Yeterli yer olmaması, çoğunlukla gözden makaleler gösterdi ve meslektaşlarımıza orijinal eserleri değil gösterildi özür dileriz. V.C. laboratuvar çalışmalarında V.C. NIH, NSF, USDA/NIFA, Ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir ve S.G.L. laboratuvar NIH ve bitki patoloji bölümleri ve bitki-mikrop Biyoloji fonlarından için S.G.L. tarafından desteklenmektedir

1. bitki materyali
<ol><li>Bitki türlerinin seçimi</li>
	<li>Faiz, Yani, hangi endojen proteinler için bu protein kodlar ya da patojen viral proteinler için doğal konağını temsil eden bir protein için yerli bitki türü kullanın. Buna ek olarak, seçilen bitki türleri için geçici genetik dönüşüm yöntemi seçilen mükellef olması gerekir. Not: Çalışmalar düzenli olarak TMV için iyi bir ev sahibi gösteren ve verimli bir şekilde genetik dönüşümü Agrobacterium aracılı tekniği, Yani, agroinfiltration tarafından dönüştürülür Nicotiana benthamiana, istihdam (bkz. Adım 3). İ. benthamiana bitkiler de kolayca yetişir ve kolayca Agrobacterium tarafından aşılamaya ve kolayca confocal mikroskobu tarafından analiz büyük yaprakları vardır.</li>
	<li>
Bitki büyüme
	<ol>
<li>İ. benthamiana tohumları yüksek yoğunluklu, ıslak toprak bitki. 20-25 ˚C altında 16 h ~ 75 µmol fotonlar m-2 s-1 , ışık ve karanlığın 8 h kontrollü ortam odasında kalsın. Euphyll çapı 0.5 cm ulaştıktan sonra dikkatle için daha büyük tencere fide aktarmak ve büyüme aynı koşullar altında aynı odasında devam etmek.</li>
		<li>Onlar ne zaman en büyük 4-6 cm çapında yapraklar 4 hafta içinde 4-8-yaprak Sahne Alanı'na büyümek kadar bitkiler korumak; Şu anda, onlar agroinfiltration için kullanılabilir (bkz. Adım 3). Not: gelişimsel bu aşamada yaprak mimari kez24,25bazen tutarsız sonuçlar için önde gelen, değişir çünkü çiçek başladılar da önemlisi, hiçbir zaman bitkiler kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ifade vektör İnşaat
<ol><li>
İfade sistem seçimi
	<ol>
<li>En iyi maiyet-protein okudu bitki türleri ilgi ifade ifade sistemi, Yani, vektörel çizimler ve vektör Teslimat yöntemi, seçin. Not: Bazen, böyle belirli kombinasyonları test protein/bitki türlerinin gerektiren belirli vektörel çizimler ve Teslimat yöntemi en iyi ifade ve faiz protein fonksiyonu için vektör. En çenekli bitkiler için ikili plazmid olarak ifade vektörel çizimler ve dağıtım sistemi olarak agroinfiltration ancak, seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein flüoresan etiketleme
	<ol>
<li>Fluorescently Pd yerelleştirme dahil olmak üzere onun hücre altı dağıtım22, analiz için ifade her protein etiketleyin. Not: autofluorescent proteinleri CFP ve DsRed2, gibi Etiketler istihdam. CFP ile test edilmiş protein etiketli ve ücretsiz bir DsRed2 ile coexpress. CFP işlevleri hem etiketi hem bir virüs ilgisi olmayan kargo molekül olarak. DsRed2 işlevleri geçici ifade genel verimliliğini kalibre ve hücre-başlangıçta dönüştürülmüş hücre; tanımlamak için özerk, çünkü Bu ikinci işlev potansiyel olarak olmayan-cep-özerk test edilmiş proteinlerin hücre hücre hareketi değerlendirirken önemlidir. Aynı zamanda hücre özerk, PDCB1, Pd marker ile coexpression için test edilmiş protein CFP ve DsRed2 ile PDCB1 ile etiketleyin.</li>
		<li>Kural olarak autofluorescent etiketi ifade protein karboksil terminus için sigorta. Ancak, Pd hedefleme öğesini tam uzunlukta test protein sergiler tehlikeye etiketi amino-terminus için protein aktarın.</li>
