LHB was funded by the Wellcome Trust Dynamic Cell PhD programme; KAR was funded by MRC project grant MR/L002566/1 (awarded to EJR and CLH) and CLH was funded by ARUK grant 19479. We would also like to thank the Wolfson Bioimaging facility for imaging advice.

protokolü dahilinde tüm adımları Üniversite Bristol hayvan bakımı ve refahı kurallarına ve İngiltere Ev Office olanların izleyin. Kas-iskelet Anatomi 1. Görselleştirme NOT: kas ölçmek için ve kas ekleri tam yerleştirme tanımlamak için, iskelet elemanlarının şeklini görselleştirmek için, immunostain (bölüm 1.1) (kas ortaya) iskelet miyozin için uygun yaşta balık ve tip II kollajen (görselleştirmek için kıkırdak). Alternatif olarak, kollajen a1 muhabiri col2a1 olarak transgenik floresan muhabiri hatları kullanılarak kas-iskelet anatomisi görselleştirmek: mCherry 13,14 kıkırdak ve yavaş miyozin ağır zincir raportör smyhc görselleştirmek için: GFP 15 kas ekleri (Bölüm 1.2) konumunu görselleştirmek için. kıkırdak ve kas işaretlemek alternatif hatlar eşit işe yarayabilir. <ol><li> floresan Immunostaadencilik <ol><li> 1 saat süre ile, fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde fazla% 4 paraformaldehit (PFA) larva düzeltildi. % 0.1 Tween 20 (PBT) ile PBS içinde yıkanır ve sırasıyla, 5 dakika için PBT içinde% 50 metanol (MeOH) ve% 100 MeOH kurutmak. Dikkat: PFA toksik ve malzeme güvenlik levha doğrultusunda ele alınmalıdır. Not: gerekene kadar Larva% 100 MeOH içinde saklanabilir. </li><li> 5 dakika PBT içinde% 50 MeOH larva rehidrate. 5 dakika boyunca PBT yıkayın. </li><li> 5-6 dakika boyunca buz üzerinde PBT% 0.25 tripsin larva geçirgenliği. 5 dakika her biri için 4x PBT yıkayın. </li><li> PBT% 5 serum 2-3 saat engelleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat ve gece boyunca 4 ° C PBT içinde% 5 serum içinde tavşan anti-tip 2, kollajen ve fare anti-miyosin antikorların Tavsiye edilen seyreltme larva inkübe edin. NOT: Tavsiye edilen seyreltme aralığı antikor veri sayfasında normalde. birbirinden farklı türlere karşı yükseltilir ve bu da yönün olan antikorları seçindokuya kira. </li><li> PBT 15 dakika Larva 6x yıkayın. </li><li> PBT% 5 serumunda 1-2 saat engelleyin. </li><li> Karanlıkta, ikincil antikorlar inkübe edin. Belirli bir antikor için% 5 serum ve PBT uygun seyreltide flüoresan etiketli anti-fare (550) ve anti-tavşan (488) sekonder antikor kullanın. </li><li> mümkün olduğunca çabuk bir 10X konfokal mikroskop PBT ve görüntüde her biri 10 dakika yıkayın 6X. </li></ol></li><li> Görüntüleme Kas-iskelet Geometri <ol><li> Danieau çözümü 16 ılık 0.3-0.5% düşük erime noktası (LMP) agaroz bir lamel ventral larvaları monte edin. NOT: Transgenik balık montaj öncesi ve görüntüleme sırasında% 0.02 MS222 (Tricaine metansülfonat, pH 7) sedasyon gerekir. </li><li> 10X objektif lens ve yaklaşık 2.5X dijital zoom kullanarak ilgi bölgenin konfokal görüntü yığını alın. 488 nm ve 561 n kullanarak yeşil ve kırmızı kanalın görüntülerini hazırlayınm sırasıyla lazerler. 1.3 mikron ve 3 hat ortalamalar z düzlemleri arasında bir aralık ile 512 x 512 piksel çözünürlükte görüntü. Ortaya çıkan yığın yaklaşık 100 z dilim oluşacaktır. </li><li> Bir tiff dizisi olarak veri ihracat. Bir 5dpf zebrabalıkları larva kas ve kıkırdak elemanlarının en fazla çıkıntılar, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. 