The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

참고 : 다음 프로토콜에 대한 바이오 안전성 수준 (BSL)은 잠재적 인 유행성 독감 바이러스에 대한 계절 인플루엔자 바이러스 및 BSL 3+위한 BSL 2입니다. 바이러스 적정 바이러스 제어 (VC)의 바이러스 농도를 결정하기 위해 중화 실험에 앞서 요구된다. 1. 바이러스 적정 주 : (1) 바이러스 희석 행 또는 열 (도 1) 중 하나를 따라 배치 될 수 바이러스의 수와 중복 수에 따라이 잘 플레이트는 다음의 유연성으로 설정 될 수있다. 각각의 바이러스는 별도의 행 / 열을 차지한다. (2) 바이러스 희석 증가는 유연하지만, 왼쪽 상단에서 가장 높은 바이러스 농도로 시작한다. (3)의 중복의 개수에는 제한이 없다. 참고 : Madin 다비 개 신장 (MDCK) 및 MDCK-SIAT1 (SIAT) 세포는 친절 박사 M. Matrosovich, 마르부르크, 게르에 의해 제공되었다10 많은. SIAT 세포는 안정적으로 인간의 CMP-N-acetylneuraminate로 형질 MDCK 세포이다 : 시알 산 (SA)의 강화 된 표현을위한 β - 갈 락토의 α-2,6- 시알 산 전이 효소 유전자 α2-6Gal 종료 올리고당. <ol><li> 분취 충분한 MDCK 세포 또는 MDCK 세포 SIAT-8 96 웰 플레이트에 (/ 웰 200 μL). 합류점에 도달하는 2 또는 3 일 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FCS) 및 항생제 (100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의)이 보충 된 DMEM에서 세포를 전파. 5 % CO 2 및 1 ㎎ / ㎖의 G418 설페이트 37 ° C에서 SIAT 세포를 인큐베이션. 주 : 희석 배수 경험과 사용 된 세포주에 따라 달라집니다. 세포 단층은 컨 플루 언트해야합니다 (즉, 아니 세포 벽 또는 MDCK 세포와 MDCK-SIAT1 세포 단단히 포장 레이아웃을 볼 수 개요) 바이러스 접종시. 희석액의 예에 기초MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화는 표 1에 제시되어있다. </li><li> 물론 당 바이러스 성장 매체 (VGM) 200 μL와 세포를 3 회 반복한다. 30 분 동안 70 % EtOH로 다중 벽 플레이트 세척 소독 후 세척 전에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 또는 VGM에 린스. </li><li> VGM을 대기음 즉시 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. </li><li> (테스트 바이러스 및 중복의 수에 따라 이하) 6 멸균 튜브에 각각 VGM의 900 μl를 추가합니다. 각 희석 사이의 팁을 변경, 희석 직렬, 제 1 튜브에 바이러스의 100 μl를 피펫 잘 혼합합니다. 각각의 바이러스에 대해 반복하는 것이 적정합니다. 참고 :이 10-6로 10-1의 바이러스 희석을 줄 것이다. </li><li> 가장 높은 희석에서 시작하여, 각각의 바이러스 희석의 50 μl를 추가 9의 중복 우물 (그림 1의 열 9, 10) 내지 (그림 1의 1 × 10-5)6 웰 플레이트. </li><li> 바이러스는 세포를 감염시킬 수 2-3 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 놓는다. 참고 : 2 ~ 3 시간 배양은 접종에서 바이러스가 단일 층에 도달 할 수있는 충분한 시간이 있는지 확인하는 것이 필요하다. </li><li> 오버레이를 준비 (10 ㎖ / 판) 참고 : 오버레이 2 배 DMEM, 트립신 (2 μg의 / ml의 최종 농도), (20) 1 ㎎ / ㎖ 주식의 μL, 셀룰로오스 코튼 린터 5 ㎖ (재료 목록 참조) 5 ㎖로 구성되어 있습니다. </li><li> 접종을 제거합니다. </li><li> 오버레이 (각 웰에 200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 밤새 품어. 