		<li>Uygun bitki ifade vektör test edilecek proteinlerin kodlama dizileri klon. Not: Sitemizde floresan etiketleme sağlayan birçok farklı bitki ifade vektörel çizimler. PSAT plazmid26 bir dizi veya bir bölümü, çerçeve ile (bkz. Adım 2.2.1) önerilen autofluorescent Etiketler amino hem de doğrudan ilgi dizi klonlama için uygun olan onların türevleri27,28, kullandığımız- ve karboksil-terminal yönler.</li>
		<li>Her ifade kaset Agrobacterium ikili vektör aktarın. Not: pSAT tabanlı yapıları bitki doku, agroinfiltration, içine doğrudan biolistic teslimat için uygun olmakla birlikte burada (bkz. Adım 3), önerilen dönüşüm yöntemi olan gerektirir T-DNA arasında bulunan olmasını ifade kaset 29kenarlıklarının rengini bir ikili vektör. Not: Tüm pSAT vektörel çizimler devrin pPZP RCS2 multigene ifade ikili vektör26,30 bir tek adım kullanarak nadir kesme nükleaz AscI, -PpoI, -SCEI, CeuI, klonlama tarafından izin vermek için tasarlanmıştır PI-PspI ve PI-TliI 26. Contegra lox siteleri31, kullanarak recombinatorial klonlama, kullanmak için tercih eden araştırmacılar örneğin, pSAT vektör türevleri26,27istihdam.</li>
		<li>Coexpression, her iki ifade kaset transferi, örneğin, test protein-CFP ve DsRed2 veya test protein-CFP ve PDCB1-DsRed2 (bkz: adım 2.1), aynı pPZP-RCS2 ikili vektör için. Not: Alternatif olarak, bireysel ikili yapılarını barındıran Agrobacterium kültürlerin birlikte infiltrasyon i. benthamiana içine için karışık olabilir (bkz. Adım 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
PPZP-RCS2-esaslı plazmid 1 µg adım 2.2.5-100 µL kültür Agrobacterium tumefaciens yük EHA105 veya GV3101 açıklanan32hazırlanan yetkili hücre eklemek, 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya, 1 dk, sıvı azot flaş-donma ve 15 dakika 28 ° C'de kuluçkaya.
	<ol>
<li>Sonra 1 mL LB orta (10 g/L tryptone, 5 g/L Maya özü ve 10 g/M NaCl) yetkili hücre karışıma ekleyin ve 28 ° c 2 h Spin 3000 × g 1 dk. için hücreleri aşağı için kuluçkaya, onları yeniden 0.2 mL LB askıya alma ve onları LB agar (örneğin, 100 mg/L Spektinomisin ve 50 mg/L Rifampisin pPZP-RSC2-esaslı vektörel çizimler26,30için) uygun antibiyotiklerle birlikte üzerinde plakası. Bireysel kolonileri görünür hale gelene kadar 48 h 28 ° C'de büyümek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almak ve bir taze LB agar plaka üzerine bireysel sömürgeler plakası (bkz. Adım 3.1), 48 h 28 ° C'de büyümek ve belirli ikili yapıları varlığını doğrulamak için koloni PCR33 tarafından bakteri analiz için küçük bir miktar almak.</li>
	<li>
Her Agrobacterium koloni gecede 28 ° C'de ilgi 5 mL LB orta (bkz. Adım 3.1.1) uygun antibiyotiklerle birlikte yapı ile büyümek. 3000 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve onları yeniden OD600için askıya agroinfiltration arabellek (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone) 0.5 =. Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
	<ol>
<li>Bir tek multigene ifade plazmid yerine ikili plazmid karışımı protein coexpression için kullanılıyorsa, infiltrasyon önce 1:1 v/v oranında karşılık gelen hücre kültürleri karıştırın. Sonra hücreleri 28 ° c 2 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İnoculum 1 mL plastik şırınga ve basın karşı tam olgun i. benthamiana alt (abaxial) epidermis şırınga (iğne) meme yaprakları yükleyin. Eldivenli bir parmak ile yaprak adaxial yüz34,35üzerinde tutun.