3D Surface oluşturuluyor <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3, 4 ve 5 dpf, her bir zaman noktası için temsili bir veri kümesi seçin (çoklu numunelerin görselleştirme sonra seçin). </li><li> 3 boyutlu tiff yığını açın ve analiz yazılımı tüm kanalları seçmek. Sağ kıkırdak kanala tıklayın ve görüntü filtresi ve yumuşatma seçin: Gauss (Şekil 2B). </li><li> Proje görünümünde sağ &#39;yeni bir etiket düzenleme&#39; sonra süzülür resmin üzerine tıklayın ve &#39;görüntü segmentasyonu&#39; seçin ve. Her malzeme, yani kıkırdak ve j için yeni bir etiket oluşturunoint. Sihirli değnek aracını kullanarak görüntünün kıkırdak bölgesini (Şekil 2C, beyaz sinyal, mor anahat) seçin. özetliyor gürültü çıkarmak için fırça aracını kullanın. NOT: sihirli değnek aracını kullanarak ise, &#39;Bütün dilimleri tıklayın. </li><li> Fırça aracıyla ortak bölgeyi seçin ve ortak bir bileşene atamak (Şekil 2C, mavi anahat) </li><li> Üst menüde ve pürüzsüz etiketlerde segmentasyon seçerek bir kerede düzgün birden dilimleri. Sağ 3D yüzey bileşeni (Şekil 2B) render üretmek için yüzey oluşturmak resmin üzerine tıklayın ve seçin. </li><li> yüzeyde tıklayın ve meshing yazılımı içine aktarmak için bir hmascii dosyası olarak kaydedebilirsiniz. </li></ol> 3. FE Modeli Kullanılacak Muscle Kuvvetleri hesaplanması <ol style="margin-left: 40px;"><li> Smyhc konfokal görüntüleri kas liflerinin sayısını: GFP transgenik zebra balığı (Şekil 1A, ok ucu, 1C) ve diam ölçmekelyafların eter enine kesit alanını hesaplamak için (πr 2). </li><li> literatürden kas birim alan başına uygun kuvvet tanımlayın. Larva Zebra balığı iskelet kasları (40 nN / um 2) için birim alan başına üretilen maksimal kas kuvveti 17 kullanılmıştır. </li><li> Birim alan başına kuvvet liflerin sayısı ve bunların alanı çarpılarak her bir anatomik kas grubu için kuvvetleri hesaplayın. Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol> 4. Bir Mesh oluşturma <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bir sonlu elemanlar örgü üretme yeteneğine sahip bir yazılım paketi içine bölüm 2 (yukarıda) üretilen 3D modeli alın. </li><li> 2B menüsü altında shrink wrap aracını kullanarak kıkırdak ve eklem yüzeylerinin A2D örgü oluşturun. Uygun bir eleman boyutunu seçin. Not: 1.5-2.5 arasında bir eleman boyutunu kullanın. Gerekirse, farklı boyutlardaki 2D yüzeyin bir dizi 3D örgü optimizasyonu (Bölüm 4 yürütmek için kafesleri oluşturmak.4). </li><li> &#39;&gt; 2D&gt; Araçlar elemanların kontrol&#39; altında bulunan örgü kalite kontrolleri yürütmek örgü çoğaltılamaz elemanları, eklemeler ve sızmalar kontrol paneli. Model ağacında yarar sekmesini kullanarak dihedral açıları sabitleyin. </li><li> 3D&gt; Tetramesh nolu alt-panel kullanılarak eleman boyutunu farklı 2D yüzey kafesleri bir 3B kafes oluşturun. NOT: Farklı örgü boyutlarda sonuçları karşılaştırın ve daha fazla simülasyonları sonra yakınsar ve özellik tanımı ödün vermeyen düşük mesh boyutu ile FE model seçin. Şekil 3&#39;te örnek alt çene kıkırdaklar için 1,5 milyon tetrahedral öğeler içerir ve 2.0 2D eleman boyutu vardı. </li><li> çene modeli Geometri&gt; Mesafe nolu alt-panel kullanarak konfokal yığınının başına ölçekli yani örgü Transform. NOT: kıkırdak sağlanması ve ortak bileşenler birleştirilmiş bir model ihraç ederek veya bağlarını kullanarak modelde bağlanır. </li></ol> 5. Sonlu Elemanlar Model İnşaat <ol><li> Ticari sonlu eleman (FE) yazılımını kullanarak, bir FE modeli oluşturmak. 