış 11 adımdan oluşur. farklılaşma protokolü (gün 0) ilk gününde, 25.000 ila 100.000 hücre kaplanmamış 35 mm yemekleri üzerine kaplanmıştır. günler 1, 3 ve 5, eski ortam uzaklaştırılır ve farklılaşma medya 1. uygulanır. Farklılaşma Medya # 1 kaplanmamış 35mm yemekleri üzerine 1: 7. günde, hücreler 1 bölünür. 8. günde, ortam Farklılaşma değiştirilirMedya 2. ve 10. günde, hücreler tekrar 1 split: 1, ama Farklılaşma Medya 2. ECM-kaplı 35 mm yemekleri üzerine bu kez. gün 11, 14, ve 17, eski ortam uzaklaştırılır ve farklılaşma medya 3. uygulanır. günde 18, farklılaştırılmış nöronlar downstream uygulamalar için kullanıma hazırdır. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig2.jpg" /> Şekil 2:. (B), farklılaştınlan SH-SY5Y nöron kapsamlı ve uzun nöritik çıkıntıları gösterir ise, farklılaşmamış ve farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin morfolojik görünüşü (A) ayrım SH-SY5Y hücreleri birkaç çıkıntıları olan düz fenotipi. Fotoğraflar bir ters mikroskop kullanılarak epifloresans 20X büyütme fazında elde edilmiştir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53193/53193fig3.jpg" /> Şekil 3:Belirteçleri nöronal farklılaşma. İmmünofloresan tamamen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin nöronal özelliklerini aydınlatır. (A) anti-SMI31 (yeşil) nörit geniş bir ağ fosforile lifi H boyar. (B) Anti-map2 (kırmızı) nöronal soma ve neurites proksimal kısmını açığa mikrotübül ilişkili protein 2, etiketler. Her immünofloresan panel için ilgili faz görüntü sağda gösterilir. Fotoğraflar bir ters mikroskop kullanılarak epifloresans 10X büyütmede elde edilmiştir. Ölçek çubuğu, 100 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53193/53193fig4.jpg" /> Şekil 4: farklılaşma protokolünün Intermediate adımlar farklılaşma (A) Gün 1.. Hücreler, kısa çıkıntılar ile geri çekilmiş bir fenotip korumak. (B) farklılaşma Gün 5. Hücreler, 5 gün maruz kalmışSerum yoksunluğunun s (Farklılaşma Medya # 1). hayatta kalan hücreler uzamış ve komşu hücrelerle bağlantı uzun süreçleri oluşmaya başlar. (C) bölünmüş önce farklılaşma Günlük 7. Hücreler bir epitel benzeri fenotip gösteren hücrelerin daha az sayıda, uzun süreçlerin yüksek sayıda göstermektedir. (D) gün farklılaşma 8, ilk geçit bir gün sonra. bölme sonra, hücre gövdeleri ve süreçleri kümeleri pasajlama prosedürünün bir sonucu olarak, kısa görünür oluşturur. (E) farklılaşma Gün 10, ECM ile kaplanmış plakalar üzerine bölünmüş önce. Hücreler yakın hücreleri ile bağlantıları yapmak daha uzun süreçleri göstermektedir. Hücre gövdesi kümeleme da belirgindir. (F) Gün farklılaşma 11, ikinci split aşağıdaki bir gün. Hücreler ikinci geçit takip stresli ve birçok nöronlar sonuçta kaybolur. Ancak, geri kalan nüfus, canlı homojen ve fenotip nöronal olduğunu. Hücre gövdeleri l üretmekArger kümeleri ve süreçler kümelerin tabanından yayarlar başlar. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53193/53193fig5.jpg" /> Şekil 5:. Epitelyal aşırı çoğalma ve nöronal ölüm - farklılaşma sürecinin iki alternatif sonuçları (A) Sağlıklı, olgun SH-SY5Y nöronlar komşu hücrelere bağlanarak yaygın aksonal projeksiyonlar göstermektedir. Bazı durumlarda, (B), daha epitel benzeri fenotip ile hücrelerin bakım kültür geçeceği. epitel benzeri hücrelerin bu aşırı nüfus bakım kültürlerin nadir Pasajlanması nedeniyle olabilir. epitel benzeri hücreler nöronlar sayıca üstün devam edecek gibi bu kültürler, atılmalıdır. Oklar epitel benzeri hücreler belirtir. (C) Ne zaman SH-SY5Y hücreleri sağlıksız ve ölmeye başlar, enkaz önemli miktarda üreten, hücre gövdeleri yuvarlamak ve süreçler aşağılamak. (D </stronhücre döküntüleri ve nöron retraksiyon g&gt;) Belirgin birikimi olgun farklılaşmış nöronların belirgindir, 10, 6 enfeksiyon çokluğu (MOI) herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) Kos soyu ile enfeksiyondan sonra 4 saat PFU. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> ayrıntılar </td><td> Stok </td><td colspan="5"> talimatlar </td></tr><tr><td rowspan="2"> 10 uM RA </td><td> All-trans retinoik asit </td><td rowspan="2"> 5 mM </td><td colspan="5" rowspan="2"> 33.3 ml% 95 EtOH 50 mg RA süspanse. RA ısı, ışık, hava ve hassastır. 6 hafta boyunca 4 ° C&#39;de koyu renkli bir şişede ve mağaza tutun. 