Name: peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Yazarlar Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı Keşif Araştırma İleri Teknoloji (JST-ERATO), Yeni Enerji ve Endüstriyel Teknoloji Geliştirme Örgütü (Nedo) ve Çapraz bakanlık Stratejik İnovasyon Tanıtım Programı (SIP), Japonya&#39;dan fon kabul etmek istiyorum .

Peptit bazlı formülasyonların hazırlanması 1. <ol><li> Her peptit aşağıdaki gibi bir stok çözelti hazırlayın (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml veya 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) ve (BP100) 2 K 8 (70 uM). 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her peptidin gerekli miktarda tartılır ve peptidi eritmek için otoklavlanmış ultra saf su ilave edilir. berrak bir çözelti elde edilene kadar tekrar tekrar pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> Yükseltmek ve plazmid DNA (pDNA), iki-şeritli DNA (dsDNA) ve standart moleküler metodolojilere göre, çift-şeritli RNA (dsRNA) temizler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1 mg / ml (pDNA ve dsDNA) ya da 400 nM (dsRNA) bir konsantrasyonda stok çözeltileri hazırlanır. </li><li> Sodyum karbonat çözeltisi (0.1 M, pH 9), 1 ml protein (örn., Alkol dehidrojenaz, ADH) tozu 1 mg çözülmesiyle, 7 uM konsantrasyonda protein stok çözelti hazırlayın. F proteininin etiketleStandart protokollere göre olan rodamin B (RhB) halinde luorescent probları hücrelere verilebilir protein, mikroskopik sağlamaktır. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, ilgili bileşenlerin bir araya getirin. <ol><li> Peptid-pDNA formülasyonlar sitoplazma hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul 6.4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 773,6 ul ekle. Nükleer anlatım (P35S-RLuc-tNOS&#39;u, Tablo 1) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın. </li><li> Peptid-pDNA formülasyonlar mitokondri hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul Cytcox- 6.6 ul (KH) 9 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika boyunca stabilize etmek ve daha sonra BP100 2.4 ul (1 mg / ml) ekleyin izin verin. Karışım, 25 ° C&#39;de 15 dakika dengelenmesine izin verin6; 15 dakika daha ° C. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 771 ul ekle. Mitokondriyal ifade (: rluc, Tablo 1 pDONR-COX 2) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın. </li><li> Peptid-dsDNA formülasyonlar için, dsDNA (1 mg / ml) 8 ul 5.1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 786,9 ul ekle. </li><li> Peptid-dsRNA formülasyonlar için, dsRNA (400 nM) 50 ul 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu RNaz içermeyen su, 700 ul ekle. </li><li> Peptid-protein formülasyonları için, ADH 16 ul (7 uM) (BP100) 2 K 8 (70 mcM) 16 ul ekleyin ve karıştırıniyi pipetleme. Karışım 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 768 ul ekle. </li></ol></li><li> Formülasyonlar 25 ° C&#39;de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. </li></ol> Peptit bazlı formülasyonların 2. Karakterizasyonu <ol><li> dinamik ışık saçılımı (DLS) analiz için bir küvete her solüsyonu (800 ul) aktarın. 173 ° &#39;lik bir geri yansıma deteksiyon açısı ile 25 ° C&#39; de, bir 633 nm He-Ne lazer kullanılarak bir zeta nanosizer ile oluşan komplekslerin hidrodinamik çapı ve poli dağılım endeksi belirlemek. </li><li> Aşağıdaki boyutu ölçümleri, 25 ° C&#39;de dielektrik sabiti, kırılma indisi ve suyun viskozitesine varsayılan parametreleri zeta potansiyel ölçümleri için katlanmış bir kılcal hücresine her çözeltisi (800 ul) aktarın. </li><li> (AFM atomik kuvvet mikroskopi ile DLS analizi için kullanılan kompleks çözeltisinin küçük bir hacmi, dikkat). Bir