3D kas ve bir rehber olarak bölüm 1 oluşturulan kıkırdak etiketli konfokal yığınları kullanarak, kas bağlantı noktaları karşılık düğümleri atayın. Her kasın kökeni ve ekleme temsil iki düğüm (Şekil 3) arasında bir vektör oluşturun. </li><li> tip &#39;tarih&#39; bir yük toplayıcı oluşturun, her kas için bir &#39;C yükü&#39; uygulamak için. (Adım 3.3 hesaplanan) Newton cinsinden büyüklüğünü belirleyin ve ilgili vektör atayın. 3 adduktor mandibulae&#39;de (PM), açıölçer hyoideus (PH) ve intermandibularis (IM) için bağlantı noktaları göstermektedir. NOT: Bu çene kaslarının için, maksimum kasılma kuvveti her yükün sadece% 50&#39;si her yerinde uygulanan, böylece kökeni ve ekleme arasında dağıtılır. </li><li> Literatürde tarafından belirlenen uygun elastik izotrop malzeme özelliklerini atayın. kıkırdak için Young modülüve bu modelde Interzone, sırasıyla 1.1 MPa ila 0.25 MPa ve Poisson oranı, her iki 18,19 için 0.25 olmuştur. </li><li> model üzerinde ilk kısıtlamalar uygulamak Türün &#39;sınır&#39; bir yük toplayıcı oluşturun. Sekme Analiz&gt; Kısıtlar gidin ve oluşturmak nolu alt-panel de, sen sınırlamak istediğiniz modele düğümleri seçin. serbestlik dereceleri (DOF) hareket doğal aralığının en iyi yaklaşım Modelin bu sınırı hareketini seçin. Not: Şekil 3&#39;te örnek tüm hareket eksenleri sınırlandığını: modeli ve bir orta noktada yer içinde çapa ceratohyal de (DOF 1, 2, 3, sırasıyla x, y ve z, temsil eder) palatoquadrate zebra balığı kafatası geri kalanı (Şekil 3, Tablo 1) bağlandığı noktada, y ve z eksenleri. modeli en az bir düğüm üç derinliğindeki sınırlanmalıdır. </li><li> Eğer Simul istediğiniz hareketin her tür için bir &#39;yük adım&#39; oluşturmaAnaliz menüsü altında (yani, açma, kapama) yedik ve bu hareketi simüle etmek (Bölüm 5.4&#39;te yapılan) ve kısıtlamaları (Bölüm 5.2 yapılan) ilgili tüm yükleri seçin. göründüğünde açılır menüden &#39;Static&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Bu durumda &quot;.inp&quot; biçiminde uygun bir dosya biçiminde örgü, yükler, kısıtlamalar ve malzeme özellikleri de dahil olmak üzere ihracat modeli. </li><li> FE analiz yazılımı yükleyin modeli. Oluşturma ve İş modülü kullanılarak model için bir iş yürütmek. </li><li> Sonuçlar sekmesi ve görselleştirme menüsü bulunan vb stres, gerginlik, yer değiştirme, için çıkış analiz (Şekil 4 ve 5). </li></ol> Çene Deformasyon / Deplasman Mesafeler 6. Doğrulama <ol><li> Transgenik zebrafish: 3-6 Tg (mCherry Col2a1aBAC) seçin. </li><li> onlar dokunmak ama yürekleri hala yenerek cevap sona erene kadar hafifçe% 0.02 MS222 ile larva uyuşturan. </li><li> dağyanal ılık% 1 LMP agaroz lamelleri (anestezi iken) (Danieau çözümü içinde yapılır) larvalarının. </li><li> başının etrafında agaroz çıkarın ve forseps ile çene. </li><li> Normal ağız hareketleri devam ettirene kadar Pasteur pipeti kullanarak anestezi kaldırmak için larva başının üzerinde (hiçbir MS222) ile taze Danieau çözümünü yıkayın. </li><li> Ağız hareketlerinin parlak alan yüksek hızlı video çekmek için film yakalama yazılımı kullanabilirsiniz. En yüksek kare hızında bir dakika süre etrafında film çekmek, ya da yeterli çene açıklığının birden döngülerini kaydetmek için. </li><li> maksimum deplasman açık çene göstermek çerçeveleri seçin. Meckel kıkırdağı ön uç ve mikron üst çene (etmoid plaka ucu) arasındaki mesafeyi ölçün. </li><li> Birden balık larvaları ortalama deplasman hesaplayın. </li><li> modelden deplasman veri ayıklayın. (Model değiştirme davranışı doğrulamak için 6.8 hesaplanan ortalama deplasman kullanın <strong&gt; Şekil 4). Model sırayla malzeme özelliklerini ve kas yüklerini değiştirerek beklenen çalıştırmak duyarlılık analizi saparsa. </li></ol>