	<ol>
<li>Agrobacterium infiltrasyon ortamda yavaş iğne ile tanıtmak. İstatistiksel anlamlılık için birkaç her bitki yapraklarda sızmak. : Not tutarlı ifade düzeyleri verir gibi en eski yaprakları kullanılır.</li>
		<li>Bütün yaprakları içinde in situaşılamak. İnfiltre bitki gözlem kadar adım 1.2 ile açıklandığı gibi korumak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. confocal mikroskobu
<ol><li>Her yaprak damarları arasında parçalara kesmek için bir bıçak kullanın 24-48 h sonra infiltrasyon (bağlı olarak geçici ifade belirli test protein verimlilik); Öyle ki dilim kapak mikroskopi için kullanılan cam (22 mm x 40 mm) tarafından tamamen kapsadığı her doku dilimin boyutu olmalıdır.</li>
	<li>Nesne üzerinde yaprak dilimleri, karşı karşıya abaxial yaprak yüzeyi ile slayt yer yaprak dilim üzerinde bir damla su koyun ve cam ile kapsar. Küçük parçalar halinde her tarafında kaset ile kapak cam hareketsiz.</li>
	<li>
Bir lazer confocal mikroskobu tarama altındaki agroinfiltrated dokuları gözlemlemek ve elde edilen görüntüleri.
	<ol>
<li>İlk olarak, 10 X objektif lens hücreleri sinyal ile tanımlamak için kullanın ve 63 x objektif lens daha detaylı gözlemler için kullanın.</li>
		<li>Kullanım 458 nm dalga boyları üzerinden CFP ve 543 heyecanlandırmak için bir argon iyon lazer DsRed2 heyecanlandırmak için nm. Resim alma, Yani, lazer yoğunluğu ve deneyler arasında photomultiplier tüp (PMT) ayarları için tüm ayarlarını korur. Ortalama olarak, 100-120 hücreleri deneysel her koşul için inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. tanımlaması PLS
<ol><li>Yerelleştirme confocal mikroskop (Bölüm 4) kullanarak test protein teşhis. Test protein karakteristik periferik punctate desen25,36,37,38,39,40,41 vardır ve colocalizes kontrol edin Pd işaretçisiyle PDCB123. Bu test protein olasılıkla PLS dizileri içerdiğini gösterir.</li>
	<li>Sonra onun açık okuma çerçevesi (ORF) (genbank katılım numarası BAF93925.1) giderek daha alt bölümlere ayırma test protein, PLS aktivitesinin onay daha küçük parçaları, autofluorescently, (örneğin, CFP,) her biri etiket ve analiz onların 4. adımda açıklandığı gibi hücre altı yerelleştirme. Başlangıçta, boyutu 100 amino asit kalıntıları eklenmesi Kentler her parça için önerilir.</li>
	<li>Daha fazla PLS etkinlik ve hala merkeze yerelleştirir en küçük parçası kadar adım 4'te açıklandığı gibi onların hücre altı yerelleştirme kontrol kesilmiş parçaları alt bölümlere ayırma, Yani autofluorescent etiket kargo taşımacılığı için yeterli PD için tanımlanır. Bu parçada PLS sırasını göstermek için olduğu tahmin edilmektedir.</li>
	<li>Sözde PLS tam uzunlukta test protein, Yani sigorta sözde PLS olmadan test proteinin kalan kısmını autofluorescent etiketi silin ve ortaya çıkan mutant proteinin hücre altı yerelleştirme adımda anlatıldığı gibi belirlemek 4. sözde PLS yoksun bu mutant proteinin merkeze yerelleştirmek başarısız olursa, bu tespit PLS sadece yeterli (bkz. Adım 5.3), ama aynı zamanda test protein Pd taşıtlar için gerekli olmadığını belirtir.</li>
	<li>Agroinfiltrate (bkz. Adım 3.3) CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2 için yaprakları ifade yataklık Agrobacterium kültürlerin karışımı ile inşa. 10 adım 4,3 olduğu gibi aynı ayarları kullanarak x objektif lens ile confocal mikroskop kullanarak infiltre doku gözlemlemek.</li>
