This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.

Bütün deneyler Laboratuvar hayvanlarında 16 Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi National Institutes of Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre gerçekleştirilmiştir. Not: Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde tutulmuştur kullanımı, düşük bağlanma santrifüj tüpleri aşağıdaki tüm adımları. Doku Koleksiyonu önce 1. Hazırlık <ol><li> 4 o C santrifüj ayarlayın </li><li> Yangın lehçe azalan yaklaşık 1.3 çapları, 0.8, ve her bir numune için 0.4 mm üç cam Pasteur pipetler bir dizi. </li><li> Soğuk Tampon A 1 ml içeren etiketli 1.7 ml-tüpler hazırlayın ve buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Matris, spatula ve diseksiyon gerçekleştirmek için cam plakalar (ya da ters cam Petri kabı) dilimleme beyin içeren bir buz tepsisi hazırlayın. t dokunma bütün aletleri kuru cam plakalar ve kullanım dokuları kağıt üzerinde ön soğuk iki veya daha fazla tıraş bıçağıkonu. </li><li> Doku toplanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enzim solüsyonu çözülme. </li></ol> 2. Doku Toplama ve Diseksiyon <ol><li> Doku toplamadan önce davranışsal ya da farmakolojik tedavi 90 dakika başlatın. NOT: Burada gösterilen sonuçlar için, yeni bir ortama (test koşulu) ve naif sıçanlarda fareler üzerinde 5 mg / kg metamfetamin akut periton enjeksiyonlar evlerinde kafeslerde (kontrol koşulu) muhafaza yapıldı. </li><li> Doymuş izofluran ile bir cam kurutucu kavanoza koyarak sıçan anestezisi ve sıçan 30 decapitate - 60 sn sonra bir giyotin kullanarak. kafa deri ve kas çıkarın ve kafatası açığa çıkarmak için makas kullanın. kafatası kesti ve foramen magnum açmak ve kafatasının arka kısmı kaldırmak için rongeurs kullanın. beyin ortaya çıkarmak için kafatasının üst kenarları boyunca kesmek için rongeurs kullanın. beyin zarar vermemek için dikkatli olun. nazikçe bir altında kepçe için küçük bir spatula kullanınbeyin yükseltmek d. Beyin yükseltmek ve beyin 17 serbest kalıncaya kadar sinirleri kesti. </li><li> Jilet kullanarak doku teşrih. NOT: Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak doku örneklerinin elde edilmesi: (2.3.1) taze disseke doku; diseksiyonu sonrası (2.3.2) dondurulmuş doku; veya (2.3.3) dondurulmuş doku dondurulmuş tüm beyin disseke. Diseksiyon boyunca beyin dilimleme matrisi, jilet ve cam plaka kuru tutun ve yoğunlaştırılmış su gibi süreçleri kıyma hücrelerin hipotonik lizizi yol açabilir. Doğru diseksiyon sağlamak için gözlük büyüteç kullanın. <ol><li> Taze parçalara doku için, buz üzerinde soğutulmuş olan bir beyin dilimleme matrisi (1 mm aralıklarla traş makinesi bıçaklarının yuvaya sahip bir fare beyni şeklinde bir metal kalıp) içine yeni çekilmiş beyin yerleştirin. Çevrede beyin bölgesini (ler) ihtiva koronal dilimleri kesmek için yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş Jilet yerleştirin. soğutulmuş cam plaka üzerinde kesik dilimler yerleştirin. Not: beyin regio teşrihsoğutulmuş cam plaka üzerinde ilgi ns. </li><li> Diseksiyon sonra dondurulmuş doku için, 2.3.1, yukarıda tarif edilene benzer yeni çekilmiş beyin, dilim ilgi beyin bölgesi (ler) incelemek. bir mikrotüp içine disseke doku yerleştirin ve hızla 20 saniye boyunca -40 ºC izopentan içinde mikrotüp daldırarak doku dondurma. fazla işlem kadar -80 ºC derin dondurucuda her zaman dondurulmuş doku disseke tutun. </li><li> Dondurulmuş doku için, hemen 6 aya kadar -80 ° C&#39;de mühürlü bir torba içinde -40 ºC isopentane ve mağaza yeni çekilmiş beyin dondurmak. <ol><li> Diseksiyon gününde, yaklaşık ayarlanmış bir kriyostat içinde donmuş beyin koyun -20 ºC (hayır sıcak -18 den ºC) yaklaşık 2 saat boyunca sıcaklığını dengelemek için. NOT: çok soğuk sıcaklıklar güvenli kesilecek beyin çok kırılgan yaparken Brain, bu sıcaklıkta kolaylıkla kesilebilir. </li><li> 2 mm koronal dilim - 1 kesmek için jilet kullanınBir kriyostat içinde donmuş beyinleri. donma koşulları altında bu dilim doku yumruklar elde etmek için bir körelmiş 12- 16-gauge iğne kullanın. daha fazla işlem kadar her zaman dondurulmuş doku disseke tutun. </li></ol></li></ol></li><li> kıyma önce disseke doku kapsayacak şekilde Tampon A 2 damla - 1 ekleyin. toz haline getirme işleminin geri kalanı boyunca nöronların kaybını önlemek için iki Jilet kullanarak dokudan beyaz maddenin en kaldırın. Dondurulmuş doku ile başlayan, sonra doku tamponu çözeltisi uygulanmadan önce en fazla 1 dakika boyunca soğuk bir cam plaka üzerine çözülme sağlar. </li><li> soğutulmuş bir cam plaka üzerine bir jilet ile dokuya her ortogonal yönde 100 kez kıyma. kıyma zaman cam plaka dikey jilet tutun. NOT: Kapsamlı kıyma tüm protokol adımları için kritik öneme sahiptir. </li><li> ke 5 kez - tüpü 3 ters çevirin soğuk Tampon A 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpler içine kıyılmış doku aktarmak için Jilet kullanınçözelti içinde tüm kıyılmış doku ep. </li></ol> 3. Hücre Ayrılma NOT: Aşağıdaki adımların tümünü karıştırma ucuna kullanın nazik sonu. Bir girdap karıştırıcı kullanın ve hücre hasarına neden hava kabarcıkları kaçının. <ol><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika süreyle 110 xg&#39;de örnek tüplerini santrifüj. Süpernatantı atın. Yavaş yavaş mikrotüp iç duvar aşağı soğuk taze çözülmüş enzim solüsyonu (proteolitik enzimlerin bir karışımını ihtiva eden) bir 1 ml. Hemen kıyılmış doku pelet dağıtmak için bir orta büyük uç çapı pipet ile sadece 4 kez yukarı pipet ve yavaşça tüm pelet emmek ve. </li><li> Alt yapışmasını pelet önlenmesi ve 4 O ° C&#39;de 30 dakika boyunca son aşırı uç karıştırma ile örnekleri inkübe hemen mikrotüpler Invert </li><li> Enzimatik Doku sindirimi sonra, santrifüj 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 960 xg&#39;de borular. Süpernatantı ve soğuk tampon A immediatel 0.6 ml ilavey Tampon A ekledikten sonra, aşağı 5 kez tüm pelet emme pelet dağıtmak için aynı pipet kullanın ve nazikçe yukarı pipet ve. </li><li> Mekanik sindirilmiş doku çiğnemek ve aşağıdaki adımları uygulayarak 15 ml tüpler toplamak. Her numune için, lateks ampul takılı yaklaşık 1.3, 0.8 ve 0.4 mm çapları azalan 3 yangın cilalı cam Pasteur pipetler ayrı bir kümesi kullanın. <ol><li> Yavaşça her bir numune 1.3 mm cam pipet ile 10 kez çiğnemek. Numune (dibe olacak enkaz ve ayrışmamış hücreler) buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. 