mika levha taze maruz bölünmüş yüzeye Mevduat karmaşık solüsyonu 10 ul ve kapalı plastik petri kuru gecede havalandırmak için mika bırakın. </li><li> Modunda 27,28 dokunarak 1.3 N / m arasında bir yay sabitine sahip bir silikon konsol kullanılarak 25 ° C &#39;de hava içinde komplekslerinin bir imgesi alınır. </li></ol> Bitki Yapraklarının 3. Sızma <ol><li> 3 haftalık toprak yetiştirilen bitkiler (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 veya kavak 26) kullanın. gen ekspresyonu ve protein teslim ölçümü için üç kopya olarak hizmet etmek üzere en az 3 yaprak transfekte. </li><li> Bir yaprak transfeksiyonu için karmaşık çözeltisi 100 ul ile 1 ml iğnesiz plastik şırınga yükleyin. yaprağın alt yüzeyi bir şırınganın ucu yerleştirin. </li><li> biraz yaprak karşı şırınga ucu bastırın ve i ile bir karşı baskı uygulayarak yavaş yavaş şırınga pistonu bastırınKarşı taraftan bir lateks eldivenli elin nDex parmağı. Başarılı infiltrasyon yaprak suda ıslatılmış alana yayılması olarak görülmektedir. kimlik kolaylığı için sızmış yaprakları etiketleyin. </li><li> peptid-pDNA (12 saat), peptid-dsDNA (12 saat), peptid-dsRNA ile infiltrasyon, aşağıdaki optimize sürelerde transfekte yaprak inkübe - aşağıdaki koşullar altında (9 48 sa) ve peptit-protein (6 saat) formülasyon: 16 saat ışık / N. benthamiana için 29 ° C&#39;de A thaliana, kavak, veya 24 saat sabit bir ışık için 22 ° C &#39;de 8 saat karanlık. </li></ol> Transfeksiyon etkinliğindeki 4. Değerlendirme <ol><li> Daha küçük bitkilerin tüm yaprak transfekte (örn., A. thaliana) veya daha büyük tesisler için infiltre bölgenin 1 cm2 bölümü tüketim (örn., N. benthamiana). </li><li> Renilla lusiferaz (Rluc) raportör vektörü kullanılarak transfeksiyon deneyleri için, transfectio belirlenmesin, verimi kantitatif bir Rluc Deney Kiti kullanılmıştır. <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her kesilmiş yaprak veya yaprak bölümü yerleştirin. tüp başına 1 x Rluc Deneyi Lizis Tamponu 100 ul ekle. Aynı şekilde, transfekte-olmayan kontrol yaprakları (üçlü) lizatları hazırlar. </li><li> Bir homojen hale havaneli kullanılarak yaprak öğütün ve 6, 25 ° C &#39;de elde edilen lizat inkübe - 10 saat süredir. </li><li> 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 12.470 x g&#39;de lizat santrifüjleyin. Aktarım 20, 96 çukurlu bir mikrolevhadaki iyi olarak temizlenir lisat ul ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir BCA Protein Deney kiti kullanılarak toplam protein konsantrasyonu ölçümü için geri kalan hacmi kullanın. </li><li> kuyuya 1 x Rluc Deneyi Substrat (Rluc deney tamponu kullanılarak seyreltilmiş) 100 ul ilave edin ve yavaş pipetle karıştırılır. Bir çok modlu mikroplaka okuyucu içinde mikroplağı yerleştirin ve ölçümü başlatmak. </li><li> arka plan lüminesans çıkart (NO ortalaman-transfekte her deneysel numunenin luminescence itibaren) üç nüsha. protein (mg) miktarına Fotolüminesans oranı (nispi ışık birimleri, RLU) hesaplayın. </li></ol></li><li> Yeşil floresan proteini (GFP) raportör vektörü ya da floresan etiketli protein kullanılarak transfeksiyon deneyleri için (örn., ADH-RhB) bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak floresan izleyin. <ol><li> gibi bir kesiti yaprak kullanılabilir iken, bütün yaprak (hava boşluklarının çıkışına yardım etmesi için) kenarlarını kesin. 