This work is supported by the Genomics Research Center, Academia Sinica and the Ministry of Science and Technology of Taiwan, the Republic of China (Contract No. 104-2119-M-001-014).

הערה: פרוטוקול זה מפותח להפחתת ההטרוגניות המרחבית של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם שיטת רביב היבש. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל הכנה נפשית מראש, בתצהיר מדגם וייבוש, וניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה. הנהלים מתוארים ותיאר בפירוט רב יותר בהמשך: הכנת אכשור קד 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי פלייט לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש בכפפות ניטריל ויד-לשטוף את הצלחת מדגם בעדינות עם חומר ניקוי ומים deionized מזוקקים (DDW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצלחת המדגם עם מתנול (MeOH) ו DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת מדגם בכוס 600 מ&quot;ל ולמלא עם DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate צלחת מדגם DDW במשך 15 דקות באמבטיה קולית (200 ואט, 40 קילוהרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DDW מן הקנקן כשמילא את הכוס MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הצלחת מדגם MeOH במשך 15 דקות באמבטיה קולי (200 וואט, 40 קילוהרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפוצץ את טיפות ממס על צלחת עם גז חנקן לשמור על צלחת מדגם יבש לפני בתצהיר מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויסות טמפרטורת הייבוש הערה:. תא ייבוש הוא 35 x 20 x 45 ס&quot;מ 3 (ר x ע x ג) תא אקריליק איור 1 מציג את התמונה של מערכת ייבוש זה. החדר הוא מטוהר עם גז חנקן בטמפרטורת חדר באמצעות מד זרימת גז בקצב זרימה מתמיד כדי לשמור על מצב לחות יחסי נמוך פיקוח על ידי היגרומטר מכויל המותקן בתוך חדר הייבוש. זינוק בסיס נחושת בתא הייבוש מצויד circulator מים בטמפרטורה קבוע מתוכנת משמש כדי להתאים צלחות מדגם נירוסטה. בלוק הבסיס נחושת הוא מסוגל לווסת את טמפרטורת צלחת המדגם בין 5 ל -25 מעלות צלזיוס. הטמפרטורות של אוויר, לחסום בסיס נחושת, ואת צלחת המדגם מנוטרות על ידי צמדים מסוג K. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת במהירות לשים את צלחת המדגם על הנחושתבלוק בסיס וסוגר את הדלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני את מד זרימת הגז לקבוע את קצב זרימת החנקן עד 10 רגל מעוקב סטנדרטיים לשעה (SCFH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הלחות היחסית בתא הייבוש על ידי מד הלחות ו לכוונן את מד זרימת הגז על מנת להבטיח את הלחות היחסית היא תמיד מתחת ל -25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטר את הטמפרטורה של צלחת מדגם ידי צמדים מסוג K ולהתאים את הטמפרטורה circulator מים ידני עד שהצלחת מדגם מגיע 5 מעלות צלזיוס במשך הניסוי או בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך שליטה. הערה: כדי לייצב את צלחת המדגם בטמפרטורה מתוכננת, טמפרטורת circulator המים מוגדרת, בדרך כלל 0 עד 5 מעלות צלזיוס נמוך יותר לדוגמה שנועד. לדוגמא, כדי לשמור על 5 מעלות צלזיוס על צלחת המדגם, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של 0 עד 2 מעלות צלזיוס; כדי לשמור על צלחת המדגם ב 25 מעלות צלזיוס, הגדרת הטמפרטורה של circulator המים היא בטווח של C 23 עד 25 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא הטמפרטורות הנדרשות ואת הלחות היחסית הם הגיעו (טבלה 1) לפני בתצהיר מדגם. הערה: כל הפרמטרים כמו גם ערכי ההגדרה שלהם לתהליכי הייבוש עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מוצגים בלוח 1. הערה: בטמפרטורת צלחת נמוכה מדגם, עיבוי מים על צלחת המדגם עלול להתרחש אם את דלת החדר פתוחה במשך זמן רב. אם מי עיבוי מתרחש, לסגור את הדלת ואל להפקיד כל מדגם עליו עד עיבוי המים התייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות מטריקס אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 פתרון M Thap עם 50% אצטוניטריל (ACN): 50% בתמיסה מימית DDW. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת analytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 -4 פתרון M maltotriose עם DDW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 -5 שבר ברדיקינין M (1-7) פתרון אצטוניטריל 50%(ACN): 50% בתמיסה מימית DDW. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. הפקדה לדוגמא ייבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix 0.25 μl של פתרון 0.1 M Thap ו 0.25 μl של 10 -4 M maltotriose או 10 -5 M שבר ברדיקינין (1-7) פתרונות בתוך שפופרת microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון וורטקס המעורב במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון מעורב למשך 2 שניות (2,000 XG) לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת של חדר הייבוש, בזהירות להפקיד 0.1 μl של הפתרון על צלחת המדגם עם פיפטה ולסגור את הדלת מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה אגל המדגם להתייבש. . הערה: פעמי הייבוש נצפו בדרך כלל עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות מפורטות בטבלת 1 עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 5 מעלות צלזיוס, זמן הייבוש הממוצע הוא 800 עד 1,000 שניות; עבור טמפרטורת צלחת מדגם של 25 ° C, זמן הייבוש הממוצע הוא 100 עד 150 sEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, פתח את הדלת של חדר הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה circulator מים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס). הערה: דלג על שלב זה אם הצלחת מדגם נשמרת כל הזמן בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך תהליך הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תשואות טמפרטורת צלחת המדגם לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), להסיר את צלחת המדגם מאולם הייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מורפולוגיה הדגימה תחת סטראו 5X ולקחת תמונה בהיר שדה תמונת מצב. הערה: אם מורפולוגיה קריסטל לא צפויות כמו, יש צורך להכין מדגם חדש עם אותו ההליך. מורפולוגיה גביש אופייניות מוצגות הלוחות העליונים של איור 2. הערה: במקרים עם טמפרטורות צלחת מדגם נמוכות, כגון 5 מעלות צלזיוס, חשוב לחמם את צלחת המדגם לטמפרטורת חדר לפני שלקחת אותו מתוך חדר הייבוש. בעת הפקדת דגימות, אין להחזיק את solutio premixedn ב קצה פיפטה מעל 10 שניות. אין להשתמש פתרון premixed שוב לאחר הפקדת הדגימות. הפנלים העליונים של איור 2 מציגים תמונות בהיר שדה של דגימות מוכנות עם טמפרטורות צלחת מדגם שונות. </li></ol> 3. ניתוח נתונים ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה הערה: לאחר הכנה, המדגם ניתן לנתח באמצעות הדמיה ספקטרומטריית מסה. במחקר הנוכחי, ניסויי MS ההדמיה נערכים באמצעות TOF כפול קוטביות מסונכרנת בנוי מעבדה (DP-TOF) ספקטרומטר מסת הדמיה. 15 ספקטרומטרים המוני מסחרי MALDI-TOF עם יכולת הדמיה מתאים גם ניסויים כאלה. ספקטרומטר מסה מופעל החילוץ לינארית מצבי יון חיובי עם עיכובים החילוץ מותאם. האנרגיה הקינטית של יונים היא 20 קילו. גודל קרן הליזר הוא 35 מיקרומטר קוטר על פני השטח המדגמים, והספקטרום של כל נקודה הוא aveזעם של 5 יריות לייזר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת מדגם לתוך ספקטרומטר מסה MALDI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמית ניתוח ספקטרומטריית מסה על המדגם המוכן בצעדים 2.1-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לשיא מסת מאפיין מהרשימה המוני מוצגת בחלון התוצאה ולחץ &quot;2D&quot; לתכנן תמונת יון דו ממדים. הערה: לקבלת maltotriose מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין הם sodiated maltotriose, Thap