<ol>
	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok. Şekil 3-5&#39;te bazı veriler J.Biomech, 48 (12), Brunt ve ark. Yeniden basıldı olmuştur Sonlu eleman modelleme nedeniyle çene gelişiminde, 3112-22 kas zorlanma kaybına ortak şekil ve hücre davranış değişiklikleri öngörüyor. 2015, Elsevier 15 izniyle.

Finite Element models have been used to relate the areas of skeletal elements that are under strain with those undergoing bone formation 10, as well as to map the areas under strain during endochondral ossification and joint morphogenesis 8,12,21. Other studies have also been able to apply theoretical growth models to replicate changes during joint development 11,12. Here we show the protocol for building FE models for a relatively simple system, the zebrafish jaw 20. Unlike alternative methods of collecting raw images for the FE models, such as CT scanning 22, confocal imaging of transgenic lines or immunostained zebrafish allows for multiple tissues to be studied. It can, therefore, provide direct information on muscle attachment points in relation to cartilage. Among vertebrate models zebrafish are particularly amenable to genetic and pharmacological manipulation. The generation of FE models for zebrafish craniofacial cartilage now opens up the possibility of further study of the interplay between biomechanics and genetics in joint morphogenesis.
There are a number of critical steps to the process of creating an FE model; the first is generating an accurate three-dimensional representation of the system. This requires imaging at high enough resolution to clearly define boundaries. Note that even with high-resolution imaging to make a good surface one may have to smooth out some regions. Another critical step is defining the correct placement of the load and correct constraints. An insufficiently constrained model will fail to solve and incorrect placement of the loads will cause abnormal movement.
Some processing of the raw data (Figure 2) is necessary as a surface generated from the raw data would be difficult to mesh (Figure 2B). We filtered the data using a Gaussian filter (Figure 2C) and we carried out some manual smoothing of the curves to produce a set of clean outlines that can be converted into a 3D surface. Too much smoothing can produce a &#34;melted&#34; surface that has lost many of its features. Choosing the correct element size is an iterative process as choosing too small an element size creates too large a mesh which is computationally intensive. However, choosing too large an element size will produce a mesh which fails to recapitulate the correct shape of the structure. The correct mesh had the smallest element size that captured the correct shape of the jaw and converged on a correct solution, verified using the jaw displacement. It may also be necessary to modify the material properties or load calculations to better emulate the correct displacement as different ages and species will have substantially different properties.