10 ml şırınga pistonu çıkarın ve şırınga her eksize yaprak veya yaprak bölümüne yerleştirin. </li><li> pistonu değiştirin ve yaprak kırma olmadan şırınga altına hafifçe itin. yaklaşık yarısı dolana kadar şırınga içine su çizin. </li><li> yukarı şırınga gelin ve ucu ile şırınga havayı çıkarmak için piston itin. lea gelen havayı dışarı atmak için aşağı pistonu yavaşça şırınga ucu Kapak ve çekmef. yaprak saydam görünene kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Yapışkan bant ile bir mikroskop lamı yüzeyini kaplar. Bir bıçak kullanarak yaprak örneği barındıracak kadar büyük kaset üzerinde bir kare alana kesin ve bir örnek odasını oluşturmak için forseps ile bant kare parça soyulabilir. Bant slayt ve lamel arasındaki ayırıcı olarak görev yapacak. </li><li> yukarı bakacak şekilde alt yüzeyi ile odasında yaprağı yerleştirin ve su ile kalan kamara alanı doldurmak. Bir cam lamel ile bölme içinde yaprak Seal ve yapışkan bant ile lamel kenarlarında sabitleyin. </li><li> 40X objektif altında odaklı lazer tarama mikroskobu veya 63X suya daldırma objektif kullanarak yaprak örneği inceleyin. GFP ya RhB floresans, sırasıyla 488 nm ve 555 nm uyarılma dalga boyunda görselleştirilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

ampirik tespit edilmiştir protokolü içinde kritik adımlar ele alınmıştır. Şırınga infiltrasyonu ile, peptit bazlı formülasyonlar stoma yoluyla bitki yaprak içinde hava boşluklarına yerleştirilir. Bitkiler yeterli su ve hafif süre boyunca ortam stomatal deliğin yani. Elverişli olan koşullar altında zaman çözeltinin maksimum alımını sağlamak için, süzme işleminin yapılması gerekir. (Mitokondrial hedefli DNA nakli için) iki peptitten oluşan bir kombinasyon içeren formülasyonlar için transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması açısından, ile, her bir bileşenin ilavesi için dizi önemli ve ters olmamalıdır. prosedüre birçok makul değişiklikler vardır. Bitki hücrelerinin infiltrasyonu için başka bir seçenek de dahil olmak üzere bütün bitkileri ve / veya kısmi dokulara karmaşık solüsyonun verilmesini mümkün vakum infiltrasyonu kullanımı,apikal meristemler. Bu alternatif prosedür için, fidan transfeksiyon çözeltisine batırılmış ve vakum tarafından oluşturulan basınca göre, peptid-kargo kompleksleri stoma yoluyla ve bitki hücrelerinde (Yoshizumi, T., yayınlanmamış veri) içine zorlanır. Hayvan hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara göre geçici gen ekspresyonu, yüksek DNA konsantrasyonları 29-31 arttığı gösterilmiştir. DNA peptid oranı komplekslerinin biyofiziksel özellikleri (boyut, yüzey yükü) etki not transfeksiyon verimini etkilemektedir (Şekil 4), önemlidir; Bu nedenle, en iyi oranı da artan bir DNA konsantrasyonu muhafaza edilmesi gerekmektedir. Bir gen / protein teslim maddesi olarak peptidler kullanılarak ana avantajlarından biri olan sekansı, istenen işlevi yerine getirmek için ayarlanması için uygun olmasıdır. Örneğin, bir taşıyıcı peptidin mitokondriyal hedefleme alanı Bu damızlık tarifY, bu organellere lokalizasyonu için kloroplast ya peroksisomal-hedefleme sekansları ile ikame edilmiş olabilir. Kloroplast transformasyonu biyolistik 32-34 kullanarak çeşitli bitkilerde mümkün olsa da, Agrobacterium veya biyolistik yöntemi de çekirdeğin (Tablo 2) yanı sıra, mitokondri ya da diğer organellere genleri getirebilir. Agrobacterium merkezli yöntem (Tablo 2) farklı olarak peptit bazlı transfeksiyon için bir bükülmez konakçı aralığına sınırlamaları vardır. Şu ana kadar, A. thaliana, N. benthamiana, kavak transfeksiyonu için formülasyonlar (Tablo 1) optimize edilmiştir, ancak yöntem, aynı zamanda, Nicotiana tabacum için de uygulanabilir, Domates çeşit mikro-Tom, pirinç (Hazırlık deneylerinde göre), ve diğer mono-ve çift filizli bitkiler. peptidler kullanıldığında Şimdiye kadar, transgen büyüklüğü bilinen herhangi bir sınırlama yokturS transfeksiyonu vektörler. Bunun aksine, büyük DNA moleküllerinin Agrobakterium aracılı yöntemler 35,36 dönüşüm verimliliği ve 37-39 bildirilmiştir