주 : 바이러스 발아 후 약 4 시간 일어난다 그래서 플레이트가이 시간 이후에 방해되지 않는 것이 중요하다. </li><li> 우물에서 오버레이를 대기음. </li><li> PBS (A)에 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드를 추가 (200 μL / 웰). 30 분 동안 또는 20 분 동안 실온에서 4 ° C에서 그들을 놓는다. 참고 : PBS A는 10 이동과 자연의 pH 인산 완충 식염수입니다F의 NaCl, 0.25 g의 KCl, 나 2 HPO 4 1.437 g, KH 2 PO 4, 0.25 g, 증류수 1 L (재료 목록 참조). 참고 : 흡입 및 삼키면 화상을 입을 수 있습니다 때 파라 포름 알데히드는 유해하다. 이 발암 성 영향이 제한된 증거도이며, 피부 접촉 후 과민성을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 파라 포름 알데히드를 기음과 PBS A를 두 번 접시를 씻어 (200 μL / 웰). </li><li> 향후 사용을 위해 4 ° C에서 PBS A의 판을 보관하거나 다음 단계를 계속한다. </li><li> permeabilization 버퍼를 추가 (100 μL / 웰). 30 분 동안 실온에서 그것을 둡니다. </li><li> PBS A를 두 번 접시를 씻으 (200 μL / 웰). </li><li> 물론 당 (ELISA 버퍼 1,000 1) 첫 번째 항체의 50 μL, 인플루엔자 A 형에 대한 마우스 단클론 항체를 추가합니다. 진탕, 1 시간 (또는 4 ℃로 하룻밤) 실온에서 그것을 품어. </li><li> 세척 완충액 (0.05 % 트윈 80 PBS A, V / V IN) 페이지 100 ㎕에 3 회 반복한다잘 어. 세척과 5 분 동안 실온에서 인큐베이션을. 또는, 잘 300 μl를 사용하여 배양하지 않고 3 회 씻는다. </li><li> 두 번째 항체의 50 μl를 추가, 염소 항 - 마우스 IgG (H + 1) HRP 접합체 (1 : ELISA 버퍼 1,000), 당 잘. 진탕하면서, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여. </li><li> 단계 1.17에 설명 된대로 3 회 반복한다. </li><li> 기판 (50 μL / 웰)를 추가합니다. 30 분 동안 또는 청색의 발색 분명히 보일 때까지 상온에서이를 부화. </li><li> 세척 사이 2-3 분 동안 실온에서 배양하고, 반응을 정지 웰 당 증류수 200 μL 회 플레이트를 세척한다. </li><li> 접시를 공기 - 건조하고 어두운 장소 (예를 들면, 알루미늄 호일에 포장)에 저장합니다. </li></ol> 2. 적정 정량 <ol><li> 도 2a에 도시 된 바와 같이, 플랫 베드 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓는다. 의 L 자형의 위치 제한을 사용최적의 및 반복적 인 영상 위치를 확인합니다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. </li><li> 이미지를 스캔합니다. 참고 :이 설정은 표 2에 나타내었다. </li><li> 필요한 바이러스 농도 (그림 3)을 계산하기 위해 &quot;Wellplate 리더&quot;소프트웨어를 실행합니다. <ol><li> 이미지를로드하려면 &quot;이미지로드&quot;버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 &quot;글로벌 임계 값&quot;탭의 막대 그래프에서 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 이미지에 미치는 영향을 조사하기 위해 &quot;업데이트&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 &quot;샘플링&quot;버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 &quot;저장&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, &quot;중화 및 적정 계산&quot;이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. </li><li>부하 또는 입력 잘 플레이트 정의지도. &quot;최적의 바이러스 인구 (%) 적정&quot;의 임계 값 (예 : 30 %)을 나타냅니다. 