This work is supported by the Genomics Research Center, Academia Sinica and the Ministry of Science and Technology of Taiwan, the Republic of China (Contract No. 104-2119-M-001-014).

NOT: Bu protokol, kurutuldu-damlacık yöntemiyle hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) mekansal heterojen azaltmak için geliştirilmiştir. Protokol hazırlanması ve ön koşullandırma, örnek bırakma ve kurutma ve kütle spektrometrisi veri analizi de dahil olmak üzere, üç ana adımdan oluşur. prosedürleri tarif ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir: 1. Hazırlık ve Önkoşullanma <ol><li> Örnek Plate Temizleme <ol><li> nitril eldiven giyin ve deterjan ve distile-deiyonize su (DDW) ile hafifçe örnek plaka el yıkayın. </li><li> metanol (MeOH) ve DDW ile örnek plaka durulayın. </li><li> 600 ml beher örnek plaka takın ve DDW ile doldurun. </li><li> ultrasonik banyoda (200 W, 40 kHz) &#39;de 15 dakika süre ile DDW içinde örnek plaka sonikasyon. </li><li> kaptan DDW çıkarın ve MeOH ile beher doldurun. </li><li> ultrasonik banyo (200 W, 40 kHz) 15 dakika boyunca MeOH içerisinde örnek plaka sonikasyon. </li><li> Azot gazı ile plaka üzerinde çözücü damla uçururum ve örnek birikimi önce kuru numune plaka tutun. </li></ol></li><li> Düzenlenmesi Kurutma Odası Sıcaklığı NOT:. Kurutma odası 35 x 20 x 45 cm 3 (W x D x Y) akrilik haznesi Şekil 1, bu kurutma sisteminin resmini gösterir. odası kurutma bölmesinin içine monte kalibre edilmiş bir higrometre ile gözlenmiş düşük nispi nem durumunu korumak için sabit bir akış oranında bir gaz akış ölçer ile oda sıcaklığında azot gazı ile temizlenmiştir. programlanmış sabit sıcaklık su sirkülatör sahip kurutma bölmesi bir bakır temel blok çelik örneği plakaları karşılamak için kullanılır. bakır taban bloğu 25 ° C 5 örnek plaka ısısını düzenlemek için yapabiliyor. hava, bakır taban bloğu ve numune plakasının sıcaklık K-tipi termokupllar ile kontrol edilir. <ol><li> Kapıyı açın ve hızla bakır örnek plaka koymakBaz bloğu sonra kapağını kapatın. </li><li> El ile saatte 10 standart kübik feet (SCFH&#39;dir) azot akış hızını ayarlamak için gaz debi ölçer ayarlayın. </li><li> bağıl nem her zaman% 25&#39;in altına sağlamak için higrometre ve ince ayar gaz debimetre ile kurutma odasında bağıl nemi izleyin. </li><li> K-tipi termokupl tarafından numune plaka sıcaklığını izlemek ve örnek plakası deney ya da kontrol için oda sıcaklığında (25 ° C) 5 ° C ulaşana kadar manuel olarak su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak. NOT: tasarlanan sıcaklıkta örnek plaka stabilize etmek için, su sirkülasyon sıcaklığı tipik olarak tasarlanmış örnek daha düşük, 5 ° C ila 0 olarak ayarlanır. Örneğin, örnek plakasına 5 ° C tutmak için su sirkülatörün sıcaklık ayarı 2 ° C ila 0 aralığındadır; 25 ° C&#39;de bir örnek plaka korumak için, suyun sirkülatörün sıcaklık ayarı 23-25 ​​° C aralığındadır. </li><li> Gerekli sıcaklık ve bağıl nem örnek birikimi önce (Tablo 1) ulaşılır emin olun. Not: farklı numune plakası sıcaklıkları kurutma işlemleri için tüm parametrelerin yanı sıra ayar değerleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. NOT: oda kapısı uzun süre açık ise düşük örnek plaka sıcaklığında numune plaka üzerinde su yoğunlaşması oluşabilir. Su yoğunlaşması oluşursa kapıyı kapatın ve su yoğunlaşması kurumuş kadar üzerinde herhangi bir örnek yatırmak ETMEYİN. </li></ol></li><li> Matris ve analit Çözümleri Hazırlanması <ol><li> matris çözümleri hazırlanması <ol><li> % 50 DDW sulu solüsyon: 50% asetonitril (ACN) ile 0.1 M thap çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> Analitlerin hazırlanması <ol><li> DDW ile 10 -4 M maltotriozdur çözeltisi hazırlayın. </li><li> % 50 asetonitril, 10 5 M bradikinin fragmanı hazırlandı (1-7) çözeltisi(ACN):% 50 DDW sulu çözelti. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Örnek Biriktirme ve Kurutma <ol><li> Karışımlar 0.1M thap solüsyonu 0.25 | il 10 4 M maltotrioz veya 10 5 M bradikinin fragmanı (1-7), bir mikrosantrifüj tüpü içinde çözeltiler 0.25 ul. </li><li> 3 sn karışık bir çözüm karıştırın. </li><li> santrifüj tüpünün dibinde çözüm toplamak için 2 sn (2000 xg) karışık bir çözüm santrifüjleyin. </li><li> dikkatle, kurutma odasının kapısını açın pipet ile örnek plaka üzerinde solüsyonun 0.1 ul yatırmak ve hemen kapıyı kapatın. </li><li> Örnek damlacık kurumasını bekleyin. . NOT: Farklı numune plaka sıcaklıkları genellikle gözlenen kurutma süreleri Tablo 1&#39;de listelenen 5 ° C örnek plaka sıcaklığı için, ortalama kuruma süresi 800 1000 sn; 25 ° C Örnek plakası sıcaklığı için ortalama kuruma süresi 100 ile 150 sec. </li><li> Kuruduktan sonra, kurutma odasının kapısını açın. </li><li> oda sıcaklığında (25 ° C) su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak. NOT: Numune plaka kurutma işlemi sırasında, oda sıcaklığında (25 ° C) sürekli tutulursa, bu adımı atlayın. </li><li> Oda sıcaklığında (25 ° C) Örnek plaka sıcaklığı döndükten sonra, kurutma bölmesinin örnek plakasını çıkarın. </li><li> 5X stereomikroskop altında örnek morfolojisi incelemek ve bir anlık parlak alan görüntü almak. Not: kristal morfolojileri olarak beklenmemektedir, bu aynı prosedür ile yeni bir numune hazırlamak için gereklidir. Tipik bir kristal morfolojisi, Şekil 2&#39;nin üst panel gösterilmiştir. NOT: 5 ° C gibi düşük örnek plaka sıcaklığına sahip durumlarda, kurutma bölmesinin çıkarmadan önce oda sıcaklığına örnek plaka ısıtmak için önemlidir. Örnekleri yatırma yaparken, önceden karıştırılmış Solutio tutmak YAPMAYINn 10 sn boyunca pipet ucu. numuneleri yatırma sonra yeniden premix çözüm kullanmayan ETMEYİN. Şekil 2&#39;nin üst panel farklı numune plakası sıcaklıkları ile hazırlanan numunelerin parlak alan görüntüleri gösterir. </li></ol> 3. Kütle Spektrometresi Veri Analizi <ol><li> Kütle Spektrometre Veri Toplama NOT: hazırlandıktan sonra, numune görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilebilir. Bu çalışmada, görüntüleme MS deneyler laboratuar yönelik yapılmış senkronlaştırılmış çift kutup TOF kullanılarak gerçekleştirilir (DP-TOF) kütle spektrometresi görüntüleme. Görüntüleme yeteneği ile 15 ticari MALDI-TOF kütle spektrometre aynı zamanda, deneyler için de uygundur. kütle spektrometresi doğrusal ekstraksiyon ve optimize edilmiş emme gecikmeler ile pozitif iyon modunda çalıştırılır. iyonların kinetik enerjisi 20 kV. Lazer ışını boyutu örnek yüzeyinde çapı 35 mikron ve her nokta spektrum ave olduğunu5 lazer çekim öfke. <ol><li> MALDI kütle spektrometresi içine örnek plaka yerleştirin. </li><li> adımlarda 2,1-2,9 hazırlanan örnek kütle spektrometresi analizi görüntüleme gerçekleştirin. </li><li> sonuç penceresinde gösterilen kitle listeden karakteristik kitle tepe seçin ve iki boyutlu iyon görüntü çizmek için &quot;2D&quot; tıklayın. Not: thap ile karıştırılır maltotrioz için, karakteristik tepe noktaları maltotrioz, protonlanmış thap sodiated ve thap sodiated edilir. Thap ile karıştırıldı bradikinin fragmanı (1-7) için, karakteristik tepe noktaları bradikinin fragmanını (1-7) protonlanmış thap protonlanmış ve thap sodiated içerir. </li><li> sinyal yoğunluğu üst ve alt limitlerini belirlemek için pop-up pencere ayar düğmelerini tıklatın ve &quot;bir resmi kaydetmek&quot; butonuna tıklayınız. Bu ayar, iyon resimlerin kontrastını tanımlar. NOT: veri her bireyin setinde, kırık