1 kullan: 500 seyreltme ve kullanımdan hemen önce farklılaşma ortamı içine seyreltilmesi </td></tr><tr><td> (300,44 g / Mol) </td></tr><tr><td> 1x B-27 </td><td> B-27 Ek </td><td> 50x </td><td colspan="5"> -80 ° C de 1-10 mi şişe ve kısım kalan tek kullanımlık, 1 ml&#39;lik porsiyonlar halinde ve mağaza çözülme. Mağaza 10 mi şişe -20 ° C &#39;de </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 mM KCI </td><td> Potasyum klorür </td><td rowspan="2"> 1M </td><td colspan="5" rowspan="2"> 18.6 g KCI ve steril filtre 250 mi su ilave edilir. oda sıcaklığında saklayın </td></tr><tr><td> (74,55 g / Mol) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2 mM db-cAMP </td><td> dibutiril siklik AMP </td><td rowspan="2"> 1M </td><td colspan="5" rowspan="2"> 2.04 ml su 1 g db-cAMP ekleyerek tam bir şişe tekrar süspansiyon. ışığa ve neme karşı duyarlıdır. ya da -20 ° C ya da 100 ul veya 200 ul&#39;lik alikolar içinde mağaza -80 ° C </td></tr><tr><td> (491,37 g / Mol) </td></tr><tr><td> 50 ng / ml BDNF </td><td> Beyin türevli nörotropik faktör (BDNF) </td><td> - </td><td colspan="5"> Santrifüj flakon altına tozu almak için.60; 1 mi Neurobasal 10 ug şişeyi yeniden süspanse + 1 x B27 ya da 5 0.5 mi Neurobasal + 1 x B27 ug şişe 10 ug / ml elde etmek için. 200 seyreltme: 1 kullanmak. -80 ° C&#39;de saklayın çalışma alikotları (ör: 250 ul) </td></tr><tr><td> hiFBS </td><td> Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu </td><td> - </td><td colspan="5"> Kısım 50 ml konik tüpler içine FBS çözülmüş. 30 dakika boyunca bir su banyosu içinde 56 ° C&#39;de ısıtın. Çıkarın ve -20 ° C&#39;de çalışan alikotları dondurmak </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Stok çözümleri ve bileşenleri. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Temel Büyüme Medya </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> 500 ml için hacim </td><td> seyreltme </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 415 mi ENEM </td><td></td></tr><tr><td> % 15 hiFBS </td><td> 75 mi hiFBS </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 5 mi Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 5 ml glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td colspan="2"> * 6 hafta maksimum tutun </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Farklılaşma Medya 1. </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> 50 ml hacim </td><td> seyreltme </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 48 mi ENEM </td><td></td></tr><tr><td> % 2.5 hiFBS </td><td> 1.3 mi hiFBS </td><td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 500 ul Glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 10 uM RA </td><td> 100 ul RA (5 mM stok) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * 2 hafta maksimum tutun ve öncesinde hemen RA ekleyinkullanmak </td></tr><tr><td colspan="3"> * RA eklendikten sonra ekstra ortamı tutmayın - RA kararsız </td></tr><tr><td colspan="3"> Farklılaşma Medya 2. </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> 50 ml hacim </td><td> seyreltme </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 49 mi ENEM </td><td></td></tr><tr><td> % 1 hiFBS </td><td> 500 ul hiFBS </td><td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 500 ul Glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 10 uM RA </td><td> 100 ul RA (5 mM stok) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * 2 hafta maksimum tutun ve eklemek RA kullanımdan hemen önce </td></tr><tr><td colspan="3"> * Ekstra ortamı tutmayınRA kararsız - CE RA ilave edilir </td></tr><tr><td colspan="3"> Farklılaşma Medya 3. </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> 50 ml hacim </td><td> seyreltme </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 47 mL Neurobasal </td><td></td></tr><tr><td> 1x B-27 </td><td> 1 ml B-27 (50X stok) </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 20 mM KCI </td><td> 1 ml KCl (1M stok) </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM GlutamaxI </td><td> 500 ul GlutamaxI (100x stok) </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 50 ng / ml BDNF </td><td> 250 ul BDNF stok (10 mg / ml) </td><td> 1: 200 </td></tr><tr><td> 2 mM siklik AMP (db-cAMP) dibutiril </td><td> 100 ul db-cAMP (1M stok) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td> 10 uM RA </td><td> 100 ul RA (5 mM stok) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * 2 hafta maksimum tutun ve eklemek RA kullanımdan hemen önce </td></tr><tr><td colspan="3"> * RA eklendikten sonra ekstra ortamı tutmayın - RA kararsız </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Medya tarifleri.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line at JoVE.com

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

differentiation-of-the-sh-sy5y-human-neuroblastoma-cell-line

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

70.7K Görüntüleme.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

Video: Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...