15 ml konik tüp süpernatant (~ 0.6 ml) ve transfer toplayın (tüp # 1). </li><li> Kalan pelet bir çözeltisi ml Tampon 0.6 ekleyin. örneklemin 0.8 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. Aynı 15 ml supernatant (~ 0.6 mi) ve transfer toplamak konik tüp # 1. </li><li> Kalan Pelle A çözüm ml Tampon 0.6 Eklet. örneklemin 0,4 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. (Non-ayrışmış hücreleri ile pelet dokunmadan ~ 0.6 ml) ve aynı 15 ml konik tüp içerisinde 1. transfer süpernatant toplayın. NOT: Aşağıdaki toz haline getirme adımları için tüp 1. 0,4 mm çaplı pipet tutun. </li><li> Adımı tekrarlayın 3.4.3 ayrı 15 ml konik tüp içine üç tane daha küçük cam pipet (~ 0.4 mm çap) kullanılarak kez ve süpernatant toplamak (tüp # 2). </li><li> 0,4 mm cam pipet kullanarak 10 daha fazla kez tüpler # 1 ve # 2 toplanan hücre süspansiyonları çiğnemek ve buz üzerinde tutmak. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Sabitleme ve Permeabilization <ol><li> % 100 soğuk etanol 800 ul ekleyerek (tüp # 2 hücreleri için tüp # 1 hücreleri için iki mikrotüpleri ve iki) numune başına 4 mikrotüpleri hazırlayın Her tüpe (kullanımdan önce -20 o C&#39;de saklanır) ve buz üzerinde saklayın . Not: Nihai etanolkonsantrasyon% 50 olacaktır. </li><li> Pipet ~ 800 soğuk etanol ihtiva eden 4 tüpün her birine (tüp # 1 ve boru # 2) hücre süspansiyonları ul numune karıştırmak için tüpler ters. </li><li> tüpler her 5 dakika ters çevirici kadar 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> sabitleme / permeabilization sonra, 4 ° C&#39;de 4 dakika boyunca 1.700 xg&#39;de tüpler santrifüj ve supernatant atın. hücre kaybını önlemek için bir çözüm 50 ul bırakın. NOT: Bu aşamada pelet beyaz ve permeabilization daha önce tüplerin duvarına daha az sopa. Bu nedenle, hiçbir pelet olduğu yerde mikrotüpte duvarını dokunarak dikkatlice süpernatant kaldırmak ve yavaş yavaş bir mikropipet kullanarak süpernatant hazırlar. </li></ol> 5. Hücre Filtrasyon <ol><li> aşağıdaki gibi soğuk PBS ile adım 4,4 pelet yeniden askıya: <ol><li> Tüp # 1 gelen iki mikrotüplerdeki birine soğuk PBS 550 ul ekleyin ve bir orta büyük çaplı pi kullanınPette ucu hafifçe hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipet için. bir mikrotüp tüp 2. gelen için tekrarlayın aynı. </li><li> Aynı pipet kullanılarak tüp # 1 hücreleri için, ikinci bir pelet ilk hücre süspansiyonu aktarın. yavaşça kombine hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme ikinci pelletini. </li><li> Tüp # 2 hücreleri için, tekrar süspansiyon ve 5.1.2&#39;de tarif edildiği gibi peletler (örneğin, üçüncü ve dördüncü mikrotüpler) birleştirir. </li></ol></li><li> ayrı ayrı hücre süzgeçler iki farklı çift (100 um ve 40 mikron gözenek boyutları) aşağıdaki gibi kullanarak adım 5.1.2 ve 5.1.3 iki hücre süspansiyonları Filtre: <ol><li> süzgeç içine PBS eklenerek ön ıslak her hücre süzgeç. süzgeç dışından aşırı PBS kaldırmak için bir pipet kullanın. </li><li> eşit 100 mikron gözenek büyüklüğüne sahip ilk hücre süzgecinden üzerine adım 5.1.2 hücre süspansiyonu pipetle. Buz üzerinde 50 ml bir tüp içinde akış yoluyla toplayın. pi kullanınhücre süzgecinden dış yan altındaki ekli aracılığıyla Pette, akış toplamak. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden 100 mikron hücre süzgecinden gelen akış yoluyla aktarmak için aynı pipet kullanın. buz üzerinde bir 50 ml tüp bu akış yoluyla toplayın. 40 mikron hücre süzgecinden gelen akışı aktarırken, 100 mikron hücre süzgecinden gelen kirlenmesini önlemek için yeni pipet uçları değiştirin. </li><li> filtre yeni bir dizi kullanarak adım 5.1.3 hücre süspansiyonu için bu adımları yineleyin. </li></ol></li><li> Numune başına yaklaşık 1 ml &#39;lik bir son hacim, her numuneden iki akış-through birleştirin. </li></ol> Antikorlar 6. inkübasyon NOT: önce ana örneği çalıştırmak için ayarlarda sitometresinde uygun akış ayarı için çoklu kontrol örnekleri hazırlamak için beyin hücre süspansiyonları az miktar kullanın. Her bir antikor etiketleme için, herhangi bir antikor, sadece kendisini de içine kontrol örnekleri hazırlamakDaha sonra condary antikoru (ya da diğer floresan etiket), ve her ikisi de birincil ve ikincil antikorlar (ya da diğer floresan etiket). Akış sitometresindeki spesifik olmayan etiketleme karşı spesifik ayrı kapıları ayarlamak için bu denetimleri kullanın. Mümkün olduğunda, tazminat gerekmez fluorochromes kullanın. , birincil antikorlar ilave edilmeden PBS eklenerek 700 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar yolluk kontrol örnekleri nihai hacmi arttırır. <ol><li> 1,7 mL&#39;lik bir mikro filtre hücre 100 ul numune aktarılarak ışık saçılma ve DAPI kontrol örneği hazırlayın. çekirdek boyama için 1 ug / ml DAPI ile soğuk PBS 600 ul ekle. sonu aşırı uç karıştırma ile 10 dakika süre ile inkübe ve (adım 6.4.5 6.4.2 de gösterildiği gibi) akış sitometresi boyunca geçirilmeden önce yıkayın. Not: Bu örnek sadece FACS makinede kalan hücrelerin sıralama önce hücre / çekirdekler kapısı ayarlamak için kullanılır. </li><li> 100 &amp; # aktararak tek imüno kontrol örnekleri hazırlayın181; 1.7 mi mikrotüp filtre hücrelerin l. (Örneğin, NeuN antikoru) bir antikor ile soğuk PBS 600 ul ekle. Başka bir antikor (örneğin, Fos antikoru) bir mikrotüp soğuk PBS 600 ul ekle. Bu doğrudan konjüge edilmiş primer antikor değilse gelen ikincil antikor ekleyin. NOT: Bu numuneler uygun photomultiplier tüp (PMT) voltajı belirlemek için, ve gerekirse iki floresan sinyallerin çakışmasını değerlendirmek için kullanılır. Antikor konsantrasyonu tüm kanallarda iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için titre edilmelidir. Çakışan floresan sinyalleri de akış sitometresi içinde farklı floresan kanalların iç kalibrasyon telafi edilebilir. </li><li> 1,7 mL&#39;lik bir mikro filtre 100 ul hücre aktarılarak, çift flüoresan etiketli negatif kontrol numunesi hazırlanır. Tek başına