bölgeler ve düşük parlaklığını gösteren boş noktalar ortadan kalkar. </li><li> Gözlemlemek ve iyon karşılaştırmakAdım 2.9 olarak alınmıştır parlak alan görüntü ile görüntü. Not: kütle spektrometrisi ve özellikle iyonlarının görüntülerin inşaat Görüntüleme ticari araçlar ile elde edilebilir. Nedeniyle veri toplama ve analiz yazılımı çeşitli kullanıcıların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için cihaz satıcısı tarafından sağlanan yazılım talimatları takip etmelidir. </li></ol></li><li> Veri analizi NOT: Numunelerin heterojen kantitatif analiz edilir. Bu gösteri, her numune iyonları dağılımını analiz etmek in-house geliştirilen yazılımın birden fazla eş merkezli bölüme ayrılmıştır. analiz, tek başına bir veri analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> önemsiz alanları kaldırmak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüde boş noktalar ve kırık bölgeleri tıklayın. NOT: Bu prosedür iyon görüntünün temel alanını tanımlar. </li><li> iyon görüntünün dıştaki katman bulmak için lütfen &quot;kenar bulmak&quot; tıklayın. </li><li> bir veritabanında dış tabakasında iyon bolluğu bilgileri kaydetmek ve aynı anda iyon görüntüden bu katmanı kaldırmak için &quot;düşeriz&quot; tıklayın. Bu dıştaki katman temsil eden bir onay kutusu sonucu penceresinin &quot;çıkış verileri&quot; listesinde görünür. </li><li> iyon görüntünün merkez tanımlanır yineleyerek 3.2.2 ve 3.2.3 adımları. </li><li> Tıklayın ve &quot;çıkış verileri&quot; listedeki tüm onay kutularını seçin ve verileri vermek için &quot;ihracat&quot; a tıklayın. </li><li> iyonların mekansal dağılımı bilgilerini elde etmek için her katmanın ortalama iyon bolluğu hesaplamak için tablo yazılımını kullanarak dışa aktarılan verileri açın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons.">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption.">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li><li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry.">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li><li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry.">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li><li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate.">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops.">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Hu, J. -. B., Chen, Y. -. C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry:+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation.">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li><li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions.">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li><li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop:+A+Numerical+and+Experimental+Study.">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020 (2009).</li><li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop.">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li><li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , 305-361 (1994).</li><li>Lai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation.">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li><li>Hsiao, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation.">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li><li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots.">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li><li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting.">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