protonated, ו sodiated Thap. עבור שבר ברדיקינין (1-7) מעורבב עם Thap, פסגות מאפיין כוללות protonated שבר ברדיקינין (1-7), protonated Thap, ו sodiated Thap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצני התאמה בחלון הקופץ כדי לקבוע את הגבולות העליונים ותחתונים של עוצמת האות ולוחץ על &quot;שמור תמונה&quot;. הגדרה זו קובעת את הניגוד של תמונות יון. הערה: בכל סט יחיד של נתונים, האזורים הסדוקים כתמי null מראים בהירות נמוכה בוטלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ולהשוות את היוןתמונה עם התמונה בהיר השדה שנלקחה בשלב 2.9. הערה: הדמיה ספקטרומטריית מסה ובניית תמונות של יונים מסוימים יכולה להיות מושגת באמצעות מכשירים מסחריים. בשל המגוון של רכישת נתונים וניתוח תוכנה, המשתמשים צריכים לפעול בהתאם להנחיות תוכנה המסופקות על ידי ספק המכשיר כדי לקבל תמונות באיכות גבוהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים הערה: ההטרוגניות של דגימות מנותחת כמותית. בהפגנה זו, כל מדגם מחולק לאזורי קונצנטריים מרובים על ידי תוכנות שפותחו באופן עצמי לנתח את הפריסה המרחבית של היונים. ניתוח המידע יכול גם להתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים עצמאית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכתמים בטל האזורים הסדוקים בתמונת היון מוצגת בחלון התוצאה להסיר אזורים בלתי חשובים. הערה: נוהל זה מגדיר את השטח החיוני של תמונת יון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;למצוא קצה&quot; על מנת למצוא את שכבת קצוני של תמונת היון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;לנכות&quot; כדי לשמור את מידע שפע יון של שכבת קצוני במסד נתונים ולהסיר שכבה זו מתמונת היון בו זמנית. תיבת סימון מייצג שכבה קצוני זה תופיע ברשימת &quot;נתוני תפוקה&quot; של חלון התוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2.2 ו 3.2.3 עד מרכז התמונה יון מוגדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ובחר את כל תיבות הסימון ברשימה &quot;נתוני תפוקה&quot; ולחץ על &quot;יצוא&quot; כדי לייצא את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הנתונים המיוצאים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את שפע יון הממוצע של כל השכבה כדי להשיג את המידע הפריסה המרחבית של יונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons.">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption.">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li><li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry.">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li><li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry.">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li><li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate.">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops.">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Hu, J. -. B., Chen, Y. -. C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry:+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation.">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li><li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions.">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li><li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop:+A+Numerical+and+Experimental+Study.">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020 (2009).</li><li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop.">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li><li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , 305-361 (1994).</li><li>Lai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation.">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li><li>Hsiao, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation.">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li><li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots.">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li><li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting.">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