ikincil antikorlar veya IgG doğrudan konjuge primer antikorlar ile soğuk PBS 600 ul ekleyin. NOT: This kontrol numunesi her fluorofor için background fîoresanını tespit etmek sıralamadan önce her kullanılabilir. </li><li> Ana örnek hazırlayın sıralanacak. <ol><li> 1.7 ml&#39;lik mikrotüp içine süzülmüş hücrelerin 700 ul aktarın. Birincil NeuN antikorun Fikoeritrin (anti-NeuN-PE) ile doğrudan konjüge edilmiş: Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) ve 1.4 ul (500 1) ile doğrudan konjüge edilmiş primer Fos antikorun: 7 ul (100 1) ekleyin. sonu aşırı uç karıştırma ile 4 ° C &#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İnkübasyonun sonunda, ana numunesi ve kontrol örnekleri dahil olmak üzere, her bir mikrotüp soğuk PBS 800 ul ve çevirerek karıştırın. </li><li> Santrifüj mikrotüpler 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1.300 xg&#39;de. hücre kaybını önlemek için 50 ul süpernatant bırakarak süpernatant atın. </li><li> orta derecede büyük bir uç çapı olan bir pipet kullanılarak pelet ve tekrar süspansiyon hücreleri soğuk PBS 1 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1.300 xg&#39;de santrifüj. Dsüpernatant iscard. </li><li> Yeniden askıya 500 ul pelet soğuk PBS (son hacim pelet büyüklüğü bağlı ayarlayın). </li><li> Aktarım ve hücre süzgecinden kap (40 um) olan bir yuvarlak dipli FACS deney tüpüne süspansiyonu filtre edin. buz üzerinde immunolabeled hücreleri tutun ve hemen FACS gerçekleştirin. Not: filtreleme için, süzgeç kapağı dikey pipet dokunun ve bunun üzerinden hücre süspansiyonu itin. </li></ol></li><li> Kontrol örnekleri kullanılarak kapıları sitometresinde Set akışı. <ol><li> Toplam olaylar ve hücresel enkaz nöronal hücre popülasyonunu belirlemek için ışık saçılması ve DAPI kontrol örneği kullanın. NOT: - Toplam olaylar (dinlenme enkaz ve kırık hücresel süreçlerdir)% 2 bu hazırlık Hücre gövdeleri sadece 1 bulunmaktadır. DAPI floresan sinyal (işaret çekirdekleri) ve İleri dağılım (hücrenin boyutu) dayanarak geriye Vadeli İşlem ve Side dayalı hücre gövdeleri ve kapıyı bulmak mümkün özelliklerini ışık saçılmasıhücreleri (Şekil 1 A, B, &#39;de gösterildiği gibi). </li><li> PMT voltaj ayarlarını belirlemek için, ve başka bir filtre / kanal (örneğin, Alexa Fluor 488 / FITC veya Phycoerythrine) içine belirli bir florokrom emisyon avantajını analiz etmek tek imüno kontrol örnekleri kullanın. floresan sinyalleri çakışırsa, elle tazminat seviyelerini ayarlayarak üst üste düzeltin. </li><li> Pozitif nüfus eşiğini ayarlamak için çift floresan etiketli negatif kumandayı kullanın. NOT: Bu örnekte gelen sinyali pozitif olarak kabul edilebilir otomatik floresans ve bu eşiğin üzerinde yer alan ana örnek hücrelere bağlı olduğu düşünülmektedir. Tipik olarak, sıralama için eşik parametreleri daha sıkı ve yaklaşık negatif kontrol yukarıda işaretli hücrelerin üst 2/3 aslında sıralanır vardır. </li></ol></li><li> 1.7 mi mikrotüpler içine FACS ile ana numuneden kriteri nöronlar. RNA 50 ul içine hücreleri toplamakekstraksiyon tamponu. Sıralama girdap ve santrifüj tüpü ve tüpün duvarlarına tüm sıralanmış hücreleri kurtarmak için aşağı 10 kere yukarı ve aşağı pipetleme süspansiyonu karıştırmak sonra. </li><li> Tüm hücreler, RNA ekstraksiyonu önce lize sağlamak, ve daha sonra 4 ° C &#39;de 2 dakika boyunca 2.800 x g&#39;de santrifüj 30 dakika boyunca 42 ° C&#39; de sıralanmış hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> Daha önce 13-15 açıklandığı gibi, RNA izolasyonu, cDNA sentezi, hedef gen ön büyütme ve qPCR için örnek işlemek hemen -80 ° C&#39;de uzun süreli depolama için bir RNaz ücretsiz tüp süpernatantı aktarın veya. </li></ol>

<ol>
	<li>Bossert, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+medial+prefrontal+cortex+neuronal+ensembles+mediate+context-induced+relapse+to+heroin.">Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin.</a> Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).</li><li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleus+accumbens+shell+neuronal+ensembles+in+context-induced+reinstatement+of+cocaine-seeking.">Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking.</a> J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).</li><li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+orbitofrontal+cortex+neuronal+ensembles+in+the+expression+of+incubation+of+heroin+craving.">Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving.</a> J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).</li><li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+cocaine-activated+nucleus+accumbens+neurons+prevents+context-specific+sensitization.">Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization.</a> Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).</li><li>Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+c-fos+to+study+neuronal+ensembles+in+corticostriatal+circuitry+of+addiction.">Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction.</a> Brain Research. 1628, 157-173 (2015).</li><li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+cell+sorter.">Spectrophotometric cell sorter.</a> Science. 156, 1364-1365 (1967).</li><li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometer:+new+instrument+for+ultrarapid+cell+analysis.">Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis.</a> Science. 150, 630-631 (1965).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons.">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).</li><li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking.">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124, 100-108 (2013).</li><li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+a+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS).">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128, 173-185 (2014).</li><li>Rubio, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-induced+reinstatement+of+methamphetamine+seeking+is+associated+with+unique+molecular+alterations+in+Fos-expressing+dorsolateral+striatum+neurons.">Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons.</a> J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incubation+of+methamphetamine+craving+is+associated+with+selective+increases+in+expression+of+Bdnf+and+trkb,+glutamate+receptors,+and+epigenetic+enzymes+in+cue-activated+fos-expressing+dorsal+striatal+neurons.">Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons.</a> J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).</li><li>US National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).</li><li>Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daun02+inactivation+of+behaviourally-activated+Fos-expressing+neuronal+ensembles.">Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles.</a> Current Protocols. , (2016).</li><li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+technologies+for+examining+the+role+of+neuronal+ensembles+in+drug+addiction+and+fear.">New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).</li><li>Mardones, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plasma+membrane+permeabilization+by+freeze-thawing+and+immunofluorescence+epitope+access+to+determine+the+topology+of+intracellular+membrane+proteins.">Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins.</a> J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).</li><li>Molyneaux, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeCoN:+genome-wide+analysis+of+in+vivo+transcriptional+dynamics+during+pyramidal+neuron+fate+selection+in+neocortex.">DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex.</a> Neuron. 85, 275-288 (2015).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> J Vis Exp. , e52537 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

FACS, taze ya da dondurulmuş yetişkin beyin dokusundan nöronlar ve diğer hücre tipleri sıralamak için kullanılabilir. Girişte belirtildiği gibi, donmuş doku kullanma yeteneği gibi bağımlılık araştırma öz-yönetim ve nüks çalışmaları gibi karmaşık ve uzun süreli davranış prosedürleri geçirmiş hayvanlardan numune optimum kullanımını sağlar. 2 saat ya da daha uzun süre ve tüm hayvanları gerektiren - Bu davranış prosedürler genellikle 1 sürer - aynı gün 13,18 test edilecektir (10 20 toplam). Beyin diseksiyon, hücre ayrışma, permeabilization ve immün içeren 4 taze disseke beyin doku örnekleri, işlemek için ~ 4 saat sürer. 30 dakika - işlendikten sonra, FACS her numune sıralama 20 arasında sürer. lizis tamponunda sıralanmış hücreleri ısıtma son adımı başka bir 30 dakika gerektirir. Toplamda, ~ 7 saat son RNA içeren hücre lizis çözüm adımı beyin diseksiyonu gereklidir. Bununla birlikte, bütün Brai dondurmak mümkündürns ya da taze testin hemen ardından beyin bölgelerini disseke ve daha sonra onları süreci. Bu büyük ölçüde test kolaylaştırır ve farklı bir gün sıralanması için birden fazla beyin alanlarını izin verir. önce FACS için doku Donma da sonuçları artırabilir. Daha NeuN pozitif nöronlarının dondurulmuş doku örnekleri elde edilir. Bu durum böyle neun ve Fos olarak hücre içi proteinlere karşı antikor erişimini artıracak donma ve sonraki eritme sırasında hücre zarlarının bozulması, artan Neun-etiketleme kısmen açıklanabilir. Benzer etkiler fibroblast, epitel hücreleri ve HeLa hücreleri 19 tespit edilmiştir. hücrelerin ve nöronların verimi aşağıdaki adımları kullanarak maksimize edilebilir. doku diseksiyonu sırasında, (sırasıyla, dorsal striatum ve nukleus akkumbenlere için korpus kallosum ve ön komissür) beyaz cevherde çoğunluğu kaldırmak. Bu daha sonraki ste plastik ipuçları ve cam pipet yapışmasını doku önlerps. Kullanım Tampon A kaplı disseke doku tutmak için (Malzeme ve Reaktifler Tablo özellikleri bakınız). Bu traş makinesi bıçak (aşama 2.5) doku kıyma boyunca hücrelerin kalitesini artırır. hücre süzgeçler (aşama 5) bir ikinci grubu ile en az bir cam pipet (aşama 3.9) ve daha sonra filtreleme ile 3 toz haline getirme aşamalarının İlave grubu hücreleri ve nöronların verim iki katına çıkar. Hücre süzgeçler tekrar kullanımı filtreleri ve alt hücre verimi yapışmasına neden olacaktır. pelet ve toz haline getirildikten sırasında resuspending zaman hücreleri ile nazik olun. Bu adımlar sırasında bir orta büyük pipet kullanılması kesme stresine bağlı hücre hasarını azaltır. Etanol (adım 4.4) ile permeabilization sonra süpernatant çıkarırken dikkatli pelet izle. Pelet daha kompakt ve mikrosantrifüj tüpü çeperi boyunca dağıtılabilir. Kaba hesaplamalar Fos pozitif nöronlarının verimi parçalara striatal doku numunesinde başlangıç ​​sayısının yaklaşık% 10 olduğunu göstermiştir. </p&gt; Geçerli protokol diğer deneysel amaçlara uygun şekilde değiştirilebilir. Fos ifade Fos-ifade nöronlar verimli sıralama için çok önemli olan bu zamanda, maksimal düzeylere ulaştığında, çünkü mevcut protokolde, doku metamfetamin enjeksiyondan sonra 90 dakika toplandı. Bununla birlikte, doku deney spesifik amaca bağlı olarak, FACS herhangi bir zaman noktasında toplanan olabilir. İlk doku numunesi depolama için, biz başarılı taze disseke doku, diseksiyon sonra dondurulmuş doku, ya da gen ifadesinin qPCR analizi ile takip FACS kullanılarak Fos-ifade nöronlar izole etmek için dondurulmuş tüm beyin disseke dondurulmuş doku kullandık. Bu protokol (15 dakika 4 ° C) &#39;de fiksasyon ve permeabilization, süresi ve sıcaklık için hem sitoplazmik ve nükleer membranlar geçirgenliği, yanı sıra doku düzeltmek için optimize edilmiştir. süresi ve / veya sıcaklık değişimler nihai sonuçları değiştirebilir. Böyle paraformald gibi diğer sabitleme çözümleriehyde ve embriyonik ve doğum sonrası nöronlar 20 çalıştım böyle saponin gibi non-iyonik deterjanlar, aynı zamanda yetişkin beyninden nöronlar için işe yarayabilir. Beyin dokusundan 21&#39;den FACS son zamanlarda görüldüğü gibi Dahası, miyelin kaldırma boncuklar mevcut protokolün bir modifikasyonu olarak kullanılabilir. Geçerli protokol dikkate iki önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu protokol bu hücresel süreçlerin toz haline getirme ve ayrılma aşamaları esnasında hücre gövdeleri kaldırılır, çünkü sinapslarda esas olarak ifade (örneğin, dopamin ya da glutamat reseptörleri) olan hücre fenotipi işaretlerini tespit etmek için uygun değildir. İkinci olası bir sınırlama FACS-kriteri hücrelerinden