yaklaşık 200 kb&#39;lik transgenler için üst bir sınır azaltmak için tespit edilmiştir. Biyolistik kullanımı ile, diğer taraftan, büyük DNA fragmanları bitki 38 içine hazırlama veya doğum sırasında kesilmiş olabilir. Bir üst sınırı kadar biyolistik transformasyonu için tespit edilmiştir, ancak, vücut kısıtlar daha az 150 kb 40 transfer edilebilir DNA boyutunu sınırlamak için tespit edilmiştir. Yukarıda ele alındığı Agrobacterium ya mikroprojektil bombardımanı, ya kullanılarak mevcut yaklaşımların karşılaştırıldığında gen transferi için peptit bazlı sistem kullanılarak büyük yararları, Tablo 2&#39;de özetlenmiştir. bu haliyle birkaç sınırlamalar bu yöntem için var. Birincisi, böyle bir mit olarak belirli organellere, için PDNA teslim hedefolmasına rağmen bu ochondria, DNA bağlama, hücreye nüfuz eden ve organel-geçiş dizilerinin basit bir kombinasyonu ile mümkün olduğu kanıtlanmıştır. Transgen ekspresyonu, sadece hücre içinde mitokondri küçük bir popülasyonda, konfokal mikroskobu ile tespit edilebilir. Hücre / organel zar boyunca daha komplekslerin translokasyon arttırmak ve (ii) söz hedef organel ayrışmasını ve taşıyıcı peptidden pDNA transferini geliştirmek: (i) Bu nedenle, başka modifikasyonlar için gereklidir. İkinci olarak, bu DNA verme sistemi ile, ekzojen raportör genlerin geçici ifade başarıyla hücrelerin sitosolik ve mitokondriyal bölmesinde elde edilmiştir. bitki nükleer / organel genomunda katılan genlerin istikrarlı birleşme ve ifade nedeniyle uygun seçim stratejilerinin olmaması, ancak, henüz kurulmuş değil. kabul etmekle birlikte iyileştirme ya da daha fazla d alanlar olduğunuevelopment, burada açıklanan peptit türevi strateji çeşitli bitki türleri içine çeşitli yüklerin teslimatı için yolunu açmıştır basit ve çok yönlü bir tekniktir kalır.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml and 10 ml Plastic Syringes</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Plate</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Folded Capillary Cell</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization Pestle</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri Dish</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade and Handle</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Tip Cap</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

nükleik asit ve protein yüklerin bir dizi başarılı iletim vektörleri olarak dizayn peptidler kullanılarak çeşitli bitkilerin içine katılmıştır. Katyonik peptitler ve negatif yüklü yük arasındaki elektrostatik etkileşimleri doğrudan bir iğnesiz enjektör (Şekil 1) kullanılarak yaprakları bitkiye nüfuz edilebilir transfeksiyon kompleksleri oluşumu ile sonuçlanmıştır. Bitki hücrelerinin transfeksiyonu için (deneysel olarak bu çalışmalarda 21,23-26 belirlenen) optimize edilmiş formülasyonlar teslim yük (pDNA, dsDNA, dsRNA ve protein) geniş her tür temsil Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. 300 nm - bütün peptit bazlı formülasyonların ortalama çapı 150 yaklaşık aralığında idi. DLS analizine dayanarak, tüm formülasyonlar oluşan peptit kargo gruplar, tek bir boyut dağılımına sahip olduğunu gösterir, nispeten küçük boyut çoklu-dağılırlıklan gösterilir. morfolojileriPeptit ve pDNA (Şekil 2A) ya da protein (Şekil 2B) arasındaki kompleksler, mika, AFM ile görüntülenmiştir. Homojen küresel kompleksleri DLS ölçümlerinden elde edilen verilerle uyum içinde, hem peptid-pDNA ve peptid-protein kombinasyonları için gözlenmiştir. DsRNA&#39;nın bazlı kompleksler nötre yakın yüzey yüküne vardı kompleksleri (Tablo 1) zeta potansiyeli açısından, pDNA- ve dsDNA türevi kompleksleri, net negatif yüzey yükleri vardı. Peptid-protein