önceki teorik tahminlere dayanarak, damlacıklar içindeki sıcaklık kaynaklı hidrodinamik akışları dışa çözücü buharlaştırma yoluyla uyarılan kılcal akışları üstesinden gelebilir. sıcaklık damlacık artışı içinde gradyanlar zaman moleküllerin bu iç sirkülasyonu verimliliği artırılmıştır. çevre sıcaklığında çevresi muhafaza edilirken, 5 ° C&#39;nin altında Örnek plaka sıcaklığı tutmak zaman tahmin edilen sonuçlara göre, damlacık içindeki sirkülasyon akımlarının ortalama hızı dışa kılcal akımlarının daha yaklaşık 4 kat daha hızlıdır. Numune plaka sıcaklığı çevresi ile aynıysa, devridaim akışlarının ortalama hızı dışa kılcal akışı daha 1800 kat daha yavaştır. Bu hesaplamanın sonucu numune hazırlama esnasında numune plakası sıcaklığı azaltılması avantajlı olduğunu göstermektedir. Deneysel gözlemler, bu öngörü ile katılıyorum. Örnek plaka öfkeçalıçtırdıgınızda tam olarak farklı numune plakası sıcaklıklarda örneğin 0.1 ul numune hazırlama işlemi. Tablo 1 içinde, tipik damlacık kuruma süresini gösteren kontrol edilmelidir. plaka üzerinde örnek çözümü yerleştirilmeden önce, numune plaka yüzeyi kuru olduğundan emin olmak için önemlidir. Düşük sıcaklıklarda örnekleri hazırlanırken su yoğunlaşması oluşursa yoğunlaşmış su numunesi alanları büyütür ve çözümleri sulandırır, çünkü numune çözeltisinin birikimi tavsiye edilmez. Nedenle, 25% altında kurutma bölmesinin görece neminin tutmak önemlidir. Düşük sıcaklıklarda örneklerin hazırlanmasına Buna ek olarak, örnek plakası kurutma bölmesinin çıkarmadan önce, oda sıcaklığına kadar sıcak olmalıdır. Örnek kristalleşmenin tamamlanmasından sonra az su buharının Örnek nüfusu değiştirmez, ancak önemli bir kondansasyon kaçınılmalıdır. Taze önceden karıştırılmış çözümleri kullanımı recom olduğunuiyileşiyorlardı. önceden hazırlanmış solüsyon havaya maruz sonra, örnek solüsyonların ön kristalizasyonu, ortaya çıkar ve son kristal büyüklüğü ve morfoloji değişebilir. Bu nedenle, pipetleme prosedürü pipet olan ön-kristalleştirme örnek damlacık önlemek için, tipik olarak 10 saniye içinde, uygun verimle yapılmalıdır. Uygun kristal morfolojileri kütle spektrometresi analizinden önce üretilen sağlamak için mikroskop altında örnek morfolojileri gözlemlemek için tavsiye edilir. Kristal morfolojisi kadar iyi değilse gerekli birikim sürecini tekrarlayarak, beklendiği gibi. teorik ve deneysel çalışmalara göre, ortam koşulları altında yüklü bir düşük sıcaklık örnek plaka ile numune hazırlanması büyük ölçüde MALDI-MS veri tekrarlanabilirlik ve kalitesini artırır. Daha sonraki deneyler de bu numune hazırlama yöntemi ile sinyal yoğunluğu önemli artışı göstermektedir. t ile elde edilen deneysel verilerOnun yöntemi önemli ölçüde kantitatif analiz için MALDI kütle spektrumlarının güvenilirliğini artırmak. Çözelti bileşim veya yüzey özelliği değişiklikleri kapsayan diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, 8,16-18 değişen kuruma koşulunda, geleneksel örnekler için daha basit ve daha genel olarak uygulanabilir. Böylece, en kütle spektrometresi kullanıcıları düzenli uygulamalarda ondan yararlanabilir. Numune plaka sıcaklığı azaldıkça MALDI sinyal homojenlik iyileştirilmesi de diğer bazı popüler matrisler için etkilidir. Örneğin, gelişmiş α-siklodekstrin (α-CD) thap ve α-siyano-4-hidroksisinamik düşük sıcaklıkta Örnek Kurutma koşulları altında matriks olarak asit (CHCA) sinyal homojenliği için en son rapor edilmiştir. 14 değişen bir örnek plakası dezavantajı sıcaklık yöntemi nedeniyle, düşük sıcaklıklarda uzun bir numune kuruma süresi, yüksek verimli analizi için şu anda uygun olmasıdır.

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.1 In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.
The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.9 Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.
Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.13 If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.14
In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Detergent powder</td>
			<td style="width:157px;">Alconox</td>
			<td style="width:139px;">242985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:157px;">Merck</td>
			<td style="width:139px;">106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:157px;">Merck</td>
			<td style="width:139px;">100003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T64602&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bradykinin fragment (1-7)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">B1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Maltotriose</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">47884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:157px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:139px;">17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:157px;">Axygen</td>
			<td style="width:139px;">MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Milli-Q water purification system</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;">ZMQS6VFT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powder-free nitrile gloves</td>
			<td style="width:157px;">Microflex</td>
			<td style="width:139px;">SU-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">600 mL beaker</td>
			<td style="width:157px;">Duran</td>
			<td style="width:139px;">2110648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:157px;">Delta</td>
			<td style="width:139px;">DC300H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hygrometer</td>
			<td style="width:157px;">Wisewind</td>
			<td style="width:139px;">5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nitrogen gas flowmeter</td>
			<td style="width:157px;">Dwyer</td>
			<td style="width:139px;">RMA-6-SSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">K-type thermocouples</td>
			<td style="width:157px;">Digitron</td>
			<td style="width:139px;">311-1670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Select BioProducts</td>
			<td style="width:139px;">Force Mini&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette</td>
			<td style="width:157px;">Rainin</td>
			<td style="width:139px;">pipet-lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Temperature controllable drying chamber</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">MALDI-TOF stainless steel sample target</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of homogeneous maldi samples for quantitative applications

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Parlak alan görüntüleri ve örnek plakası 5 sıcaklığı ve 25 ° C ile hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) MS Fotoğraflar, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Sodiated maltotrioz, iyon sinyali esas olarak doldurulur halinde örnek alanın çevresine 25 ° C lik bir örnek plakası sıcaklığı hazırlandığında. 5 ° C&#39;ye örnek plaka sıcaklığı düşürerek, sinyal homojen tüm numune alanı üzerinde doldurur. 5 ° C&#39;nin altında örnekleri hazırlamak tek fark olumsuz 25 ° C&#39;nin altında hazırlanan numunelerin daha fazla çatlak olmasıdır. protonlanmış bradikinin fragmanı (1-7) iyon görüntüsü sodiated maltotrioz gibi benzer bir eğilim gösterir. MS görüntüleme sonuçları daha düşük bir örnek plaka sıcaklığı altında örnekleri hazırlamak önemli ölçüde molekülleri yeniden dağıtmak ve heterojenitesini azalttığını göstermektedir. <p class="jove_content" fo:keep-toDeneysel sonuçlara dayanarak gether.within sayfa = &quot;1&quot;&gt;, istatistiksel analizler, 5 ° C lik bir örnek plakası sıcaklığı altında elde edilen iyon sinyallerinin heterojenlik 25 ° C nin altında olduğu ile ilgili olarak% 60-80 azalttığını göstermektedir. Şekil 3, 5 ve 25 ° C numune levhası sıcaklıklarında elde maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) için istatistiksel analizlerin sonuçlarını göstermektedir. Her numune için, ortalama yoğunluk normalleştirilir. 25 ° C bir numunesi plakası sıcaklığı sodiated maltotrioz durumunda, merkezlerinde sinyal yoğunlukları 5 ° C Örnek plakası sıcaklığı çok daha düşüktür. 5 ° C, 25 örnek plakası sıcaklık azalması sırasında protonlanmış bradikinin fragmanı (1-7) &#39;in sonucu daha az değişimini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54409/54409fig1.jpg" /> Şekil 1: Örnek kurutma sisteminin resmi.Kurutma odası akrilik yapılmıştır. odası düşük nispi nem durumunu korumak için oda sıcaklığında azot gazı ile temizlenmiştir. programlanmış sabit sıcaklık su sirkülatör ile donatılmış bir bakır taban bloğu paslanmaz çelik örneği levhaların ısı derecesini ayarlamak için kullanılır. Termometreler hava, bakır taban bloğu izlemek ve örnek plaka. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54409/54409fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54409/54409fig2.jpg" /> Şekil 2:. Daha iyi sinyal homojenlik düşürülmesi örnek plaka sıcaklığı sonuçları parlak bir alan görüntüler (üst resim) yanı sıra maltotrioz (a) ve bradikinin fragmanı (1-7) MALDI görüntüleri (alt resim), (b) Thap ile hazırlanan farklı bir örnek plaka sıcaklıklarda. MALDI<html> sırasıyla, toplam spektrum: ve protonlanmış bradikinin fragmanını (1-7) (757, m / z): Çıkan sodiated maltotrioz (527, m / z) çekilmesi ile elde edilmiştir. Iyon görüntülerin piksel boyutu 35 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54409/54409fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54409/54409fig3.jpg" /> Şekil 3: Sinyal varyasyon örnek plaka sıcaklığı gibi azaltan kurutma işlemi sırasında azalır MALDI görüntüleri maltotrioz (a) ve bradikinin fragmanı (1-7), (b) farklı numune plaka sıcaklıklarda Thap ile hazırlanan ile elde edilir.. Kırmızı ve mavi veriler, sırasıyla 25 ve 5 ° C Örnek plaka sıcaklığına hazırlanan örnek göstermektedir.g &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek ısıtıcı sıcaklığı (° C) </td><td> Örnek </td><td> Hava Sıcaklığı (° C) </td><td> Bağıl Nem (RH%) </td><td> Kuruma Süresi (sn) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 5 </td><td> Thap ile maltotriozdur </td><td rowspan="2"> 20 ± 3 </td><td rowspan="4"> &lt;25 </td><td rowspan="2"> 800 - 1000 </td></tr><tr><td> Thap olan bradikinin parçası (1-7) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 25 </td><td> Thap ile maltotriozdur </td><td rowspan="2"> 25 ± 3 </td><td rowspan="2"> 100-150 </td></tr><tr><td> Thap olan bradikinin parçası (1-7) </td></tr></tbody></table>Tablo 1: Deney parametreleri ve farklı numune plaka sıcaklıklarda kurutma koşulları.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications at JoVE.com

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Örnek Kurutma işlemleri esnasında alt-tabaka sıcaklığının ayarlanması sayesinde yöntemde MALDI kütle spektrometresi iyon sinyallerin uzaysal farklılıklarını azaltmak için bir kuralı gösterilmektedir.

Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K Görüntüleme.  Academia Sinica.  Örnek Kurutma işlemleri esnasında alt-tabaka sıcaklığının ayarlanması sayesinde yöntemde MALDI kütle spektrometresi iyon sinyallerin uzaysal farklılıklarını azaltmak için bir kuralı gösterilmektedir. 

Video: Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Biyokimya

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have developed a simple non-labeled and non-radio-isotopic method using a matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analysis for a proofreading study. Here, a DNA polymerase [e.g., the Klenow fragment (KF) of Escherichia coli DNA polymerase I (pol I) in this study] in the presence of all four dideoxyribonucleotide triphosphates is used to process a mismatched primer-template duplex. The mismatched primer is then proofread/extended and subjected to MALDI-TOF MS. The products are distinguished by the mass change of the primer down to single nucleotide variations. Importantly, a proofreading can also be determined for internal single mismatches, albeit at different efficiencies. Mismatches located at 2-4-nucleotides (nt) from the 3' end were efficiently proofread by pol I, and a mismatch at 5 nt from the primer terminus showed only a partial correction. No proofreading occurred for internal mismatches located at 6 - 9 nt from the primer 3' end. This method can also be applied to DNA repair assays (e.g., assessing a base-lesion repair of substrates for the endo V repair pathway). Primers containing 3' penultimate deoxyinosine (dI) lesions could be corrected by pol I. Indeed, penultimate T-I, G-I, and A-I substrates had their last 2 dI-containing nucleotides excised by pol I before adding a correct ddN 5'-monophosphate (ddNMP) while penultimate C-I mismatches were tolerated by pol I, allowing the primer to be extended without repair, demonstrating the sensitivity and resolution of the MS assay to measure DNA repair.

A non-labeled, non-radio-isotopic method for DNA polymerase proofreading and a DNA repair assay was developed by using high-resolution MALDI-TOF mass spectrometry and a single nucleotide extension strategy. The assay proved to be very specific, simple, rapid, and easy to perform for proofreading and repair patches shorter than 9-nucleotides.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...