elde edilen RNA, uzunlukları bütün RNA analiz yöntemleri için yeterli olmayabilir olmasıdır. FACS elde edilen RNA RNA bütünlük numaraları (RIN) hücreleri kısa ortalama RNA uzunluklarına karşılık gelen 2.5- 3.5 arasında olduğunu sıralanır. Burada, kısa RNA boyutu ile telafi edildiDaha önce 13-15 açıklandığı gibi, 100 bp - 80 nispeten kısa qPCR amplikonları kullanarak. Biz de mikroarray analizi 11 başarıyla bu kısa uzunluğu RNA&#39;lar kullandık. Bununla birlikte, elde edilen kısa RNA uzunlukları tüm RNA analiz yöntemleri için yeterli olmayabilir. Özellikle hedeflenen ekson-ekson kavşak sitozolde sadece tam olarak eklenmiş mRNA bulunan PCR primerleri kullanıldı vurgulanmalıdır. Bu primerler çekirdekten intron içeren RNA algılamaz. Ayrıca, daha önce hücre zarının 10 sitozol ve D1 dopamin reseptörlerine tirozin hidroksilaz tespit etmek antikorlar ve taze beyin dokusu ile bu protokolü kullanılır. Bu sitozolik ve hücre zarı belirteçlerinin saptanması ayrışma prosedürü büyük ölçüde sağlam hücrelerini üretir ve sadece çekirdekler değil belirtti. Genel olarak, donmuş örneklerden nöronların FACS izolasyon diğer uygulamaları açılır. sıralama veya gen Expre hiçbir farklılıkNumuneler -80 ° C&#39;de 3 gün ya da 3 hafta saklandığı zaman salgılanması (veriler gösterilmemiştir) gözlenmiştir ºC. (- 40 örneklerinin 20) ve gen ifadesi için RNA izole üç hafta belirli bir denemenin tüm örnekleri sıralamak için makul bir süre olduğunu. Kullanılabilir RNA da -80 ° C (veriler burada gösterilmemiştir) de 6 ay depolanabilir beyin dokusundan elde edilmiştir. Böylece, bu protokol aylarca hatta yıllarca saklandı ölüm sonrası dondurulmuş insan beyin örnekleri FACS izolasyonu için yararlı olabilir.

öğrenme sırasında, hayvanlar son derece spesifik uyaranların karmaşık setleri arasındaki ilişkileri oluşturmaktadır. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan nöronların belirli kalıpları içinde değişikliklerle tarafından kodlanan olduğu düşünülmektedir. Nöronal toplulukları son zamanlarda güçlü davranış veya isteka pozlama sırasında aktive edildi gibi Fos, Arc ve Zif268 ve nöronlarda protein ürünleri gibi hemen erken genlerin (Bacaklarını) indüksiyonu ile tespit edilmiştir. Özellikle içerik ve işaret özgü öğrenilen davranışlar 1-4 nedensel rol oynadığı gösterilmiştir nöronlar Fos-dile getirdi. Bu nedenle, bu aktive Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations madde bağımlılığı ve post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) 5 normal öğrenme ve anormal öğrenme bozuklukları sırasında oluşan dernek, öğrenilen enkode nöral mekanizmalar için en iyi adaylardır. Fluorescence Aktif Hücre Sıralama (FACS) son zamanlarda Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations analizi izin verdi. Flow sitometri ve hücre kendi ışık saçılması ve immunofluorescent özelliklerine göre hücre karakterize ve izole etmek için 1960 6,7 geliştirilmiştir sıralama ve uzun immünoloji ve kanser araştırmalarında kullanılmaktadır. Ancak akım sitometri ve FACS yetişkin beyin dokusundan elde etmek zordur ayrışmış tek hücreleri gerektirir. FACS birinci antikor etiketleme 8,9 gerektirmeyen transjenik farelerden striatal nöronlar -expressing izole etmek ve (GFP) yeşil floresan protein analiz etmek için kullanıldı. Bu izole edilmesi ve vahşi tip hayvanlara 11-15 ilaç ve / veya ipuçları ile aktive nöronlar Fos eksprese eden moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi için antikor bazlı FACS metodu ile 10 geliştirilmiştir. güçlü nöronlar aktive ederken, bu yöntemde, nöronlar, genel nöronal belirteç neun karşı bir antikor ile etiketlenirFos karşı bir antikor ile etiketlenir. Başlangıçtaki yöntem, taze doku için örnek başına 10 sıçan havuzu gerekli olsa da, bir protokolün takip eden değişiklikler tek sıçan 13-15 ayrık beyin alanlarının Fos salgılayan nöronların ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) analizi FACS izole izin . Genel olarak, eşsiz moleküler değişiklikler bağımlılığı araştırma 12,14,15 yılında bağlam ve işaret aktive davranışlar çeşitli sırasında aktive nöronlar Fos-ifade bulundu. Taze doku üzerinde FACS performans ile büyük lojistik sorun FACS ile doku ve süreci ayırmak bir bütün gün sürer olmasıdır. Buna ek olarak, sadece dört numune günde işlenebilir. Bu, genellikle tek bir beyin bölgesi Her beyinden gelen değerlendirilebilir ve kalan beyin bölgeleri iptal edilmesi gerektiği anlamına gelir. Bu tür öz-yönetim ve nesli trai gibi düşük verimlilik davranışsal işlemler için önemli bir sorundurcerrahi ve yoğun bir eğitim birçok hafta gerekir ning. Bundan başka, test gününde, uzun ve karmaşık bir davranış işlemler zor aynı gün FACS yapılmasını kolaylaştırır. Bu önemli bir avantaj hemen davranışsal test ettikten sonra hayvanlardan beyinleri dondurmak mümkün olacak, ve sonra araştırıcının seçeceği farklı zamanlarda bir veya birden fazla beyin bölgelerinden Fos-ifade nöronlar izole olacaktır. Burada biz, FACS protokolü taze ve dondurulmuş, her iki beyin dokusundan Fos salgılayan nöronların (ve diğer hücre tipleri) izole etmek için kullanılabileceğini gösterir. Bir örnek olarak, akut metamfetamin enjeksiyondan sonra ve enjeksiyonlar (kontrol koşulu olmadan) naif sıçanların sıçan striatum nöronları Fos-ifade izole. Bununla birlikte, bu FACS protokolü bir davranış ya da farmakolojik tedavi sonrası kullanılabilir. Bizim örneklerin sonraki qPCR analizi bu hücre tiplerinden gen ifadesi simi ile değerlendirilebilir olabileceğini belirttitaze ve dondurulmuş hem dokudan lar verimliliği.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1274">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Brain matrix</td>
			<td style="width:191px;">CellPoint Scientific</td>
			<td style="width:241px;">69-2160-1</td>
			<td style="width:388px;">to obtain coronal brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate A low fluorescence&#160;</td>
			<td>Brain Bits</td>
			<td>HA-lf&#160;</td>
			<td>Buffer A&#39; in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Enzyme solution&#39; in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>to prevent cell lost during the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>to filter cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>to filter cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352235</td>