적정 결과를 계산하기 위해 &quot;적정 프로세스&quot;탭을 선택합니다. 적정 결과를 확인합니다. 적정 결과를 저장하기 위해 &quot;저장 후 닫기 &#39;버튼을 클릭합니다. 주 : 소프트웨어에 대한 자세한 설명서에 대한 보충 S1을 참조하십시오. 주문 된 소프트웨어의 사본은 요청에 따라 사용할 수 있습니다. 참고 : 일반적으로, 각 웰 (11)에서 50 % (20-85%) 총 세포의 ICP 주위에 플라크 감소 분석 수익률에 가장 적합한 바이러스 희석. </li></ol></li></ol> 3. 바이러스 중화 주 : 중화 분석에 필요한 판의 수를 계산한다. 각 플레이트 한 바이러스 및 항혈청들을 수용 할 수있다. 주 : 항혈청의 개수 및 중복 수에 따라 웰 플레이트 번째로 설정 될 수있다예 다음은 유연성 (1) 혈청 희석 하나의 행 또는 열 (도 4)을 따라 배치 될 수있다. 각 혈청은 별도의 행이나 열을 차지한다. (2) 혈청 희석의 증가는 유연하지만 플레이트의 좌측 상단에 최고 혈중 농도로 시작한다. (3)의 중복 횟수는 항혈청의 수가 균형. 더 많은 중복 실험적인 변화를 부드럽게하는 데 도움이 될 수 있습니다. (4) VC의 수와 셀 제어 (CC) 중복 유연하지만, 또한 별도의 행 또는 열이어야 수. VC 중복 수가 항혈청보다 훨씬 큰 것으로 예상된다. <ol><li> 에서 미리 1.1-1.3, 2, 3 일 단계로, 세포 단층을 준비한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 VGM의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각각 VC와 CC에 대한 열 11, 12을 사용합니다. 콜럼의 첫 번째 행 (A) 1:20 수용체 파괴 효소 (RDE) 처리 된 혈청 50 ㎕를 분취 추가NS 1-10. 주 : 각 바이러스 혈청 조합의 경우, 분석은 이중으로 수행되기 때문에, 하나의 플레이트는, 예를 들어, 바이러스가 다섯 항혈청에 대해 테스트를 포함 할 수있다. </li><li> 행 H.에서 50 μl를 (그림 4 열 1 ~ 10) H를 행에 행 A로부터 50 μl를 전송 및 폐기함으로써 연속 희석을 2 배 수행 </li><li> 공통 열 (그림 4 열 12)의 각 웰에 희석 50 μl를 추가합니다. </li><li> 공통 열을 제외하고, 플레이트의 각 웰에 바이러스의 50 μl를 추가합니다 (열 1-11, 그림 4의 행 AH)를. </li><li> 2-3 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션. 접종을 제거합니다. 물론 각 오버레이 (200 μL)를 추가합니다. 방해받지 않고, 37 ° C에서 하룻밤을 품어. 수정 및 바이러스 적정 (1.11-1.22 단계)에 관해서 판을 얼룩. </li></ol> 4. 중화 정량화 <ol><li> Figu 같이 평판 스캐너의 스캔 영역에서 웰 플레이트를 놓고2A 다시. 최적하고 반복 촬상 위치를 확인하기 위해 L 자 형상의 위치 제한을 사용한다. 참고 : 하나의 스캔 이미지이 잘 접시에 가능하다. </li><li> 단계 2.2에 설명 된대로 판을 스캔합니다. </li><li> 필요한 바이러스 역가 (그림 3 단계 2.3)를 계산하기 위해 &quot;Wellplate 리더&quot;소프트웨어를 실행합니다. <ol><li> 이미지를로드하려면 &quot;이미지로드&quot;버튼을 클릭합니다. 샘플링 임계 값을 조정하는 &quot;글로벌 임계 값&quot;의 빨간색 막대를 밀어 넣습니다. 효과를 검토하기 위해 &quot;업데이트&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자을 선택합니다. 