It is important to remember that there are always limitations to a hypothetical model and assumptions made to run FE models. When only modeling one or a small number of samples it is critical to ensure that a representative sample is chosen as there are likely to be small variations between individuals. As only some of the jaw elements and muscles were included, the model is a simplified version of the zebrafish craniofacial musculoskeletal system. Therefore, constraints had to be positioned to account for where the modelled jaw elements would connect with the rest of the skull and the model was artificially constrained in the center to fix it in &#39;space&#39;. This artificial constraint did not impact on the interpretation drawn from the models as the ceratohyal itself was not analyzed. The inclusion of more of the craniofacial structure, especially other jaw opening muscles such as the sternohyals and its attached cartilage 23, could have added to the model, but limitations include the ability of larger models to run in the Finite Element software.
Another limitation is that we have not modeled ligament insertion, though this could be achieved by the insertion of springs 8. One other assumption made in this case was that the model would behave linearly. The magnitudes of strains on the models were comparable to those in published models and applied to in vitro cells 10,24, with strains being below +3,500 and above -5,000 &#181;&#603; apart from constraint and muscle attachment points. Therefore, the strains at the relevant regions of the model were deemed within a range acceptable for a linear model. Cartilage does not behave entirely as a linear material and has previously been modelled as a poroelastic material, which enabled analysis of the fluid behavior in the model 25. Spreading the muscle attachment points amongst a cluster of local nodes would distribute the peak forces and more accurately represent the muscle insertion for certain muscles.
Use of FE allows an assessment of the strains and stresses acting on a structure. As a technique it is frequently used in many bioscience disciplines including orthopedics, paleontology and more recently developmental biology. Here we describe how to build FEs for the zebrafish lower jaw. In the future these models could be extended to look at the whole jaw, including the palate. Similar techniques could be used to model spinal biomechanics in fish, which to date have mostly been studied by kinematic means.

Sonlu Elemanlar (FE) modelleme hesaplama hesaplamak ve bir yapı 1 etkiyen suşları büyüklüğünü ve konumunu harita olabilir bir mühendislik tekniğidir. Modeli &quot;Sonlu Element&quot; bir örgü ile temsil edilen 3D yapı oluşur ve analiz Sonuç örgü, mekanik büyüklük ve konum elemanlarının yapısı ve sayısı da dahil olmak üzere bir dizi faktöre tarafından yönetilir yükler ve malzeme özellikleri. Malzeme özellikleri yükün belli bir türü altında bir malzemenin davranış bazı yönlerini tanımlamak; Örnek gerildiğinde Poisson oranı, uzunluğu bir malzemenin genişliği oransal azalma tarif ise Young modülü (E) malzemenin elastikiyetini açıklanmaktadır. FE modelleme &#39;yapısı hakkında hesaba benzersiz giriş verileri alarak model üzerinde değiştirme, stres, baskı ve gerilme oyunculuk da dahil olmak üzere değişkenler çeşitli hesaplamak için kullanılabilir; S şekil, konum ve yüklerin büyüklüğü ve özgül malzeme özellikleri. FE modelleme yaygın mühendislik 2 ve giderek 3, ortopedik ve paleontolojik uygulamaları 4 kullanılır. Gelişmede biyomekanik kuvvetler hücresi tepkilerini 5-8 aktif hale getirmek için birçok hücrede bir uyarıcı olarak işlev gördükleri bilinmektedir ve organ sistemlerini geliştirmek içinde göreli konumları