			<td>to filter cell suspension before passing though the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipet, Glass</td>
			<td>NIH supply</td>
			<td>6640-00-782-6008</td>
			<td>to do tissue trituration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>antibody to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>8677</td>
			<td>antibody to detect Fos-expressing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td>to label nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript III first strand cDNA synthesis system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-051</td>
			<td>to synthesize cDNA from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>4391128</td>
			<td>to do targeted-preamplification from cDNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TaqMan Advance Fast Master&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>4444963</td>
			<td>to do PCR using TaqMan probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fos TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>Rn00487426_g1</td>
			<td>TaqMan probe/primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>CACTCCAACAGCGTGAC</td>
			<td>nucleotide sequence for neuronal gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN Forward primer</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td>
			<td>nucleotide sequence for neuronal gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN Reverse primer</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>TTCCCCCTGGTCCTTCTGA</td>
			<td>nucleotide sequence for neuronal gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gfap TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>Rn00566603_m1</td>
			<td>TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iba-1 TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>Rn00574125_g1</td>
			<td>TaqMan probe/primers for microglya gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gapdh TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>CTCATGACCACAGTCCA</td>
			<td>nucleotide sequence for reference/housekeeping gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gapdh Forward primer</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td>
			<td>nucleotide sequence for reference/housekeeping gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gapdh Reverse primer</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA</td>
			<td>nucleotide sequence for reference/housekeeping gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oligo2 TaqMan probe</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>Rn01767116_m1&#160;</td>
			<td>TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipettor</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td>It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems.</td>
			<td>446985</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAria I Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for FACS sorting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence activated cell sorting (facs) and gene expression analysis of fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue

nöroplastisite ve öğrenilmiş davranışların moleküler değişikliklerin çalışma dernekleri öğrenilen aracılık eden nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan aktif nöronların spesifik setleri çalışmaya tüm beyin bölgelerinin çalışma geçiyor. (FACS) Kontrol THP-en son yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiş ve nöronal marker NeuN ve fos protein güçlü aktif nöronların belirteci karşı antikorlar kullanılarak aktif nöronların izolasyonu izin verildi. Şimdiye kadar, Fos salgılayan nöronların ve diğer hücre tipleri uzun işlem günü ve uzun ve karmaşık davranış işlemlerinden sonra değerlendirilir beyin örnekleri izin çok kısıtlı gerektirdiği taze doku, izole edilmiştir. 21 gün - Burada dorsal striatum nöronlar ve Fos mRNA Fos-ifade verimleri 3 -80 ºC de donduruldu taze disseke doku ve doku arasındaki benzer olduğunu gördük. Buna ek olarak, fenotip teyitdondurulmuş doku, aynı zamanda, FACS izolasyonu için kullanılabileceğini gösterir nöronal değerlendirmek gen ifadesi (NeuN), astrositik (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ve microgial (Iba1) işaretleri ile NeuN-pozitif ve NeuN negatif kriteri hücrelerin glial hücre türleri. Genel olarak, toplamak incelemek ve birden FACS oturumları için beyin dokusu dondurmak mümkün. Bu genellikle uzun ve karmaşık davranışsal prosedürleri geçirmiş değerli hayvan deneklerden elde edilen verilerin miktarını en üst düzeye çıkarır.

akut metamfetamin enjeksiyondan sonra tek sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum dokudan Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sıralama. Yukarıda tarif edilen protokol metamfetamin (5 mg / kg) periton içinden enjekte sonra bir sıçan dorsal striatum, 90 dakika arasında Fos-pozitif ve fos-negatif nöronlar sıralamak için kullanıldı. kendi kafeslerinde naiv sıçanlar kontrol olarak kullanıldı. Dorsal striatum dokusu işlenmiştir ya hemen Koleksiyonunda (taze doku) ya da dondurulmuş ve 1, 7 ya da 21 gün boyunca -80 ° C &#39;de bekletildikten sonra işlemden sonra. Bu donma zaman noktalarında elde edilen sonuçlar birbirinden önemli ölçüde farklı değildi, bu yüzden veri toplandı. enstrüman sıralama koşulları ayarlamak için, ev ya da kafes kontrolü veya methampheta dan (yukarıda anlatılan) kontrol numunelerimayın enjekte gruplar kullanıldı. Bu örneklerde her parçacık veya olay Sitometre akış hücresinden geçer zaman, olayın ışık saçılması ve floresan özellikleri ile ilişkili ve bir elektronik tablo kaydedilmiş bir kimlik numarası verilir. Bu sayfadaki olaylar daha sonra bu özellikleriyle (Şekil 1) için scattergrams veya yoğunluk araziler organize edilebilir. benzer özelliklere sahip Olaylar daha sonra gruplandırılmış veya bu hücreleri içeren, nöronlar, ya da Fos-pozitif nöronlar olarak kapılarını belirlemek için özellikleri farklı