בהתבסס על תחזיות תיאורטיות קודמות, תזרים הידרודינמית מושרה טמפרטורה בתוך טיפות יכול להתגבר החוצה תזרים נימי מושרה על ידי אידוי ממס. היעילות של סחרור פנימי כזה של מולקולות מוגברות כאשר הטמפרטורה הדרגתית בתוך עליית רביב. על פי התוצאות ניבא, כאשר שמירה על טמפרטורת צלחת מדגם מתחת לגיל 5 מעלות צלזיוס תוך שמירה וסביבתה בטמפרטורת הסביבה, המהירות הממוצעת של תזרימי סחרור בתוך רביב הוא בערך 4 פעמים מהר יותר מזו של תזרימי נימי כלפי חוץ. אם טמפרטורת צלחת מדגם זהה הסביבה, המהירות הממוצעת של תזרים סחרור היא 1,800 פעמים לאט יותר את זרימת נימים כלפי חוץ. תוצאות חישוב זה עולה כי הירידה בטמפרטורה צלחת מדגם במהלך הכנת המדגם הוא יתרון. התצפיות הניסיוניות מסכימות עם התחזית הזאת. מזג צלחת המדגםature צריכה להיות מבוקרת בדיוק ברחבי הכנת מדגם תהליך. טבלת 1 מראה את זמן ייבוש אגל הטיפוסי עם 0.1 μl של מדגם בטמפרטורות צלחת מדגם שונות. לפני הפקדת פתרון מדגם על הצלחת, חשוב להבטיח כי פני צלחת מדגם יבשות. אם עיבוי מים מתרחש בעת הכנת דגימות תחת טמפרטורות נמוכות, בתצהיר של הפתרון המדגם אינו מומלץ בגלל מים מרוכזים מגדיל אזורים מדגמים ו מדללים פתרונות. לכן, חשוב לשמור על הלחות היחסית של הייבוש מתחת ל -25%. בנוסף, בעת הכנת דגימות תחת טמפרטורות נמוכות, צלחת המדגם צריכה להיות חמה עד לטמפרטורת חדר לפני לוקח אותו אל מחוץ לתא הייבוש. למרות עיבוי מים קלים לאחר השלמת התגבשות מדגם אינו משנה את אוכלוסיית המדגם, עיבוי משמעותי יש להימנע. שימוש פתרונות מעורבבים מראש טריים הוא מלמְתוּקָן. לאחר הפתרונות premixed נחשפים לאוויר, מראש crystallizations של הפתרונות מדגם להתרחש ואת גודל ומורפולוגיה קריסטל הסופי עשוי להשתנות. לכן, הנוהל pipetting צריך להתבצע ביעילות סבירה, בדרך כלל תוך 10 שניות, כדי למנוע את אגל המדגם מ-התגבשות מראש בתוך קצה פיפטה. מומלץ להתבונן מורפולוגיה דגימה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח מורפולוגיה קריסטל מתאימות מיוצרות לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה. אם מורפולוגיה הקריסטל אינן טובות כמו כצפוי, חזרה על התהליך בתצהיר לפי צורך. על פי המחקרים תיאורטיים וניסיוניים שלנו, הכנת דגימות עם צלחת מדגם בטמפרטורה נמוכה המותקנת בתנאי סביבה משפרת את שחזור נתונים מאוד ואיכות MALDI-MS. ניסויים מאוחרים יותר גם להראות שיפור משמעותי של עוצמת אות עם שיטת הכנת מדגם זה. נתוני הניסוי מתקבלים על ידי tשיטתו משמעותית לשפר את המהימנות של ספקטרה המונית MALDI עבור ניתוחים כמותיים. לשם השוואה עם שיטות אחרות הקשורות רכב תמיסות או שינויים ברכוש שטח, תנאי ייבוש משתנה 8,16-18 פשוט וישים באופן כללי יותר עבור דגימות קונבנציונליות. לפיכך, רוב המשתמשים ספקטרומטריית מסה יכולים ליהנות ממנו ביישומים רגילים. שיפור ההומוגניות אות MALDI עם טמפרטורה יורד צלחת מדגם יעיל גם כמה מטריצות פופולריות אחרות. לדוגמה,-cyclodextrin α משופרת (α-CD) הומוגניות אות עם Thap ו α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) כמו מטריקס בתנאים ייבוש מדגם בטמפרטורה נמוכה דווחה לאחרונה. 14 החיסרון עם צלחת מדגם שינוי הטמפרטורה היא שהשיטה אינה מתאימה כיום לניתוח תפוקה גבוהה עקב זמן ייבוש מדגם הארוך בתנאים בטמפרטורה נמוכה.

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.1 In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.
The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.9 Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.
Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.13 If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.14
In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Detergent powder</td>
			<td style="width:157px;">Alconox</td>
			<td style="width:139px;">242985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:157px;">Merck</td>
			<td style="width:139px;">106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:157px;">Merck</td>
			<td style="width:139px;">100003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T64602&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bradykinin fragment (1-7)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">B1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Maltotriose</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">47884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:157px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:139px;">17005091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:157px;">Axygen</td>
			<td style="width:139px;">MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Milli-Q water purification system</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;">ZMQS6VFT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powder-free nitrile gloves</td>
			<td style="width:157px;">Microflex</td>
			<td style="width:139px;">SU-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">600 mL beaker</td>
			<td style="width:157px;">Duran</td>
			<td style="width:139px;">2110648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:157px;">Delta</td>
			<td style="width:139px;">DC300H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hygrometer</td>
			<td style="width:157px;">Wisewind</td>
			<td style="width:139px;">5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nitrogen gas flowmeter</td>
			<td style="width:157px;">Dwyer</td>
			<td style="width:139px;">RMA-6-SSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">K-type thermocouples</td>
			<td style="width:157px;">Digitron</td>
			<td style="width:139px;">311-1670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Select BioProducts</td>
			<td style="width:139px;">Force Mini&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette</td>
			<td style="width:157px;">Rainin</td>
			<td style="width:139px;">pipet-lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Temperature controllable drying chamber</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">MALDI-TOF stainless steel sample target</td>
			<td style="width:157px;">this lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of homogeneous maldi samples for quantitative applications

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

<html> התמונות בהיר השדה כמו גם תמונות MS של שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 5 ו -25 ° C מוצגות באיור 1. במקרה של maltotriose sodiated, אות היון בעיקר מאכלס בשולי שטח המדגם כאשר הוא מוכן עם טמפרטורת צלחת מדגם של 25 מעלות צלזיוס. ובאמצעות קטנה הצליחה טמפרטורה המדגמת עד 5 מעלות צלזיוס, האות מאכלס בצורה הומוגנית על פני שטח המדגם. החסרון הבולט היחיד בעת הכנת דגימות תחת 5 מעלות צלזיוס הם שיש יותר סדקים מאשר הדגימות אשר הוכנו על פי 25 מעלות צלזיוס. תמונת היון של שבר ברדיקינין protonated (1-7) מראה מגמה דומה למדי לאלו של maltotriose sodiated. תוצאות הדמית MS מראות כי הכנת דגימות תחת טמפרטורת צלחת מדגם נמוכה יכולה באופן משמעותי מחדש את המולקולות ולהפחית ההטרוגניות. gether.within-page = &quot;1&quot;&gt; בהתבסס על תוצאות הניסוי, ניתוחים סטטיסטיים מראים כי ההטרוגניות של אותות יון שהושגה לפי טמפרטורת צלחת מדגם של 5 ° C מפחיתה ידי 60-80% ביחס לאותו מתחת לגיל 25 מעלות צלזיוס. איור 3 מציג את התוצאות של ניתוחים סטטיסטיים עבור שבר maltotriose ו ברדיקינין (1-7) מוכנים בטמפרטורות צלחת מדגם של 5 ו -25 מעלות צלזיוס. עבור כל דגימה, עוצמת הממוצע היא מנורמלת. במקרה של maltotriose sodiated עם טמפרטורת צלחת מדגם של 25 מעלות צלזיוס, עוצמות האות במרכזים הם נמוכות בהרבה מאלו עם טמפרטורת צלחת מדגם של C ° 5. התוצאה של שבר ברדיקינין protonated (1-7) גם מראה פחות וריאציה כאשר יורדת הטמפרטורה צלחת מדגם מתוך 25 ° 5 צ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54409/54409fig1.jpg" /> איור 1: תמונה של מערכת ייבוש מדגם.תא הייבוש עשוי אקרילי. החדר הוא מטוהר עם גז חנקן בטמפרטורת החדר כדי לשמור על מצב לחות יחסית נמוכה. זינוק בסיס נחושת מצויד circulator מים בטמפרטורה קבוע מתוכנת משמש כדי לווסת את הטמפרטורה של צלחות מדגם נירוסטה. המדחום לפקח אוויר, גוש בסיס נחושת, ואת צלחת המדגם. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54409/54409fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54409/54409fig2.jpg" /> איור 2:. הורדת מדגם תוצאות טמפרטורת צלחת ההומוגניות אות חזקה יותר דימויי השדה הבהירים (תמונות עליונות), כמו גם את תמונות MALDI (תמונות קטנות) של maltotriose (א) ו- שבר ברדיקינין (1-7) (ב) מוכן עם Thap בטמפרטורות צלחת מדגם שונות. MALDI<html> התמונות התקבלו על ידי חילוץ maltotriose sodiated (m / z: 527) ו שבר ברדיקינין protonated (1-7) (m / z: 757) מהספקטרום הכולל, בהתאמה. גודל פיקסל של תמונות היון הוא 35 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54409/54409fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54409/54409fig3.jpg" /> איור 3: וריאצית איתותים מפחיתה טמפרטורת מדגם צלחת פוחתת במהלך תהליך ייבוש תמונות MALDI מתקבלות עם maltotriose (א) ו- שבר ברדיקינין (1-7) (ב) מוכן עם Thap בטמפרטורות צלחת מדגם שונות.. האדום ונתונים כחולים מצביעים על המדגם המוכן בטמפרטורת צלחת מדגם של C ° 25 ו -5 בהתאמה.<html> &quot;Target =&quot; g _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טמפרטורת פלייט מדגם (° C) </td><td> לִטעוֹם </td><td> טמפרטורת האוויר (מעלות צלזיוס) </td><td> לחות יחסית (% לחות יחסית) </td><td> זמן ייבוש (sec) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 5 </td><td> maltotriose עם Thap </td><td rowspan="2"> 20 ± 3 </td><td rowspan="4"> &lt;25 </td><td rowspan="2"> 800 - 1,000 </td></tr><tr><td> שבר ברדיקינין (1-7) עם Thap </td></tr><tr><td rowspan="2"> 25 </td><td> maltotriose עם Thap </td><td rowspan="2"> 25 ± 3 </td><td rowspan="2"> 100 - 150 </td></tr><tr><td> שבר ברדיקינין (1-7) עם Thap </td></tr></tbody></table>בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 1: פרמטרים ניסיוניים ותנאי ייבוש בטמפרטורות צלחת מדגם שונות.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications at JoVE.com

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם.

הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K Views.  Academia Sinica.  פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם. 

Video: Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have developed a simple non-labeled and non-radio-isotopic method using a matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analysis for a proofreading study. Here, a DNA polymerase [e.g., the Klenow fragment (KF) of Escherichia coli DNA polymerase I (pol I) in this study] in the presence of all four dideoxyribonucleotide triphosphates is used to process a mismatched primer-template duplex. The mismatched primer is then proofread/extended and subjected to MALDI-TOF MS. The products are distinguished by the mass change of the primer down to single nucleotide variations. Importantly, a proofreading can also be determined for internal single mismatches, albeit at different efficiencies. Mismatches located at 2-4-nucleotides (nt) from the 3' end were efficiently proofread by pol I, and a mismatch at 5 nt from the primer terminus showed only a partial correction. No proofreading occurred for internal mismatches located at 6 - 9 nt from the primer 3' end. This method can also be applied to DNA repair assays (e.g., assessing a base-lesion repair of substrates for the endo V repair pathway). Primers containing 3' penultimate deoxyinosine (dI) lesions could be corrected by pol I. Indeed, penultimate T-I, G-I, and A-I substrates had their last 2 dI-containing nucleotides excised by pol I before adding a correct ddN 5'-monophosphate (ddNMP) while penultimate C-I mismatches were tolerated by pol I, allowing the primer to be extended without repair, demonstrating the sensitivity and resolution of the MS assay to measure DNA repair.

A non-labeled, non-radio-isotopic method for DNA polymerase proofreading and a DNA repair assay was developed by using high-resolution MALDI-TOF mass spectrometry and a single nucleotide extension strategy. The assay proved to be very specific, simple, rapid, and easy to perform for proofreading and repair patches shorter than 9-nucleotides.

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...