유도 결합 플라스마를 정량화 할 수있는 &quot;샘플링&quot;버튼을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 샘플링 결과를 저장하기 위해 &quot;저장&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : &quot;계산 중화 / 적정&quot;상자가 체크되어있는 경우 샘플링 과정 후, &quot;중화 및 적정 계산&quot;이라는 새로운 창이 자동으로 나타납니다. </li><li> 잘 페이지로드 또는 입력늦은지도. 의 임계 값 (예를 들어, 50 %)를 나타냅니다 &quot;중화 :. 감염 공제 (%)를&quot; </li><li> 역가를 계산하기 위해 &quot;중화 프로세스&quot;를 선택합니다. 역가를 확인하고 중화 결과를 저장하기 위해 &quot;저장 후 닫기 &#39;버튼을 클릭합니다. 주 : 중화는 VC 대하여 소정 ICP 환원 (예컨대 50 % 나 80 % 등) (도 4의 열 (11)의 평균)과 혈청의 한 최고 희석액의 역수로서보고된다. 50 % ICP 감소는 대표적인 결과를 사용 하였다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

본 연구에서는 바이러스 항원 간의 실제 관계를 정량화하는 촬상 계 MN 분석을 설명했다. 다른 플라크 감소 분석과 비교하면,이 방법은 감염 인구의 완전한 커버리지를 보장 전체 웰의 ICP 측정 강조한다. 플라크 형성의 독립성은 주로 보이지 않는 작은 플라크를 형성 할 수 있거나 단지 하나의 세포 감염을 관리 할 수있는 바이러스 분석의 어플리케이션을 넓힌다. 따라서, 분석은 더욱 바이러스 및 HI 항체가보다 넓은 범위의 효과를 조사 할 수 있고, 이는 더 포괄적 유사성 또는 바이러스 항원 (12) 사이의 차이를 반영하도록 돕는다. 예를 들어, 오셀 카르 복실 레이트가 포함하면, MN의 분석은 이하 더 정확하게 항원 차이를 반영 결합 NA 의존성에 의해 영향을 받는다. 분석의 개발 과정에서 많은 노력 실험 일관성, 속도 및 검출을 향상시키기 위해 이루어졌다감도 평판 스캐너 높은 처리량 정량화 적정 이미징을 통해 입력 된 바이러스를 제어하는 ​​것을 포함하고, 사용자 친화적 인 데이터 프로세싱 플랫폼을 구현. 결과는 일반적으로 일치 있었고, HI의 사람들을 확인했다. 특히,이 결과는 또한 특정 A (H1N1) pdm09 바이러스 HA1에 G155E 교체 등 배양 선택하거나 산발적 변화에 의한 최근 A 형 및 B 백신 바이러스 항원 드리프트 변종 간의 항원 차이뿐만 아니라, 항원 성 변화를 보여 12. 프로토콜은 크게 영상 신호를 강화 강한 감염 준 세포주의 선택과 바이러스 타입 또는 서브 타입을 매칭. 실험적 변이를 시험 항혈청의 개수와 균형 중복 설계 평활화 하였다. 불확실성은 주로 화상 형성 장치에 의해 영향을 받는다 화질로부터 올 수있다. 점잖은 컬러 플랫 베드 스캐너는 유의 수ficantly 이미지 대비를 개선하고 소음을 줄일 수 있습니다. 바이러스가 계속 동일한 상태를 유지하면서 중화에 입력 된 바이러스의 양을 정량적으로 대응하는 적정에서 미리 결정되어야한다. 중화하는 동안 감염에 대한 항혈청 반응의 기준 바이러스 (VC)과 배경 레벨 (CC)의 차이점에 대해 정규화된다. VC 및 CC의 정확한 측정은 중화 실험에 필수적이다. 더 많은 중복 (팔 중복이 대표 결과에 사용 된)을 권장합니다. 마지막으로, 소프트웨어를 이해하는 것이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 이 소프트웨어는 2 년 이상에 대한 WHO 인플루엔자 센터, 영국에서 일상적인 바이러스 특성에 대해 테스트되었습니다. 다양한 상황 처리에 대한 자세한 설명은 보충 S1에 제공됩니다. MN이 분석은 시료가 EXT 커버 용도에 적합remely 큰 시야 만은 적당한 이미지 해상도를 필요로한다. 낮은 비용과 간단한 설치는 대부분의 바이러스학 실험실에 시스템을 쉽게 사용할 수 있도록. 동일한 시료의 측정치의 변화는 대략 11 스캔 중에 도입 된 불확실성을 정의 3 % 미만이었다. 이러한 재현성 많은 바이러스 학적 연구에 충분하며, 상기 복수의 스캔 이미지를 평균함으로써 감소 될 수있다. 결론적으로, 본 연구는 통상적으로 항원 성 연구에 사용될 수 있으며, 특히 인간의 인플루엔자 백신에 포함 바이러스 반기 선택할 인플루엔자 바이러스를 현재 순환의 상세한 분석의 HI 데이터를 지원하는 강력한 MN 분석을 보여준다.

마이크로 중화 (MN) 분석은 중화 항체의 정량과 항 바이러스 활동 바이러스학에 사용됩니다. 혈구 응집 억제의 대안으로 (HI) 분석, MN의 분석은 HI의 해석은 1,2,3 결과 복잡하게 수용체 결합 인플루엔자 바이러스에의 선호도 변화에 의해 영향을 비 항원 효과를 극복 할 수있다. 최근까지 대부분의 MN의 분석은 세포 변성 효과 (CPE) 또는 효소 면역 분석법 (ELISA) 4,5 기반으로했다. 초점과 플라크 감소에 따라 MN 분석 1990 년 6,7,8 개발되었다. 플라크 감소 분석은 감염을 정량화 볼 수 플라크를 계산에 의존하고 있습니다. 그러나, 시각 카운트는 플라크의 대부분이 작은 많은 현재의 순환 바이러스에 대한 눈에 보이지는 않지만 인간의 눈으로 확인할 수있는 큰 플라크를 다룹니다. 이 불완전한 정보에 따르면 내가 선도, 심사관들과 실험 사이에 상당한 변화를 일으킬 수 있습니다ncomparable 결과. 또한 일부 바이러스는 단일 세포 또는 매우 작은 플라크 불현성 감염을 표시 할 때 방법을 사용하는 것도 불가능하다. 가난한 계수 해상도 이미징 기반 프로토콜을 도입함으로써 개선 될 수있다. 기술, 광학 현미경 및 높은 처리량의 발전과 함께 잘 플레이트 리더는 감염된 세포 구를 계산하는 정확한 방법을 제공 할 수 있습니다. 트랜스 조명 현미경, 특정 마커 태그 감염된 세포는 서브 세포 해상도에서의 흡수 또는 형광 대조적으로 시각화 할 수있다. 시료 후 컴퓨터 화면에서 분석 될 수있다. 불행히도 인해 시야의 제한으로 100 개 이상의 타일 이미지는 하나의 웰을 포함해야한다. 96 웰 플레이트로 분석하면 약 만 화상의 화상 처리를 필요로한다. 이러한 힘든 과정은 시간이 걸리고 비싸다하고 얻은 해상도는 장군에바이러스 감염의 일상적인 특성에 대한 불필요한 리터. 제한된 예산 연구소는 평판 스캐너 중심으로 구축 접근 방식은 비용 효과, 높은 처리량 대안을 제공하는 것을 알 수 있습니다. 본 논문에서는 바이러스의 많은 수의 항원 특성에 대한 정량적 항 바이러스 활동 및 중화 항체를 측정하기에 적합한 개선 된 플라크 감소 MN 분석에 대해 설명합니다. 분석은 여러 가지 장점이있다 : 첫째, 상관없이 플라크 크기, 세포 수준에서 바이러스 감염을 측정 할 수있는 영상 기반 분석법이다. 잘 내 총 감염된 세포 집단 (ICP)를 계산하는 것은 대단히 가능한 낮은 감염으로 바이러스를 특성화 할 수있게, 검출 감도를 증가시킨다. 둘째,보다 정확한 정량 적정 입력 된 바이러스의 양을 결정하기 위해 중화하기 전에 도입된다. 정량적 입력 바이러스는 상당히 감소 바리다른 실험 사이 기는 실험실의 결과는 더 비교할 수 있습니다. 셋째, 중화 역가를 이미지 분석을 빠르게 정량을 사용자 친화적하여 결정될 수있다. 마지막으로, 프로토콜은 필요한 해상도와 정확도를 비용 효율적이고 높은 쓰루풋의 대안을 제공한다. 정량은 평판 스캐너 무료 데이터 처리 소프트웨어를 기반으로합니다. 전체 설치는 작은 풋 프린트를 가지고 있으며, 대부분의 실험실에서 배포합니다. 이 논문에 제시된 프로토콜은 바이러스 적정, 적정 정량, 바이러스 중화, 중화 정량 등 4 개 주요 단계로 구성되어 있습니다. 바이러스 적정 입력 된 바이러스의 양이 중화에 사용하는 결정 제제 실험이다. 적정 기간 동안, 바이러스 농도의 숫자가 96 웰 플레이트에서 세포 단층에 적용된다. 감염된 세포는 다음 섹션 2. 바이러스 dilu에 정량된다20 %에게 -85 %를 생산 능은 ICP 차례에 대응하는 중화에 입력 바이러스와 같은 적용 섹션 3. 중화 프로토콜의 역가가 섹션을 위의 프로토콜이 대표 결과에 제시되어 다음 4. 실험을 사용하여 정량한다. 분석은 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 형 바이러스와 같은 현재의 순환 인플루엔자 바이러스의 대부분과 함께 지난 2 년 동안 철저하게 테스트되었습니다. 인플루엔자 바이러스의 특성 분석의 결과는 2016 년 남반구와 2016에서 2017 사이에 북반구에 사용되는 인플루엔자 백신에 대한 권장 사항을 준 WHO 상담 회의의 보고서에 포함되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

위의 절차에 따라, 우리는 최근의 항원 특성 실험에서 어떤 결과를 제시한다. 적정 설치는 각각의 희석에 대한 이중 중복으로, 8 개의 입력 바이러스를 검사하도록 설계되었습니다. 바이러스 희석 바이러스의 변형을 다루 -6 1.0 × -1 10 × 1.0 내지 1.0 시험 하였다. 테스트 바이러스는 A / 카메룬 / 15V-2,015분의 3,538을 포함하여 H3N2 아형, 출신 A / 블라디보스톡 / / 2015 (36), A / 모스크바 / A / 톰 스크 / 5 / 2015 / A / 모스크바 / 2,015분의 101 (103) / 2015 A / 모스크바 / / 2015 (100), A / 모스크바 / / 2015 (133), 및 A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437. 