ve mekanik uyarıcılara büyüklüğünü hem de tahmin etmek yararlıdır, ancak, şu anda FE modelleme az kullanılan olmuştur Zebra balığı gelişimi için. Hem kıkırdak ve kemik mechanosensitive malzeme olduğu gösterilmiştir. Örneğin, in vitro olarak bir sıkıştırma gerilimi kemik oluşumu 9 için gerekli olduğu gösterilmiştir edilmiş olmasına rağmen, kondrojenik yolunu aktive olduğu bulunmuştur. FE analizi (FEA) fo kemiğin sırasında iskelet elemanları üzerinde etki gösterenler dahil, biyolojik örnekler üzerinde etkili suşları modellemek için istismar edilmiştirım 10. Teorik biyomekanik güçler 11,12 maruz kalmıştır ve civciv diz eklemi morfolojilerinden 8 sırasında mevcut suşları desen göstermek için sonra diğer kalkınma uygulamaları eklem şeklini tahmin etmek kullanımını da kapsar. Bu protokol gelişmekte olan dokulara mekaniğini anlamak için bir bakış açısıyla konfokal görüntüleri 3 boyutlu yüzeyler, kafesleri ve Sonlu Elemanlar modellerinin üretilmesi deneyim paylaşımı amaçlanıyor. Biz de in vivo gerçek eklem değiştirme bilgileri yakalayan rağmen FE modelleri doğrulayarak yollarını göstermektedir. Biz bir örnek olarak Zebra balığı çene kullanırken aynı teknikler kas-iskelet sistemi yapısı üzerinde 3D bilgiler konfokal veya multiphoton görüntüleme ile elde edilebilir olan herhangi bir küçük bir biyolojik sistemde kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Kas (Şekil 1A) ve kıkırdağın (Şekil 1B) veya transgenik muhabir görüntüleme immün (Şekil 1C) ilişkili kas birlikte, çene 3 boyutlu yapısı görüntülenmiştir sağlar. Yüksek çözünürlükte görüntüleme ile çene üç boyutlu bir şekil (Şekil 2) ve konumunu ve yüklerin yerleştirme (Şekil 3) hem de yakalayan bir model oluşturmak mümkün olmuştur. Yüksek hızlı video yakalama keflfe in vivo değiştirmeler (Şekil 4) kullanarak biz modelde hareket açıklığı gerçekçi bir aralıkta olduğunu doğruladı. Run kez FE modelleri, stres (Şekil 5A), minimum ve maksimum asal gerinim (- K Şekil 5B) gibi veriler, bir dizi görüntülemek için kullanılabilir. Bu sonuçlar, üç loş<html> İlgili görünümleri (Şekil 5F, 5G, 5J, 5K) ve dijital (Şekil 5E kesitli &#39;, 5E&#39; &#39;5I&#39;, 5I elde etmek döndürülmüş böylece modeli detay ince desenleri (Şekil 5E, 5I) görmek için büyütülmüş olabilir boyutlu, &#39;&#39;) göstermek için nasıl bir model boyunca stres, gerginlik veya basınç değişikliği desenleri. Bu modelden nicel veri ayıklamak için de mümkündür (gösterilmemiştir). modeli doğrulamak ve şekli en doğru malzeme özellikleri, yükler kullanılarak ve örgü ile FE model geliştirme o pencereden sırasında hücreler tarafından yaşanan mekanik çevrenin en iyi tahmini keşfetmek için kullanılabilir. Modelin sonucu doğrudan hücresel davranış ve gen 20 değişikliklere karşılaştırılabilir. <html> 1 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. 5 dpf&#39;e zebrabalıkları alt çene iskelet elemanlarının Temsilcisi görüntüleri 5dpf larvalarının alt çenenin Temsilcisi konfokal yığınları tüm iskelet miyozinin lekeleri A4.1025 için immün top anterior (A) (B) ile gösterilen transgenik gazetecilere col2a1 ifade eden bir canlı larva tüm kıkırdak (C) Stack işaretler Tip II kollajen için immün: GFP yavaş kas (yeşil): mCherry kıkırdak (kırmızı) ve smyhc işaretleme. IA: intermandibularis ön PH: iletki hyoideus, AM: adduktor mandibula&#39;nın, Havai: hyoideus aşağı, Havai: hyoideus üstün, CH: sternohyoideus MC: Meckel kıkırdağı, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">görmek için lütfen buraya tıklayınız daha büyük bir versiyonu bu rakamın.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Şekil 2: konfokal verilerden 3B yüzey Nesil ortak bölgenin yüksek büyütme ile Zebra balığı alt çene için 3 boyutlu yüzey içine konfokal veri geçişi gösteren görüntüler.. (A) Ham konfokal veri; (B) bir Gauss filtresinin uygulanması sonrasında Veri kümesi; (C) Filtreli anahat; (D) 3 boyutlu yüzey. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Şekil 3: kısıtları ve kuvvet vektörleri gösteren temsili kafes (A) ağız kapama ve bir 5 dpf larva Temsilcisi kafes.(B) ağız açıklığı. Beyaz noktalar modeli kısıtlıdır yerleri belirtmek ve hangi ölçüler (örneğin, x ve y veya x, y ve z). Beyaz çizgiler beyaz oklarla gösterilen kas kuvveti vektörü ile, kas pozisyonları ifade etmektedir. Kırmızı kıkırdak gösterir ve sarı interzone. Bu rakam daha önce Brunt ve ark., 15 yılında yayınlanan ek malzemeden modifiye edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Şekil 4:. Duyarlılık testi farklı kıkırdak ve interzone Young modüllerine için 5dpf Zebra balığı çene deplasman simüle FE-modeli. çene işaretlenir (um kapalı açık) yer değiştirmesini çene; renk anahtarı kullanılarak kaydedildi. Her model (A - L) kıkırdak farklı bir kombinasyon (c = 1.1, 3.1 ya da 6.1 MPa) ya da interzone (0.25 i = 0.5, 0.75, veya 1 Mpa) özelliklere sahiptir. Yatay siyah ok (dikey siyah okla temsil edilen) Meckel kıkırdağı ucundaki çene deplasman değerini vurgulamaktadır. M ve N larva gösteren asgari dpf&#39;e 5 videolardan fotoğraflar, yani çene (M) kapalı ve maksimum, yani çene üst üste iki ile (K) tam açık (O) - O beyaz çizgi (43 mikron) yer değiştirmesini ifade eder. Değiştirmeler canlı balık görülen 0.25 (A) en iyi maç bir Interzone ile 1.1 Bu durumda göreceli kıkırdak özelliklerinde (O). AL bu rakamın paneller daha önce Brunt et al., 15 yayınlanmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın iyon. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Şekil 5: FE modelleri Temsilcisi veri larva dpf bir 5&#39;te uygulanan tüm kasların FE-modeli simülasyon (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Asgari Anapara suş (E Min. P, μɛ) (C) Maksimum asıl suş (E Max. P., μɛ). çene açılması sırasında maksimum ve minimum temel suşlar FE model simülasyonu. (D - K): Maksimum asıl suş (. E Max P., μɛ) (D) ventral çene görünümü ve (E), ventral eklem görünümü (E) Meckel kıkırdağı ile proksimal-distal bölümlerinin yerini göstermektedir eklem ve interzone (E &#39;) ve (E&#39;) &#39;de, sırasıyla,. (F): Lateralgörünümü çene. (G): Lateral eklem görünümü. (H - K): Minimum Anapara suş (. E Min P, μɛ) (H) ventral çene görünümü ve (I), ventral eklem görünümü. (I) Meckel kıkırdak eklem içinden proksimal-distal bölümlerinin yerini göstermektedir ve (I &#39;) ve (I&#39; &#39;) sırasıyla, (J) interzone: Yanal çene görünümü. (K): Lateral eklem görünümü. Bu rakam daha önce Brunt et al. 15 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Kas liflerinin sayısı </td><td> Kas liflerinin alanı (mikron 2) </td><td> Kas grubu alanı (mikron2) </td><td> Kuvvet (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis ön </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf iletki hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf Adduktor mandibula&#39;nın </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Kas ölçümü. 40 NN / mikron 2 (referans 17 alınan birim alan başına değeri) kullanılarak dpf&#39;e 5 ° Intermandibularis Anterior, Adduktör Mandibulae ve İletki Hyoideus için ortalama kas kuvvetleri hesaplanmıştır. (Lorga ve diğ., 2011) (n = 3).

Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

Zebra Balığı Çene Biyomekaniğini Araştırmak İçin Sonlu Eleman Modelleri Oluşturmak | Gelişim Biyolojisi | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Görüntüleme.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

Video: Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Gelişim Biyolojisi

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...