	<li>Başlangıçta infiltre hücreler olarak CFP ve DsRed2 sinyalleri içerir ve bu sinyalin CFP içeren bitişik hücreleri bu sergi hareketin skor hücreleri puan. Not: Bu adımı potansiyel hücre hücre hareket kabiliyetini için tanımlanan PLS inceler; Pd (dahil olmak üzere çoğu viral MPs bitki) hedef birçok protein taşımak da Pd ile komşu hücrelere olmasıdır. İnfiltrasyon için kullanılan Agrobacterium konsantrasyonu sırasıyla farklı yapıları ifade verimliliği üzerinde bağlıdır. Agroinfiltration için (i) tek hücre, bitişik hücreleri dönüştürülmemiş bırakarak dönüştürme sağlar, (ii) ifade benzer verimliliği elde hücre kültür seyreltme kullandığınızdan emin olun. Örneğin, bizim deneyler OD600 0,01 ve 0.005 CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2, ifade için sırasıyla kullanmaktadır.</li>
</ol>6. anahtar PLS42 alanin tarama kullanarak artıkları tanımlaması
<ol><li>Sıra astar istenen mutasyon, Yani, ikame alanin, her astar Merkezi bölgenin etrafında ile hedef amino asit kalıntısı açıklandığı gibi içerecek şekilde tasarlanmış bir çift istihdam kodlama PLS yükseltmek için standart PCR iletişim kurallarını kullanır 21. Astar tasarım ve kullanım sitesi yönetmen mutagenesis kit site yönettiği mutagenesis üretici yönergelerine göre için yürütmek.</li>
	<li>Herhangi bir standart DNA arıtma kiti kullanılarak elde edilen PCR ürünleri arındırmak ve ebeveyn ortadan kaldırmak için DpnI ile 37 ° C'de sindirir (Yani, mutasyona uğramış olmayan) metillenmiş ve hemimethylated DNA'sı. Bu (değil on Ice) oda sıcaklığında 5 min için sakin olun. Daha sonra karışımı doğrudan E. coli yetkili hücreleri43dönüştürmek ve koloniler istenen mutant yapıları ile adım 3.2 açıklandığı gibi tanımlar.</li>
	<li>2.2.4. adımda açıklandığı gibi ikili vektör mutant yapıları tanıtmak, adım 3'te açıklandığı gibi agroinfiltration yapmak ve adımları 4 ve 5. 1 açıklandığı gibi Pd hedefleme değerlendirmek.</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Bu iletişim kuralının dört çekirdek bileşenlerinin vardır: gerekli ve yeterli test eritme merkeze sistematik lige uzunluğu, giderek azalır parçaları ilgi proteinin hedefleme için bir dizi tanımlama kavramı Hem etiketi hem makromoleküllerin kargo ve Pd yaşayan hedefleme için fonksiyonel tahlil olarak hizmet veren bir autofluorescent protein parçaları test füzyon proteinlerin geçici ifade aşağıdaki dokular bitki. Not geçici ifade Agrobacterium aracılı zaman, Yani, birkaç gün, sık sık benzer çalışmalar15dakika içinde kullanılan transgenik bitkilerin üretimi için gerekli ay ile karşılaştırıldığında göreceli olarak kısa bir süre içinde veri oluşturur.
Coexpression protein hücre altı yerelleştirme işaretçileri olan ilgi, örneğin, PDCB1 veya ücretsiz DsRed2, genellikle bir multigene ifade vektör gerçekleştirilir. Tek bir vektör içine birkaç ifade kaset transferi teknik olarak sorunlu ise, ancak, coexpression da her kaset ayrı bir ikili yapı aktarılması ve eşdeğer miktarda sıvı kültürleri birleştirerek gerçekleştirilebilir agroinfiltration için elde edilen Agrobacterium suşları. Bu protokolü geçici ifade kullanır çünkü varlıklarını ifade verimliliği için zararlı olmasa da ikili vektör seçim işaretleri istikrarlı dönüşüm, taşımak.