kompleksleri, diğer taraftan, pozitif yüklü edildi. Peptid-PDNA ve model bitki sistemleri A. thaliana ya da N. benthamiana transfeksiyonunu aracılık peptit-dsDNA formülasyonların verimleri niteliksel yanı sıra kantitatif olarak değerlendirildi. RLuc gen deneyi Bu deney, pDNA için, bu nedenle, gen ekspresyon düzeylerinin ölçümü (Tablo 1) kullanılmıştır veRLuc genini kodlayan dsDNA ilgili taşıyıcı peptidler ile kompleks için kullanılmalıdır. Yaklaşık 1 X 10 5 tahmini RLU / Mg değeri, 12 saatlik bir inkübasyon döneminden sonra, (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu nükleer hedefli dağıtım ve pDNA ekspresyonu elde edilebilir kullanılması. PDNA, peptidler bir kombinasyonunun mitokondriyal hedefli dağıtım ve ekspresyon için, Cytcox- (KH) 9 ve BP100, kompleks oluşumu için gereklidir. 12 saat aynı inkübasyon süresi ile, ancak, transfeksiyon (yaklaşık olarak 1 x 10 3 RLU / mg), çok daha düşük bir seviyede elde edilmiştir. Bu arada, benzer kuluçka dönemi (12 saat) ve gen ifadesi seviyesi (yaklaşık 1 × 10 3 RLU / mg) da 9 -BP100 peptit (KH) kullanılarak formüle, dsDNA tabanlı kompleksleri için kaydedilen / gerekmiştir. Gen ifadesinin niteliksel değerlendirmeleri kompleksleri HAZIRLIK işlenmiş yaprakları direkt mikroskopik gözlem ile gerçekleştirilmiştired pDNA kullanarak veya dsDNA GFP raportör genini kodlayan. Hedeflenmemiş peptide pDNA kompleksleri ile transfekte edilen hücrelerde, GFP tanımı açıkça görülmektedir ve sitosol (Şekil 3A) lokalize olduğu görülmüş, karşılık gelen yeşil floresan yayılır. GFP floresan lokalizasyonu deseni belirgin farklılıklar mitokondriyal hedefli peptid-pDNA kompleksleri ile infiltre hücrelerde belirgindi. Burada, mitokondriyal leke ile colocalize noktalı yeşil floresan hücrelerin mitokondrial bölmeye (Şekil 3B), münhasıran, gen ekspresyonu özgünlüğünü teyit görülebiliyordu. peptid-protein formülasyonlan söz konusu olduğunda, bir florofor (RhB) protein yük (ADH) konjugasyonu hücre bölmesine verilen protein görselleştirme sağlayacaktır. 6 saat gibi kısa bir kuluçka dönemi içinde, ADH-RhB proteini (mavi) boyunca dağılmış olduğu bulunmuşturSitosol ve infiltre hücreler, hücre arası boşluk (Şekil 3C). Öte yandan, bir gen ifadesinin hızlı ve etkili bir aşağı-regülasyon peptid-dsRNA formülasyonlar kullanılarak, çeşitli bitkilerde gerçekleştirilebilir. İlk deneyde, A. thaliana yaprağı peptid-dsRNA ile infiltre edildi kuraklık koşullarında antosiyanin (kırmızı pigment) biyosentezi için sorumlu kalkon sentaz geni (CHS) susturmak için kompleksleri. A. thaliana görünümünde fark (b Şekil 3B) optimize edilmiş peptid-dsRNA formülasyonu kullanarak susturmak CHS değerlendirmek için kolay bir yol sağlanan ve kuraklık, normal (a Şekil 3D) (ok 1 sızmış bölgeyi gösterir) altında bırakır. İkinci deneyde, peptit dsRNA kompleksleri sarı floresan protein (YFP) eksprese eden transjenik A. thaliana yapraklarına süzüldü. YFP ekspresyonunda belirgin bir azalma epidermal hücreler 9 saat p görülebilirost transfeksiyon (Şekil 3E, F). Farklı bitki sistemi (kavak, 12 saat post-transfeksiyon) &#39;de düzenleyici gen ekspresyonu formülasyonun etkinliği de (Şekil 3G, lH) doğrulanmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Şekil 1: Yaşam Bitkiler içine nükleik asit ve protein Cargoes teslimi için Peptit tabanlı formülasyonlar. tasarlanmış taşıyıcı peptidler, hücre penetran veya organel geçiş dizileri konjuge polikatyon oluşmaktadır. Polikatyonlar hücrelerine içselleştirme aşağıdaki endozomal bölmesinden ve / veya negatif yüklü yüklerin yoğunlaşmasını yanı sıra kaçış bağlayıcı etkinleştirin. Belirli organellere hücrelere yük teslim ve daha sonra, sırasıyla, hücre nüfuz dizileri ve organel geçiş dizileri tarafından aracılık eder. successfu olabilir çeşitli yüklerinlly bitkiye verilen sığır serum albümini (BSA), alkol dehidrogenaz (ADH) ve sitrin (sarı floresan proteinin bir varyantı) gibi nükleik gibi pDNA, dsDNA ve dsRNA gibi asitler, örnek olarak alınan proteinler. Biyoaktif moleküllerin şırınga infiltrasyonu ile bitki yapraklarının sokulur elektrostatik etkileşimler yoluyla peptit konjugatları ile transfeksiyon kompleksler oluşturabildiği. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Şekil 2: peptit bazlı formülasyonların morfolojileri. (KH) N / P 0.5 de 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (A) AFM genlik görüntü. (B) (BP100) molar Rati 2 K 8 / ADH formülasyonunun AFM yüksekliği görüntüsüo 10. yayınlanmış kaynaklardan 23,24 izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Şekil 3: Optimize Peptit bazlı formülasyonlar kullanılarak Transfeksiyon Efficiencies Mikroskopik değerlendirilmesi. A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerinde gözlenmiştir (A) kloroplast otofloresans (kırmızı) açıkça ayırt Sitosolik GFP (yeşil), (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (N sızmış yaprakları / P 0.5; 12 saat ). (B) GFP tanımı (yeşil), her bir peptidi için Cytcox- (KH) ile infiltre A. thaliana yaprağı 9 / BP100 / pDNA formülasyonu (N / P, 0.5 epidermal hücrelerinde mitokondri (kırmızı) saptandıe; 12 saat). GFP ile mitokondri genişlemiş görüntüleri aşırı sağ panelde gösterilir. A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerine ADH-RHB (mavi) (C) Teslim, 10 bir peptit / protein molar oranında (BP100) 2 K 8 aracılık ettiği 6 saat sonrası infiltrasyon görüntülenmiştir bırakır. Önce (D) A. thaliana yaprağı (a) ve (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (mol oranı 2; 48 saat) ile birlikte, (b) tedavi sonrası, antosiyanin biyosentez yolunun bastırılması ile sonuçlanmıştır. GFP5 dsRNA içeren benzer bir formülasyon negatif kontrol (C) ve kanadı içine infiltre edildi. oklar 2 ve 4 yaprak içinde olmayan sızmış alan işaret ederken oklar 1 ve 3 sızmış alanı belirtir. (E), A. thaliana sarı floresan protein (YFP) ve (F) infiltrasyon, aşağıdaki azalmış YFP floresan ifade bırakır<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (molar oranı 2; 9 saat). (G) sarı floresan protein (YFP) ve (H) (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu ile azalmış YFP floresan Aşağıdaki infiltrasyon ifade eden transjenik kavak yaprakları (mol oranı 2; 12 saat). Yayınlanmış kaynaklardan 21,23,24,26 izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Şekil 4:-DNA Peptide-(N / P) Oran ve Kompleksleri Biyofizik Özellikleri Üzerine Etkisi Varyasyon. DNA oranı peptidi artan peptit bazlı formülasyonlar da Zeta potansiyeli değerleri geçiş sırasında negatiften pozitife boyutu azalır./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tablo 1: Karakterizasyonu ve çeşitli peptid bazlı formülasyonlarının değerlendirilmesi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tablo 2: Bozulmamış Bitkiler için Peptit tabanlı ve diğer Mevcut DNA Teslim Teknolojileri Karşılaştırılması. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants at JoVE.com

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Görüntüleme.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biyokimya

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Kimya

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biyoloji

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Doğrudan İnfüzyon Cihazı Kullanılarak Bitkilerde Molekül Verilmesi

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

Yazar Spotlight: Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler