The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

NOTA: El nivel de bioseguridad (BSL) para el siguiente protocolo es BSL 2 para los virus de la gripe estacional y BSL 3+ para los virus de influenza pandémica potenciales. se requiere la titulación viral antes de un experimento de neutralización para decidir la concentración viral del control viral (VC). Titulación 1. Virus NOTA: En función del número de virus y el número de duplicados, una placa se puede configurar con los siguientes flexibilidades: (1) La dilución viral puede ser arreglado a lo largo de las filas o las columnas (Figura 1). Cada virus debe ocupar una fila / columna separada. (2) El incremento de la dilución viral es flexible, pero debe comenzar con la más alta concentración viral en la esquina superior izquierda. (3) No hay ninguna restricción sobre el número de duplicados. NOTA: Madin Darby de riñón canino (MDCK) y MDCK-SIAT1 células (SIAT) fueron amablemente proporcionados por el Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germuchos 10. células SIAT son células MDCK transfectadas de forma estable con el CMP-N-acetilneuraminato humano: gen de la ß-galactósido α-2,6-sialiltransferasa para una mayor expresión de ácido siálico (SA) oligosacáridos α2-6Gal terminados en. <ol><li> Células alícuotas suficientes MDCK o células MDCK-SIAT 8 en placas de 96 pocillos (200 l / pocillo). Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 o 3 días para llegar a la confluencia. Propagar las células en DMEM suplementado con suero inactivado por calor al 10% de ternera fetal (FCS) y antibióticos (100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). Se incuban las células SIAT a 37 ° C con 5% de CO 2 y 1 mg / ml de sulfato de G418. NOTA: El factor de dilución depende de la experiencia y la línea celular utilizada. La monocapa de células debe ser confluente (es decir, no de la pared celular o en un esquema visible para las células MDCK y una disposición apretada-para las células MDCK-SIAT1) en el momento de la inoculación del virus. Ejemplos de diluciones basan enla subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1 se dan en la Tabla 1. </li><li> Lavar las células 3 veces con 200 l de medio de crecimiento del virus (VGM) por pocillo. Esterilizar el lavador de placas de paredes múltiples con 70% de EtOH durante 30 minutos, y luego enjuague en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o VGM antes del lavado. </li><li> Aspirar el VGM y añadir inmediatamente 50 l de VGM a cada pocillo. </li><li> Añadir 900 l de VGM a cada uno de 6 tubos estériles (o menos, dependiendo del número de los virus de prueba y los duplicados). Pipetear 100 l de virus en el primer tubo, mezclar bien y diluir en serie, cambiando la punta entre cada dilución. Repita este procedimiento para cada virus a titular. NOTA: Esto le dará a diluciones de virus de 10 -1 a 10 -6. </li><li> Añadir 50 l de cada dilución de virus, a partir de la dilución más alta (1 x 10 -5 en la Figura 1), a los pocillos duplicados (columnas 9 y 10 en la figura 1) de un 9placa de 6 pocillos. </li><li> Coloque la placa a 37 ° C durante 2-3 horas para permitir que el virus infecte a las células. NOTA: una incubación de 2 a 3 horas es necesario para asegurar que los virus en el inóculo tienen tiempo suficiente para llegar a la monocapa. </li><li> Preparar la superposición (10 ml / placa) NOTA: La superposición consiste en 5 ml de DMEM 2x, tripsina (2 mg / ml de concentración final), 20 l de 1 mg / ml, social y 5 ml de borra de algodón de celulosa (véase la Lista de Materiales). </li><li> Retire el inóculo. </li><li> Añadir la superposición (200 l a cada pocillo). Incubar toda la noche a 37 ° C, sin ser molestado. NOTA: La gemación de virus se lleva a cabo después de aproximadamente 4 horas, lo que es importante que la placa no se altera después de este tiempo. </li><li> Aspirar la superposición de los pozos. </li><li> Añadir enfriado en hielo 4% de paraformaldehído en PBS A (200 l / pocillo). Colocarlos en 4 ° C durante 30 min o a temperatura ambiente durante 20 min. NOTA: PBS-A es el pH natural de solución salina tamponada con fosfato con 10 gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na 2 HPO 4, 0,25 g de KH 2 PO 4, y 1 litro de agua destilada (véase la Lista de Materiales). NOTA: El paraformaldehído es nocivo si se inhala y puede causar quemaduras si se ingiere. También hay evidencia limitada de un efecto carcinógeno, y puede causar sensibilización tras el contacto con la piel. </li><li> Aspirar el paraformaldehído y se lavan las placas dos veces con PBS A (200 l / pocillo). </li><li> Almacenar las placas en PBS A a 4 ° C para su uso futuro, o continuar con los pasos siguientes. </li><li> Añadir tampón de permeabilización (100 l / pocillo). Dejarlo a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar la placa dos veces con PBS A (200 l / pocillo). </li><li> Añadir 50 l de la primera anticuerpo, MAb de ratón contra la gripe de tipo A (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 4 ° C durante la noche), con agitación. </li><li> Lavar 3 veces en 100 l de tampón de lavado (0,05% de Tween 80 en PBS A, v / v) per bien. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min entre lavados. Como alternativa, se lava 3 veces sin incubación usando 300 l por pocillo. </li><li> Añadir 50 l de la segunda anticuerpo, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H + L) conjugado con HRP (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, con agitación. </li><li> Lavar 3 veces como se describe en el paso 1.17. </li><li> Añadir el sustrato (50 l / pocillo). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min o hasta que el desarrollo de un color azul es claramente visible. </li><li> Para detener la reacción, se lava la placa dos veces con 200 l de agua destilada por pocillo, incubando a temperatura ambiente durante 2 -3 min entre los lavados. </li><li> El aire seco de la placa y la almacena en un lugar oscuro (por ejemplo, envolver en papel de aluminio). </li></ol> 2. Cuantificación de titulación <ol><li> Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figura 2a. Utilice el límite de posición en forma de L deasegurar una ubicación óptima y repetible de imágenes. NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración. </li><li> Escanear una imagen. NOTA: Los ajustes se muestran en la Tabla 2. </li><li> Ejecutar el software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular la concentración de virus requerida (Figura 3). <ol><li> Haga clic en el botón &quot;Cargar imagen&quot; para cargar una imagen. Deslice la barra roja en el histograma de la pestaña &quot;Umbral Global&quot; para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón &quot;Actualizar&quot; para examinar el efecto en la imagen. </li><li> Marque la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot;. Haga clic en el botón de &quot;muestreo&quot; para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón &quot;Guardar&quot; para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite. NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada &quot;Neutralización y volumetría de cálculo&quot; aparece automáticamente si la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot; está marcada. </li><li>La carga o la entrada de la definición del mapa de placa de pocillos. Indicar el umbral (por ejemplo, 30%) en &quot;Titulación: población de virus óptima (%)&quot;. Seleccione la pestaña &quot;Proceso de Titulación&quot; para calcular los resultados de la titulación. Compruebe los resultados de la titulación. Haga clic en el botón &quot;Guardar y Cerrar&quot; para guardar los resultados de la titulación. NOTA: Consulte la S1 para la instrucción más detallada sobre el software. Una copia del software a medida, disponible bajo petición. NOTA: Por lo general, la dilución de virus para mejor el rendimiento del ensayo de reducción de placa alrededor de un 50% (20-85%) ICP del total de células dentro de cada pocillo 11. </li></ol></li></ol> La neutralización 3. Virus NOTA: Calcular el número de placas necesarias para el ensayo de neutralización. Cada placa puede acomodar un virus y un número de antisueros. NOTA: En función del número de antisueros y el número de duplicados, una placa se puede configurar con la famie siguiente flexibilidades: (1) La dilución de suero se pueden disponer a lo largo de la fila o la columna (Figura 4). Cada suero debe ocupar una fila o columna separada. (2) El incremento de la dilución del suero es flexible, pero debe comenzar con la concentración más alta de suero en la esquina superior izquierda de una placa. (3) El número de duplicados equilibra el número de antisueros. Más duplicados pueden ayudar a suavizar las variaciones experimentales. (4) El número de la VC y el número del control celular (CC) duplicados son flexibles, pero también deben estar en filas o columnas separadas. Se espera que el número de duplicados VC es significativamente mayor que la de los antisueros. <ol><li> Preparar la monocapa de células, como en los pasos 1.1-1.3, 2 o 3 días de antelación. </li><li> Añadir 50 l de VGM a cada pocillo de la placa. </li><li> Utilice las columnas 11 y 12 para VC y CC, respectivamente. Añadir 50 l de alícuotas de 01:20 enzima destructora del receptor (RDE) de suero tratado con a la primera fila (A) de Columns 1-10. NOTA: Para cada combinación de virus y el suero, el ensayo se realizó por duplicado, por lo que una placa puede, por ejemplo, contener probado un virus contra cinco antisueros. </li><li> Realizar 2 veces diluciones seriadas mediante la transferencia de 50 l de la fila A a la fila H (columnas 1-10 en la figura 4) y descartando 50 l de la fila H. </li><li> Añadir 50 l de diluyente a cada pocillo de la columna de la CC (columna 12 en la Figura 4). </li><li> Añadir 50 l de virus a cada pocillo de la placa, a excepción de la columna de la CC (columnas 1-11, filas AH en la Figura 4). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2-3 horas. Retire el inóculo. Añadir la superposición (200 l) a cada pocillo. Incubar durante la noche a 37 ° C, sin ser molestado. Fijar y teñir las placas en cuanto a la titulación del virus (pasos 1.11 a 1.22). </li></ol> 4. Neutralización Cuantificación <ol><li> Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figure 2a. Utilice el límite de posición en forma de L para asegurar una ubicación óptima de imagen y repetible. NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración. </li><li> Analiza la placa, como se describe en el paso 2.2. </li><li> Ejecutar el software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular los títulos virales requeridos (figura 3, paso 2.3). <ol><li> Haga clic en el botón &quot;Cargar imagen&quot; para cargar una imagen. Deslice la barra roja en &quot;Umbral Global&quot; para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón &quot;Actualizar&quot; para examinar el efecto. </li><li> Marque la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot;. Haga clic en el botón de &quot;muestreo&quot; para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón &quot;Guardar&quot; para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite. NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada &quot;Neutralización y volumetría de cálculo&quot; aparece automáticamente si la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot; está marcada. </li><li> De carga o la entrada al pozo-pmapa tarde. Indicar el umbral (por ejemplo, 50%) en &quot;Neutralización: Deducción Infección (%)&quot;. </li><li> Seleccione &quot;proceso de neutralización&quot; para el cálculo de los títulos. Compruebe los títulos y haga clic en el botón &quot;Guardar y Cerrar&quot; para guardar los resultados de neutralización. NOTA: La neutralización se expresa como el recíproco de la dilución más alta del suero con la predefinido reducción ICP (tal como 50% o 80%) en contra de la VC (la media de la columna 11 en la Figura 4). Una reducción ICP 50% se utilizó en los resultados representativos. </li></ol></li></ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este estudio, hemos descrito un ensayo de MN a base de formación de imágenes para cuantificar las verdaderas relaciones antigénicas entre los virus. En comparación con otros ensayos de reducción de placa, el método hace hincapié en la medición de la ICP de un bien todo, garantizar la cobertura completa de la población infecciosa. Su independencia de la formación de placa también se amplía la aplicación del ensayo a los virus que pueden formar pequeñas placas principalmente invisibles o que sólo pueden manejar la infección de una sola célula. Por lo tanto, el ensayo es capaz de examinar más virus y los efectos de una gama más amplia de anticuerpos que HI, y ayuda a reflejar de forma más exhaustiva las similitudes antigénicas o diferencias entre los virus 12. Por ejemplo, cuando se incluye carboxilato de oseltamivir, el ensayo de MN se ve menos afectada por NA unión dependiente, lo que refleja las diferencias antigénicas con más precisión. Durante el desarrollo del ensayo, se hicieron grandes esfuerzos para mejorar la consistencia experimento, la velocidad, y la detecciónsensibilidad, incluyendo mediante el control de los virus de entrada a través de la valoración cuantificada, de imágenes en un alto rendimiento con un escáner de superficie plana, y la implementación de una plataforma de procesamiento de datos fácil de usar. Los resultados han sido, en general consistentes con y confirmó las de HI. En particular, los resultados también revelaron diferencias antigénicas entre variantes de deriva antigénica de los virus recientes de tipo A y de la vacuna B, así como cambios antigénicos causados ​​por los cambios de cultivo seleccionada o esporádicos, tales como la sustitución G155E en HA1 de ciertos (H1N1) virus pdm09 A 12. El protocolo de juego con el tipo de virus o subtipo con la selección de líneas celulares que dieron la infección más fuerte, lo que permitió aumentar la señal de imagen. variación experimental se alisa con el diseño de duplicados que equilibrarse con el número de antisueros probado. Las incertidumbres también pueden provenir de la calidad de imagen, que está influenciada principalmente por el dispositivo de formación de imágenes. Una superficie plana de color del escáner decente puede signinificativamente mejorar el contraste de la imagen y reducir el ruido. La cantidad de virus de entrada en la neutralización debe ser determinado cuantitativamente por adelantado de la valoración correspondiente, mientras que los virus todavía mantienen un estado similar. Durante la neutralización, la respuesta a una infección antisuero se normaliza contra la diferencia entre el virus de referencia (VC) y el nivel de fondo (CC). Las mediciones precisas de VC y CC son esenciales para un experimento de neutralización. Se recomiendan más duplicados (ocho duplicados fueron utilizados en los resultados representativos). Por último, la comprensión de que el software es vital para el éxito de un experimento. El software ha sido probado para la caracterización del virus de la rutina en el Centro de la Gripe de la OMS, Reino Unido durante más de dos años. Las instrucciones detalladas para hacer frente a diversas situaciones se proporciona en el S1 complementario. Este ensayo MN es adecuado para aplicaciones en las que las muestras cubren una extremely gran campo de vista, pero sólo requieren de imágenes de resolución moderada. El bajo costo y fácil instalación hacen que el sistema fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios de virología. La variación en las mediciones de la misma muestra fue de menos de 3%, que define aproximadamente la incertidumbre introducida durante la exploración 11. Tal reproducibilidad es suficiente en muchos estudios virológicos y puede reducirse aún más el promedio de las imágenes de varias exploraciones. En conclusión, este estudio demuestra un ensayo de MN robusto que puede ser utilizado de forma rutinaria en estudio antigénico y para apoyar los datos HI de análisis detallados de virus de la gripe actualmente en circulación, en particular para la selección bianual de virus para su inclusión en las vacunas de la gripe humana.

Micro-neutralización (MN) ensayos se utilizan en virología para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes y de las actividades antivirales. Como una alternativa de inhibición de la hemaglutinación (HI), ensayos de MN pueden superar los efectos no antigénicos influenciados por los cambios de afinidad de unión al receptor en los virus de influenza, que puede complicar la interpretación de los resultados de HI 1,2,3. Hasta hace poco, la mayoría de los ensayos de MN se basaron en los efectos citopáticos (CPE) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) 4,5. MN ensayos basados en la reducción de enfoque y la placa se desarrollaron en 1990 6,7,8. ensayos de reducción de placas se basan en el recuento de placas visibles para cuantificar la infectividad. Sin embargo, los conteos visuales sólo cubren grandes placas que son resolubles por los ojos humanos, a pesar de que la mayoría de las placas son pequeños e invisibles para muchos virus circulantes actuales. Esta cobertura incompleta puede causar una variación significativa entre los examinadores y entre experimentos, lo que lleva a incomparable resultados. También es imposible utilizar el método cuando algunos virus muestran infección abortiva de células individuales o muy pequeñas placas. La resolución de contaje pobre se puede mejorar mediante la introducción de un protocolo basado en formación de imágenes. Con los avances en la tecnología, microscopía óptica y de alto rendimiento de los lectores de placas bien pueden proporcionar medios precisos para contar las células infectadas 9. Bajo el microscopio trans-iluminación, las células infectadas etiquetados con ciertos marcadores pueden ser visualizados por su absorción o fluorescencia contraste en la resolución subcelular. Una muestra puede ser analizada en una pantalla de ordenador. Desafortunadamente, debido a la limitación en el campo de vista, se requieren más de un centenar de imágenes en mosaico para cubrir un solo pozo. El análisis de una placa con 96 pozos requeriría la formación de imágenes y procesamiento de cerca de diez mil imágenes. Tal proceso laborioso es largo y costoso, y la resolución obtenida es en génerosl innecesario para la caracterización de rutina de infecciones virales. Laboratorios con un presupuesto limitado pueden encontrar que el enfoque en torno a un escáner de superficie plana ofrece una alternativa de alto rendimiento rentable. En este trabajo se describe un ensayo de reducción de placas MN mejorado que es adecuado para la caracterización antigénica de un gran número de virus y para medir cuantitativamente las actividades antivirales y anticuerpos de neutralización. El ensayo tiene varias ventajas: en primer lugar, es un ensayo basado en formación de imágenes que es capaz de medir las infecciones de virus en el nivel celular, independientemente del tamaño de la placa. Contando la población total de células infectadas (ICP) dentro de un bien aumenta en gran medida la sensibilidad de detección, por lo que es posible caracterizar el virus con baja infectividad. En segundo lugar, una valoración cuantitativa más precisa se introduce antes de la neutralización para determinar la cantidad de virus de entrada. El virus de entrada cuantitativa reduce significativamente la variación entre los diferentes experimentos y hace que los resultados sean más comparables entre los laboratorios. En tercer lugar, los títulos de neutralización pueden determinarse directamente mediante el análisis de imágenes, por lo que la cuantificación rápida y fácil de usar. Por último, el protocolo ofrece una alternativa rentable y de alto rendimiento con la resolución y la precisión requerida. La cuantificación se basa en un escáner de superficie plana y software de procesamiento de datos libre. Todo el conjunto tiene un tamaño reducido y se puede implementar en la mayoría de los laboratorios. El protocolo presentado en este documento consta de cuatro pasos importantes, incluyendo la titulación del virus, la cuantificación de titulación, la neutralización del virus, y la cuantificación de neutralización. Titulación del virus es un experimento de preparación que determina la cantidad de virus de entrada que se utilizará en la neutralización. Durante una titulación, una serie de concentraciones virales se aplican a las monocapas de células en una placa de 96 pocillos. Las células infectadas se cuantifican a continuación en la sección 2. El Dilu viralción que produce el 20% -85% ICP se aplica a su vez como virus de entrada correspondiente a la neutralización de 3. Los títulos de la sección del protocolo de neutralización se cuantifican utilizando la sección 4. Los experimentos que siguieron los protocolos anteriores se presentan en los resultados representativos. El ensayo ha sido probado a fondo durante los últimos dos años con la mayoría de los virus de la gripe que circulan corrientes, tales como A pdm09 (H1N1), A (H3N2), virus A y B. Los resultados de la caracterización virus de la gripe se incluyeron en los informes para la reunión de consulta de la OMS que dio recomendaciones sobre vacunas contra la gripe para su uso en el hemisferio sur en 2016 y en el Hemisferio Norte 2016-2017.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se presentan algunos resultados de los últimos experimentos de caracterización antigénica. La configuración de valoración se diseñó para examinar ocho virus de entrada, con duplicados dobles para cada dilución. Las diluciones virales fueron probados entre 1,0 x 10 -1 y 1,0 x 1,0 -6 para cubrir las variaciones entre los virus. Los virus de ensayo fueron del subtipo H3N2, incluyendo A / Camerún / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, y A / Bratislava / 437/2015. Los resultados de la valoración se ilustran en la Figura 5. La figura 5d demuestra la disminución de la ICP con el aumento de la dilución de virus. Las curvas se normalizaron contra los ICP de los mismos virus que produjeron infecciones en todas las células dentro de un pozo 12 (que se define como la saturación de ICP). Si el ICP no alcanzó la saturación con la hiGhest concentración de virus, se utilizó la media de ICP correspondientes duplicados en lugar (A / Moscow / 103/2015 en la Figura 5d). Las diluciones de virus que producen 30% de la saturación de ICP fueron elegidos como la dilución de virus de entrada para la neutralización (Tabla 3). La neutralización del virus destinado a tener una entrada contra cinco antisueros, con duplicados dobles en cada placa. El virus H3N2 de referencia mostrado es A / Estocolmo / 63 / año 2015. Los cinco antisueros son A / HK 4801/14 F12 huevo / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sudáfrica r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, y A / 525/14 SIAT holandés F23 / 15. Los resultados de neutralización se ilustran en la Figura 6. La figura 6d muestra el progreso de la infección con el aumento de la dilución de suero. La población positiva normalizada en el eje vertical representa la proporción de ICP de la respuesta correspondiente antisueros frente a la media ICPdel virus de referencia 12. El ICP fondo de los controles de células no infectadas se restó durante la normalización. Los títulos de neutralización se determinaron como los recíprocos de las diluciones de antisuero correspondientes a la reducción de ICP% 50 (Tabla 4). La interpolación lineal se utilizó para estimar los títulos que caen entre dos diluciones de suero adyacentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de una configuración de placa de pocillos en un experimento de titulación del virus. virus de prueba se asignan a las filas separadas (A a H). Columnas están diseñados para diferentes diluciones virales (1 a 12). Dos columnas se utilizaron como duplicados para cada dilución viral. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2: Esquema de un sistema de barrido de la muestra. (A) Una placa de 96 pocillos en la posición de formación de imágenes de un escáner de superficie plana (republicado de referencia 11 con permiso de Elsevier), y (b) las dimensiones de la posición final en forma de L que se muestran en (a). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figura 3: Diagrama de escritorio del software de cuantificación &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figura 4: Ejemplo de una configuración de placa de pocillos en un experimento de neutralización. Cada antisuero se asigna a dos columnas con duplicados (1 a 10). Las filas están diseñados para diferentes diluciones de suero (A a H). El control de virus toma la columna 11, con ocho duplicados (A11 a H11). El control de células está en la columna 12, con ocho duplicados (A12 a H12). Barra de escala = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figura 5: Resultados de un experimento de valoración. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) escanea bien la placa radiográfica, (c) la ilustraciónde la, se cuantificó, población celular infectado con virus de color codificada, y (d) normalizados poblaciones de células infectadas por virus contra diluciones de virus. 30% ICP se utilizó como umbral. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figura 6: Resultados de un experimento de neutralización. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) bien la placa radiográfica, (c) la ilustración de la, población de células infectados con virus se cuantificó, y (d) la población de células infectadas por virus normalizada frente a la dilución de suero escaneada. La vi de entradarus (VC) es A / Estocolmo / 63 / año 2015. 50% ICP se utilizó para calcular los títulos. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> S1 complementario: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> dilución típica </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 días </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 días </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Número típico de células por ml </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 días </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 días </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: diluciones típicas en una subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modo </td><td> Modo profesional </td></tr><tr><td> Tipo de Documento </td><td> Película (con guía de área) </td></tr><tr><td> Tipo de exposición automática </td><td> Foto </td></tr><tr><td> EstoyTipo de edad </td><td> Color de 24 bits </td></tr><tr><td> Resolución </td><td> 1.200 dpi </td></tr><tr><td> Formato de imagen guardada </td><td> PELEA </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Configuración típica de un escáner de superficie plana. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fila </td><td> Virus </td><td> Se recomienda la dilución </td></tr><tr><td> UN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> segundo </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> do </td><td> A / Moscow / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> re </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5,9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> mi </td><td> A / Moscow / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moscow / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> GRAMO </td><td> A / Moscow / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> MARIDO </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabla 3: diluciones virales calculados a partir de una población de 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Columna </td><td> antisueros </td><td> título recomendada </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> Un / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 En </td><td> A / Sudáfrica / r2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Suiza / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Países Bajos / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Los títulos a 50% de ICP A / Estocolmo / 63/2015 frente a antisueros.

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Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Este estudio describe una -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K vistas.  The Francis Crick Institute.  Este estudio describe una -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B. 

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...