Bu protein ifade için optimize edilmiş ve i. benthamianahedefleme protokoldür; Ancak, Arabidopsis45,46, mükellef tarafından Agrobacterium genetik dönüşümü için de dahil olmak üzere diğer bitki türlerinde kullanılabilir. Diğer bitki türü için veya aksi takdirde istenirse, bu iletişim kuralını biolistic teslim41 ifade kaset için ikili vektörel çizimler aktarmak için ihtiyaç kaçınarak doğrudan pSAT tabanlı vektörel çizimler, geçici ifade için kullanmak için adapte edilebilir.
Kritik nokta bu protokolündeki bitki materyali tutarlı fizyolojik ve gelişimsel durumdur. Özellikle, tüm bitkiler tüm deney boyunca sağlıklı olması gerekir, ve, agroinfiltration için i. benthamiana bitkiler 4-hafta değerinden küçük olması gerekir eski ve 4-6 cm çapında olmak en büyük yaprak ile 4-8-yaprak aşamada. Eğer bitkiler çok genç, agroinfiltration etkileri çok ağır, ifade yerelleştirme tagged proteinlerin çalışmasına mani olacak. Öte yandan, büyük bitkiler kez Pd24,25Pd hedefleme desenleri tutarlılığını da etkileyen, değişken mimari sergi.
Yine de, fizyolojik şartlarda bitki bir bütün olarak ve onun dönüştürülmüş hücrelerin özellikle değişen nedeniyle, Pd her deneyde hedefleme verimliliğini biraz farklı olabilir. Böylece, hücreleri nispeten çok sayıda analiz etmek önemlidir (> 100) deney, başına ve her denemenin en az üç biyolojik çoğaltır gerçekleştirin. Genellikle, en az % 70 Pd yerelleştirme dönüştürülmüş hücrelerin sergiler, etkinlik, hedefleme Pd içermesi için test edilmiş bir parça göz önünde bulundurun. Her parça, örneğin, yüzde Pd özgü punctate birikimi desen gösterilen dönüştürülmüş hücrelerin verimliliğini hedefleyen Pd farklılıkları Öğrenci t-Testi ve p-değerleri tarafından analiz < 0,05-0,01, karşılık gelen istatistiksel olasılık % 95-99 daha fazla.
Füzyon molekül floresan etiket/kargo konumunu başka bir önemli konudur. Bazı Pd hedeflenmiş proteinler de endoplazmik retikulum (ER) ile ilişkilendirmek ve bu Derneği engelsiz amino-terminal sıra gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, karboksil-terminus ilgi protein parçasının amino-terminus için floresan etiketinin eritilmiş olan amino-terminal füzyon, örneğin, CFP veya DsRed2, kullanılmalıdır. Bu varsayılan yerleşim etiketinin aşağıdaki durumlarda değiştirilebilir. (i) Eğer amino-terminal füzyon kullanılamadığına – Yani, onlar yapmak değil anlamlı hücre altı yerelleştirme Desen Sergisi, kötü ifade edilir veya floresan sinyal için güvenilir algılama – yeterli oluşturmaz ve eğer protein ilgi yok amino-terminal sinyal dizileri veya karboksil-terminal füzyon amino-terminus test parçasının etiketi karboksil-terminus eritilmiş olan içermemesi, onlar denenmesi gerektiğini. (ii) sinyal dizileri, karboksil terminus adlı protein ilgi içeriyorsa, karboksil-terminal füzyon de kullanılmalıdır. (III) faiz protein GPI bağlantılı proteinler arasında bulunanlar gibi her iki amino - ve karboksil-terminal sinyali veya bir amino-terminal sinyal peptid içeriyorsa, henüz onun amino-terminal füzyon kullanılamaz varsa, etiketin dahili olarak, yer almalıdır) ya aşağı amino-terminal sinyal veya karboksil-terminal sinyal ters yönde). Bizim daha önceki yayınları47,48yılında iç floresan proteinlerin etiketleme için yararlı bazı yordamlar açıklanmıştır.
Şu anda, hiçbir bilinen fikir birliği sıra PLS için vardır. Bu nedenle (Adım 5.2), başlangıçta protein bitişik ~100-200 kalıntı uzunluğundaki parçaları ayırmaktan tavsiye ediyoruz. Bunlar daha sonra giderek daha kısa yapılabilir gözlenen Pd hedefleme aktivite veya bunların eksikliği dayalı. Bir diğer potansiyel sinyalleri (örneğin, NLS, sinyal peptidler, vb) protein mevcut hedefleme dikkatli olmalıdır. Ancak, böyle dizileri PLS serileri ile potansiyel çakışma bilinmeyen olduğu gibi bu protein bölgeler mutational bu çözümlemeye dahil edilmelidir.