적정 결과를도 5에 도시되어있다. 도 5d는 바이러스 희석 증가를 ICP의 감소를 보여준다. 곡선이 잘 (12) 내의 모든 세포에서 감염을 굴복 같은 바이러스를 ICP에 대해 정규화 된 (ICP 포화로 정의). 유도 결합 플라스마는 인사와 함께 포화에 도달하지 않은 경우ghest 바이러스 농도는, 대응하는 중복의 ICP 평균 대신 사용되었다 (A / 모스크바 / / 2015 103도 5D에서). ICP 포화도의 30 %를 생산하는 바이러스 희석 중화 (표 3)에 대한 입력의 바이러스 희석으로 선택 하였다. 중화 각 접시에 두 번 중복으로 다섯 항혈청에 대해 하나의 입력 바이러스가하는 것을 목표로. 표시 기준 바이러스는 H3N2 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 다섯 항혈청은 A / HK 14분의 4,801 계란 F12 / 15, A / HK 14분의 7,295 MDCK의 F02 / 15, A / 남아프리카 공화국 R2665 / 15 SIAT의 F50 / 15, A / 스위스 13분의 9,715,923 SIAT NIBF의 F18 / 15, 및 A / 네덜란드 14분의 525의 SIAT F23 / 15. 중화 결과는도 6에 도시되어있다. 그림 6D는 혈청 희석의 증가와 감염의 진행 상황을 보여줍니다. 수직축 정규화 양 인구 평균 ICP 대하여 해당 항혈청 응답으로부터 ICP와의 비를 나타낸다기준 (12)의 바이러스. 감염되지 않은 세포 컨트롤에서 배경 ICP는 정상화시 차감되었습니다. 중화 역가는 50 % ICP 감소 (표 4)에 대응하는 항혈청 희석액의 역수로서 결정 하였다. 선형 보간은 두 개의 인접한 혈청 희석액 사이 떨어지는 역가를 추정하는데 사용 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> 그림 1 : 바이러스 적정 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 테스트 바이러스는 별도의 행 (H에 A)에 할당됩니다. 열은 다른 바이러스 성 희석 (12-1)을 위해 설계되었습니다. 두 열은 각각의 바이러스 희석 중복 사용 하였다. 스케일 바 = 10 mm이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 2 : 샘플 스캐닝 시스템의 회로도. (a)는 플랫 베드 스캐너의 촬상 위치에있는 96 웰 플레이트 (로부터 재발행 엘스 비어 BV 허가) 11를 참조하고, (b)에 도시하는 L 자형 리미트 치수 (a). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> 그림 3 : &quot;Wellplate 리더&quot;정량 소프트웨어의 바탕 화면도. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> 그림 4 : 중화 실험에서 잘 플레이트 설치의 예. 각 항혈청은 중복 (10-1)와 함께 두 개의 열이 할당됩니다. 행은 다른 혈청 희석 (H에 A)을 위해 설계되었습니다. 바이러스 제어 팔 중복 (H11에 A11)와, 열 (11)을합니다. 셀 제어 여덟 중복 (H12에 A12)와 칼럼 (12)이다. 스케일 바 = 10 mm이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> 그림 5 : 적정 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 셋업, (b)는 웰 플레이트 이미지를 검색 (c) 그림컬러 인코딩, 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단 및 바이러스 희석액에 대해 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단. 30 %는 ICP 임계치로 사용 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> 그림 6 : 중화 실험의 결과. (a) 웰 플레이트 설정, (b) 웰 플레이트 화상의 정량, 바이러스에 감염된 세포 집단의 (c) 그림과 혈청 희석액에 대한 (d) 표준화 바이러스 감염된 세포 집단 스캔. 입력 VIRUS (VC)은 A / 스톡홀름 / 2,015분의 63입니다. 50 % ICP의 역가를 산출 하였다. (d) 상기 에러 막대 샘플 중복 (± 1 SD)로부터 표준 편차 (SD)이다. (b)와 (c)에서의 스케일 바는 10mm를 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 S1 : <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> 일반적인 희석 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK 세포 </td><td> MDCK-SIAT1 세포 </td></tr><tr><td> 이일 </td><td> 1 : 5 (1 + 4) </td><td> 1시 10분 