Şimdiye kadar bu iletişim kuralı bir protein molekülü21içinde tek bir PLS tanımlamak için kullanıldı. Büyük olasılıkla, ancak, bir protein birden fazla sinyal sıra içerebilir; birden çok NLSs gerçekten de GATA transkripsiyon faktörleri49da dahil olmak üzere birçok nükleer protein nitelendirdiler. Böylece, farklı parçaları test protein hedefleme Pd için analiz ederken, birden böyle parçası, bağımsız olarak ya da sinerjik hareket birden fazla PLSs varlığını gösteren belirtilir ki mümkündür.
Ana bu protokolü geçici agroinfiltration, görsel olarak hücre altı yerelleştirme aşağıdaki ilgi ifade proteinlerin en iyi elde edilir epidermal hücrelerin ve nispeten dar büyüme aşamasında, kısıtlamasıdır. Gerektiğinde, bu sınırlama stabil her onların doku ve hücre tiplerinin çoğunda test edilmiş proteinlerin hızlı transgenik bitkiler üreterek üstesinden gelebilir. Ayrıca, bu iletişim kuralını viral MPs veya geçici genetik dönüşümü için mükellef değildir bitki türlerinde işlev diğer Pd hedeflenmiş proteinler çalışmaları için yararlı olmaz.
Bu teknik bir PLS TMV MP tanımlanması için geliştirdiğimiz iken, PLSs keşif herhangi bir diğer bitki için viral MPs veya merkeze, geçici veya kalıcı olarak yerelleştirmek bitki endojen proteinlerde kullanılabilir. Ayrıca, uygun hücre altı yerelleştirme işaretleri47ile birlikte, bu protokol proteinler tesislerinde ilgi içinde birçok hedefleme sinyalleri tanımlanması için uygundur.

Plasmodesmata (Pd) anahtar düzenleyiciler bitki gelişme ve mRNA ve küçük RNA molekülleri transkripsiyon faktörleri kadar morfogenez, hücreler arası taşıma için kanalların görevi. Ayrıca, polis bu makromoleküllerin taşıma kapasitesi onların hücreler arası forma için çoğu bitki virüsler tarafından enfeksiyon sırasında kullanılmaktadır; PD taşımak için bitki virüs hareketi proteinler (MPs), özellikle Pd1,2,3,4,5,6 için hedef olarak adlandırdığı özel proteinler geliştiğini , 7. Pd taşıma moleküler yollar büyük olasılıkla bu yolları taşınan proteinler hedef belirli serileri ile yakından bağlantılı. Böylece, bu Pd yerelleştirme sinyaller (PLSs) tanımlaması karşılık gelen Pd taşıma yolu tanı olabilir. Örneğin, farklı nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) dizileri9,10için belirli olabilir farklı nükleer alma yolları için Pd taşıma8, kıyasen olacaktır. Kavramsal olarak, NLSs ve PLSs gerekli ve yeterli hedefleme için yarilabilir hücre altı hedefleme sıraları temsil eder. Ancak, NLSs11farklı olarak, PLSs sıra vukuf ciddi sınırlıdır. Özellikle, sadece dört protein sequences Pd hedefleme dahil, hepsiyle endojen bitki proteinleri türetilmiş bildirilmiştir. İlki KN112 -iç hücre katmanlardan bitki yaprak13 epidermis için hamle bir transkripsiyon faktörü-ve onun KNOX homologs14homeobox etki alanı tarafından temsil edilir. İkincisi de bir transkripsiyon faktörü, hücreler arası (BT) ticareti olarak açıklanan bir sözde PLS içerir Dof motifi15uzaklıktadır. PDLP1 plasmodesmata yerleşik tip 1 membran protein üçüncü dizisidir ve bir transmembran etki alanı16tarafından temsil edilir. Son olarak, sıra hedefleme dördüncü Pd son zamanlarda glycosylphosphatidylinositol (GPI) rapor edilmiştir-bağlantılı protein ve glycosylphosphatidylinositol (GPI) değişiklik sinyali17tarafından temsil edilir.
İlginçtir, çok yakın zamana kadar hiçbir PLSs bildirilmiştir için viral MPs. Önceki çalışmalarda sözde PLS serilerinde bitki viral MPs18,19ama hiçbir gerçek PLS Yani, gerekli ve yeterli Pd bir ilişkisiz kargo molekül () hedefleme için en az amino asit dizisi varlığı belirtilen örn., CFP) viral bir MP olduğu belirlendi. Henüz bu proteinler, Tütün mozaik virüsü (TMV), MP için hangi Pd Yerelleştirme ve taşıma gösterdiği20olmuştur ilk biriydi.
Bu boşluğu adrese TMV MP PLS tanımlamak için deneysel bir stratejisi geliştirdi. Bu strateji üç kavramlar üzerine dayanıyordu. (i) biz PLS gerekli ve yeterli protein Pd21' e hedefleme için en az amino asit dizisi olarak tanımlanır. (ii) çünkü TMV MP Öncelikle Pd hedefleyen ve bu kanalları22translocates, biz bu iki etkinlikler uncoupling ve iyi niyetli PLS, hangi görev sonraki taşıma için değil de yalnızca Pd hedefleme için tanımlama amaçlı. (iii) biz etkinlik, yapısal veya fonksiyonel olarak hedefleme onun Pd amino asit kalıntıları eklenmesi önemli için tanımlanan PLS analiz edildi. Bu yaklaşımı kullanarak, bir 50-amino asit kalıntı sıra amino-terminus iyi niyetli PLS davranır TMV MP, belirlendi. Bu protein tüm uzunluğu doymuş TMV MP parçaları bir dizi üreten, onların karboksil termini CFP ile etiketleme ve geçici onları bitki dokularda ifade tarafından yapıldı. PD yerelleştirme her test parçaları bir Pd marker protein, PDCB1 (Pd callose bağlayıcı protein 1)23coexpressing tarafından tespit edilmiştir. PLS temsil etmek için hala merkeze lokalize ama polisi, dizinlere değil en küçük parçası olarak kabul edildi. Son olarak, PLS alanin onun yapısı ve/veya işlev için gerekli anahtar amino asit kalıntıları belirlemek için taranan.
Oysa burada TMV MP PLS tanımlaması açıklayarak bu yaklaşım göstermek, o herhangi bir diğer Pd hedeflenmiş proteinler arasında PLSs keşfetmek için bitki patojenleri veya bitkiler kendileri ile kodlanmış olup olmadığını istihdam edilebilir; Bunun nedeni bizim yöntem viral MPs onların yetenek-e doğru hedef açısından herhangi bir benzersiz özelliklerinin avantajlarından merkeze almaz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) ağ geçitleri üzerinden bitki hücreleri arasında küçük ve büyük moleküllerin taşınmaktadır olarak işlev hücre hücre bağlantılardır. PD taşıma ile küçük moleküllerin, iyonlar ve su, pasif gerçekleşmesi için kabul edilir ise, biyolojik oluştururlar, böyle proteinler, hücre hücre aktarımı büyük olasılıkla belirli hedefleme sinyalleri içerir etkin bir mekanizma yoluyla oluşur molekül nakletti. Tanımlanan plasmodesmata (Pd) yerelleştirme sinyalleri (PLSs) kıtlığı ciddi protein sıralama anlayış kısıtladı yollar dahil bitki hücre hücre makromoleküllerin ulaşım ve iletişim. Bitki zenginliği endojen ve viral proteinler Pd, trafikten bilinen sadece üç PLSs bildirilmiştir bugüne kadar hepsi endojen bitki proteinleri. Böylece, gerekli ve Pd hedefleme, doğrudan yaşam için yeterli olan fonksiyonel bir PLS sırasını, tanımlamak için güvenilir ve sistematik deneysel bir strateji geliştirmek önemlidir bitki hücreleri. Burada, biz bir paradigma olarak Tütün mozaik virüsü (TMV) hücre hücre hareketi protein (MP) kullanarak böyle bir strateji tanımlarlar. Bu deneyler, tespit ve ilk karakterize viral PLS dikmek, en Pd hedeflenmiş proteinler serilerinde PLS keşfi için adapte edilebilir.

Sadakatle açıklanan kurallarından beklenen sonuçlar göstermek ve TMV MP PLS tanımlamak, temsilcisi verileri Yuan ve ark. adapte olmuşlardır 21. şekil 1A ilk özetleyen önemli yapılar tam uzunlukta TMV MP (1-268), TMV MP PLS (oluşan ilk 50 amino asit kalıntıları protein 1-50), ifade ve onun alanin V4A türevleri tarama erimiş (olarak üretilen CFP için açıklanan adımları 2.2, 5.2 ve 6) şekil 1B özetleyen ve etiketli bu proteinler hücre altı lokalizasyonu quantifies oysa. Şekil 1 c TMV MP-CFP için ve için TMV MP PLS-CFP de coexpressed Pd işaretçiyi gelince, PDCB1-DsRed2 gözlenen karakteristik periferik punctate Pd yerelleştirme desen gösterir (bkz. Adım 5.1). Şekil 2A gösterir Pd TMV MP-CFP ve coexpressed ücretsiz DeRed2 TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic dağıtımı için hedefleme (bkz. Adım 5.1). Son olarak, şekil 2B hem TMV MP ve TMV MP bu kalıntı PLS yapısı ve fonksiyonu için önemli olduğunu belirten PLS ile bir tek alanin ikame V4A, Pd hedefleme kaybı gösterir; aynı PDCB1 hala yerelleştirir merkeze coexpressed Pd marker hücreleri (bkz. Adım 6).
Bu kavramsal olarak ve teknik olarak basit bir prosedür protein parçaları, bir autofluorescent işaret-kargo protein füzyon ve yetenek merkeze yerelleştirmek test sistematik üretiminin en az protein sıra tanımlayabilirsiniz bu veri göster gerekli ve Pd hedefleme, Yani, PLS için yeterli. Bu yerelleştirme veriler doğru yorumlanması için bilinen bir Pd protein, örneğin, PDLP veya PDCB aile üyeleri16,23 veya bir bitki ile colocalization deneyler gerçekleştirmek için önemlidir Pd44 sıralamak viral MPs . Belli ki, colocalization gibi tüm P yerelleştirme proteinler aynı merkeze hedefleyebilir, ancak en az bir Pd marker proteinlerin colocalization istatistiksel olarak anlamlı bir ölçüde PLS etkinliği tanımlamak için gerekli olan tam, olmak zorunda değil.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig1.jpg"> Şekil 1: TMV MP kimliği PLS. (A)Özeti TMV MP PLS. TMV MP dizileri, yeşil kutuları tanımlamak için kullanılan ana CFP-fusion oluşturur; CFP, mavi kutu; P, organizatörü; T, Sonlandırıcı. Soldaki sayıları her TMV MP parçasının içinde yer amino asit kalıntıları olduğunu gösterir. (B) (A) gösterilen füzyon proteinlerin hücre altı yerelleştirme özetini. PD yerelleştirme veya nucleocytoplasmic yerelleştirme karşılık gelen hücre altı işaretleri, PDCB1-DsRed2 ve ücretsiz DsRed2, yerelleştirme sırasıyla göre tespit edilmiştir. Her yerelleştirme desen sergilenmesi hücre yüzdesi yapı üç bağımsız deneylerde başına 100 ifade hücre puanlama üzerinde gösterilir. Ortalama ± standart hataları (SE) verilerdir. (C) Pd TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve Pd marker PDCB1-DsRed2 hedefleme. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig2.jpg"> Şekil 2: TMV MP, TMV MP PLS ve onların alanin tarama mutantlar Pd hedefleme. (A)hücre altı yerelleştirme TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic işaret DsRed2. (B) kaybı, yetenek V4A alanin tarama mutant TMV MP-CFP ve TMV MP PLS-CFP hedefleme Pd. PD Pd işaret PDCB1-DsRed2 coexpression tarafından görüntülenmiştir. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Görüntüleme.  State University of New York. Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Video: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.