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 일 </td&gt; <td> 1시 10분 (1 + 9) </td><td> 1시 20분 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> ml의 당 세포의 전형적인 수 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK 세포 </td><td> MDCK-SIAT1 세포 </td></tr><tr><td> 이일 </td><td> 2 × 10 5 </td><td> 1 × 10 (5) </td></tr><tr><td> 3 일 </td><td> 1 × 10 (5) </td><td> 5 × 10 (4) </td></tr></tbody></table> 표 1 : MDCK 또는 MDCK-SIAT1 세포의 합류 플라스크의 하위 문화에 전형적인 희석. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 방법 </td><td> 전문가 모드 </td></tr><tr><td> 문서 유형 </td><td> 필름 (필름 지역 가이드와 함께) </td></tr><tr><td> 자동 노출 유형 </td><td> 사진 </td></tr><tr><td> 임세 유형 </td><td> 24 비트 컬러 </td></tr><tr><td> 해결 </td><td> 1,200 dpi의 </td></tr><tr><td> 저장된 이미지 형식 </td><td> 사소한 말다툼 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 평판 스캐너의 표준 설치. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 열 </td><td> 바이러스 </td><td> 권장 희석 </td></tr><tr><td> 에이 </td><td> A / 카메론 / 15V-2,016분의 3,538 </td><td> 1.0 × 10 -2 </td></tr><tr><td> 비 </td><td> A / 블라디보스톡 / 2,015분의 36 </td><td> 1.0 × 10 -3 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 103 </td><td> 1.1 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> A / 톰 스크 / 2천15분의 5 </td><td> 5.9 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 101 </td><td> 8.3 × 10 -1 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 100 </td><td> 1.4 × 10 -2 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> A / 모스크바 / 2,015분의 133 </td><td> 1.3 × 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / 브라 티 슬라바 / 2,015분의 437 </td><td> 1.3 × 10 -4 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 30 % ICP의 인구에서 계산 된 바이러스 희석. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 기둥 </td><td> 항혈청 </td><td> 추천 역가 </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> (110) </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / 남아프리카 공화국 / R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / 스위스 / 2,013분의 9,715,293 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / 네덜란드 / 2,014분의 525 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> 표 4 : A / 스톡홀름의 50 % ICP / 항혈청에 대한 2천15분의 63에서 역가.

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Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

이 연구는 설명 영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K 조회수.  The Francis Crick Institute.  이 연구는 설명 영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다. 

비디오: Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...