çiftleri tarafından &#39;kapı&#39; olabilir. kapıları yukarıda açıklanan kontrol numuneleri kullanılarak belirlenmiştir sonra, ana numune bu kapılardan göre akış sitometresi enjekte ve sıralanır. hücre popülasyonu onların ileri ışık yayılımı dayalı tüm olayların (hücreler ve enkaz) için Geçitli (FSC; bir parçacığın boyutu göstergesini) ve yan ışık dağılım (SSC; parçacığın g bir göstergesidirranularity). FSC SSC karşı nokta arsa gösterilen (Şekil 1A ve 1B), tüm olayların yoğunluğu arsa büyük heterojen nüfus ek olarak, benzer boyut ve ayrıntı ile küçük bir homojen nüfus ortaya koyduğu gibi (Şekil 1A ve 1B). Hücre gövdeleri içeren küçük bir homojen nüfus tespit ve önceki çalışmalarda 11,13-15 ve DAPI ile etiketleme FSC ve SSC özelliklerine göre &quot;Hücreler&quot; olarak Geçitli. hücrelerin biraz daha yüksek bir yüzdesi taze doku (% 1.9) elde göre donmuş dokudan (% 2.6) elde edilmiştir. Büyük heterojen nüfus tahminen dendrit ve akson süreçlerden, çoğunlukla enkaz olduğunu. Sonra, &quot;Hücreler&quot; kapıdan tek hücre x ekseni üzerinde her olay için FSC sinyalinin genişliği ile belirtilmiştir boylarına, dayanarak belirlenmiştir. tek hücre daha büyük olan olayları hücre agregatları kabul edildi<html> ve dışında &quot;Tek hücre kapısı. sonraki analiz adımları Tüm bu içinde yürütülmüştür&quot; Tek hücreli &quot;kapısı (Şekil 1C ve 1D). Bu tek hücre popülasyonunun çoğunluğu (&gt;% 92) (veri DAPI boyama için pozitif değildi gösterilir). İlk olarak, nöronlar NeuN-immünoreaktivitesi (Şekil 1E ve 1f) gösterilen kendi PE floresans yoğunluğunu göre tespit edilmiştir. Nöronlar taze doku ve dondurulmuş doku için% 38 için &quot;Tek hücreli&quot; kapıdan bütün olayların yaklaşık 24% oluşturmaktadır. Hemen hemen tüm bu &quot;Neuron&quot; kapısı olaylar (taze doku% 98 ve dondurulmuş dokuda% 99) hücre çekirdeğinde (Şekil 1G ve 1 H) DNA DAPI boyama için pozitif idi. Şekil 3&#39;te qPCR tarafından onaylandıktan gibi tek hücreli kapısı kalan DAPI etiketli olaylar, Neun-negatif ve glia, oligodendrositleri ve mikroglia bulunmaktadır. 1 &quot;&gt; Sonra nöronlar kendi Alexa Fluor 647 floresan sinyali (Fos-immunoreaktivitesi) dayalı nöronlar Fos-pozitif veya Fos-negatif olarak sınıflandırılan hücre tipi belirteçleri aksine, Fos.:&quot; Keep-together.within sayfa = fo &quot;ove_content nedeniyle nöral aktivitenin ve zaman elbette düzeyleri farklı yavaş yavaş nöronlar artar ifade seviyeleri. Bu nedenle, Fos-negatif nöronlar karşı Fos-pozitif arasında kesin eşik olmayacaktır. ilk aşamada (off-line analizleri sadece kullanılan ) nöronlar Fos-pozitif yüzdelerini hesaplamak, biz naif ev kafes kontrol sıçanlarda Neun-negatif nüfus Fos maksimum Alexa-647 floresan (dayalı Fos-pozitif nöronlar) için eşik tanımladı. Fos-pozitif nöronlar belirtilmiştir Şekil 2&#39;de farklı deneysel koşullar mavi kareler hem taze ve dondurulmuş dokularda, metamfetamin enjekte farelerden alınan yüzde Fos-pozitif nöronlar. (1,9-2,2% Şekil 2C ve 2D) eş olarak iki kat(-% 0,8, Şekil 2A ve 2B 0.7) ev kafes sıçanlara mpared. Hedef gen ön amplifikasyon ve RT-PCR kullanılarak FACS-kriteri hücrelerden Onaylama hücre türüne özgü genler. İkinci aşamada, daha sonra mRNA ana örnek sadece Fos pozitif nöronlarının sıralama sağlamak için analiz ve fos-negatif hücreler dahil indirgeyici Alexa-647 floresans eşiği yükseltilmiş böylece Fos sadece üst üçte ikisi mavi kareler pozitif olaylar sıralanır ve toplanmıştır. Bu eşik sahip en az 10 kat örneklerde Fos pozitif nöronlarının yüzdesini hesaplamak için yukarıda kullanılan eşik değerinden daha yüksek floresans (hücre başına daha yüksek Fos sentezleme). Hücrelerin dört popülasyonları Neun-negatif + Fos-negatif (~ 5.000 olaylar) Neun-negatif + Fos-pozitif dahil olmak üzere tek doku numunesi, sıralanır (25 değişmekteydi - 83 olayları), Neun-pozitif + Fos-negatifative (~ 5.000 olay) ve Neun-pozitif + Fos-pozitif (- Ev grubu için 133 olayları, 185 - Metamfetamin grubu için 450 olayları 44 arasında değişmektedir). İlk olarak, (her ikisi de Fos-pozitif ve fos-negatif dahil) NeuN negatif popülasyon (Fos-pozitif ve fos-negatif dahil) NeuN-pozitif hücre türüne özgü gen sentezlenmesi teyit edilmiştir (Şekil 3). GAPDH idi önceki çalışmamızda 13 elde edilen sonuçlara dayanarak, başvuru / temizlik gen olarak kullanılır. PCR reaksiyonlarında numune ve cDNA RNA farklı seviyelerde kontrol etmek için, çift yönlü qPCR reaksiyonları hedef genin ve GAPDH cDNA hem de primerler kullanılarak ifa edilmiştir. GAPDH temizlik geni için Ct değerleri hassas ölçümler için 15 ile 31 arasında tutuldu. Taze ve dondurulmuş doku için, NeuN mRNA seviyeleri NeuN negatif popülasyon (p &lt;0.05 göre NeuN pozitif popülasyonda (yaklaşık 8 kat) anlamlı düzeyde daha yüksekti Şekil 3A </strong&gt;; Ev ve metamfetamin grubundan birleşik veri). Bunun aksine, hem taze ve dondurulmuş doku, GFAP (glial hücre belirteci, Şekil 3B) ve Oligo2 (oligodendrosit hücre belirteci Şekil 3C) mRNA seviyeleri NeuN pozitif popülasyon (p daha NeuN negatif popülasyonu içinde daha yüksek &lt;0.05 ). Yüksek Iba1 benzer bir eğilim (mikroglial hücre işaretleyici Şekil 3D) mRNA seviyeleri Neun-negatif nüfus gözlenen, ancak bu istatistiksel olarak anlamlı değildi. Doğru belirli bir hücre türü ölçülememiştir özellikle mRNA aşırı derecede düşük seviyelerde bulunan bazı örnekler (ör NeuN etiketli nöronlarda GFAP mRNA). Maksimum Ct değerleri doğru olarak tespit edilemeyecek kadar düşük değerlere ortadan kaldırmak için 35 olarak belirlenmiştir. Yüksek Ct değerleri bizim qPCR testlerinin güven sınırını aştı. Fos mRNA ifadesi(Şekil 4) metamfetamin tek bir enjeksiyon alınan sıçanların Neun-pozitif nöronal nüfus incelenmiştir. Taze ve dondurulmuş doku için, fos mRNA düzeyleri (P &lt;0.05) Fos-negatif nöronlar daha Fos-pozitif nöronlarda daha yüksekti. Ayrıca, taze iken doku Fos-pozitif nöronlarda fos mRNA&#39;nın 3 kat artış, dondurulmuş dokudan Fos-pozitif nöronlarda fos mRNA, bir 11-misli artış saptandı oldu. Birlikte ele alındığında, bu mRNA sonuçları Fos pozitif nöronlarının kimliğini, taze ve dondurulmuş dokudan Fos-negatif nöronlar ve nöronal olmayan nüfusu teyit etmektedir. Ayrıca, hücre tipine özgü genler ve diğer ilgi genleri de taze ve dondurulmuş koşulların her ikisi altında kriteri hücrelerden analiz edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54358/54358fig1.jpg" /> Dis Şekil 1. AyırıcıTaze ve Dondurulmuş Rat Dorsal striatum Birlikte olan ve Etiketli Hücreler. &#39;Hücrelerinin kapısı ileri ve yan dağılım özellikleri (AD) tarafından belirlenen ve nükleer DAPI boyama (GH) ile pozitif etiketleme tarafından teyit edilmiştir. &#39;Hücrelerinin nüfus içinde&#39; nöronlar &#39;kapısı neun (; EF PE) için floresan ile belirlendi. (A - B) Hücre kapısı: onların forward scatter (X ekseni, hücre boyutu) ve yan dağılım (Y-ekseni, ayrıntı) dayalı tüm olayların Lineer arsa. (Cı - D), tek hücreler, kapı: Ab gösterilen hücre kapısı içinde öne dağılım yükseklik (Y-ekseni) ve genişlik (x-ekseni) arasında lineer bir çizgi. (E - F) Nöron kapısı: CD gösterilen tek hücre kapısı olan PE-etiketli neun (Y ekseni) için immünofloresan logaritmik arsa alt kümede olayları ve non-nöronal hücrelerin üst küme nöronlar ortaya koymaktadır. (G </strong&gt; - H) Çekirdekler boyama: nöronal hücre kapısının içinde DAPI etiketli çekirdekleri (Y ekseni) için floresan logaritmik arsa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54358/54358fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54358/54358fig2.jpg" /> Şekil 2. neun ve Fos Çift Etiketleme dayanarak Taze ve Dondurulmuş Rat Dorsal striatum Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar Yolluk. Tek sonra evlerine kafes veya 90 dakika doğrudan alınan sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum ( metamfetamin karın içinden enjeksiyon) ayrışmış ve neun ve Fos karşı doğrudan konjuge antikorlar ile etiketlenmiş ve bir FACS makine kullanarak sıralanır. fikoeritrin (PE) göre NeuN immünofloresan (X-ekseni) ve Alexa 647-işaretlenmiş Fos immunofluo -etiketli edildi sıralamarescence (Y-ekseni). Fos-pozitif (mavi nokta) ve Fos-negatif (kırmızı noktalar) nöronlar sırasıyla üst ve sağ alt kadranda yer bulundu. nokta diyagramları NeuN pozitif hücreleri (nöronlar) ve NeuN-negatif hücre (siyah nokta) göstermektedir; mavi kareler yukarıda eşik Fos ifadesi ile nöronlar göstermektedir. (A - B) Ev grubu: evlerinde kafeslerde doğrudan alınan naif fareler. (C - D) Metamfetamin grubu: metamfetamin tek enjeksiyonları alan fareler. Fos-pozitif nöronlarının eşik sadece Alexa-647 floresans (Fos-IR) anestezi kontrol grubunda NeuN-negatif hücreler için gözlenen maksimum üstünde seçildi. tüm nöronların% 0.8 ev grubunda Fos-pozitif, 1.9 - - 0.7 iken tüm nöronların% 2.2 metamfetamin grubunda Fos-pozitiftir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54358/54358fig3.jpg" /> Şekil 3. </(FOS pozitif ve fos-negatif) güçlü&gt; Hücre tipi özel gen Taze ve Dondurulmuş fare dorsal striatum Hücreler, FACS-kriteri. NeuN pozitif nöronlarının (FOS pozitif ve fos-negatif) hem NeuN-negatif hücrelerin kriteri edildi hücre Ayırma teyit etmek için kullanıldı açıklanan protokol ve hücre tipi özel geninin mRNA ekspresyon seviyelerini kullanarak (A). NeuN nöronal hücreleri için bir belirteçtir. (B), GFAP glial hücreleri için bir belirteçtir. (C) Oligo2 bir belirtecidir oligodendrosit hücreleri için. (D) Iba1 mikroglial hücreleri için bir belirteçtir. NeuN mRNA için, veriler ortalama ± SEM, taze dokudan NeuN-negatif hücrelerinde sentezleme seviyelerine göre katlama değerleri (- 14, n = 9) ve ortalama olarak sunulmuştur. , Oligo2 (n = 9-11) - GFAP (12 n = 6) ve Iba1 (n = 5-8), mRNA, veriler kat değerlerinin ± SEM Neu sentezleme seviyelerine göre olduğu anlamına sunulmuşturTaze doku N-pozitif hücreler. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54358/54358fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54358/54358fig4.jpg" /> Yukarıdaki protokol açıklanan ve Fos mRNA seviyeleri teyit edilmiştir olarak Metamfetamin Enjeksiyon. Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sonra taze veya dondurulmuş Rat Dorsal striatum FACS-sıralanmış Nöronlar Şekil 4. Fos mRNA Düzeyleri dizildi. Veriler, taze dokudan Fos-negatif nöronlarda ekspresyon seviyelerine göre katlama değerleri (4 - n = 3) ve ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue at JoVE.com

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

fluorescence-activated-cell-sorting-facs-gene-expression-analysis-fos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

29.1K Görüntüleme.  NIDA, NIH, DHHS.  Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar. 

Video: Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the intestine and lower urinary tract. Both during development and in mature tissues these cells are often widely dispersed throughout tissues so that isolation of discrete populations using methods like laser capture micro-dissection is difficult. They can however be directly visualized by expression of fluorescent reporters driven from regulatory regions of neuron-specific genes like Tyrosine hydroxylase (TH). We describe a method optimized for high yields of viable TH+ neuronal progenitors from fetal mouse visceral tissues, including intestine and lower urogenital tract (LUT), based on dissociation and fluorescence-activated cell sorting (FACS). 
The Th gene encodes the rate-limiting enzyme for production of catecholamines. Enteric neuronal progenitors begin to express TH during their migration in the fetal intestine1 and TH is also present in a subset of adult pelvic ganglia neurons2-4 . The first appearance of this lineage and the distribution of these neurons in other aspects of the LUT, and their isolation has not been described. Neuronal progenitors expressing TH can be readily visualized by expression of EGFP in mice carrying the transgene construct Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc1. We imaged expression of this transgene in fetal mice to document the distribution of TH+ cells in the developing LUT at 15.5 days post coitus (dpc), designating the morning of plug detection as 0.5 dpc, and observed that a subset of neuronal progenitors in the coalescing pelvic ganglia express EGFP. 
To isolate LUT TH+ neuronal progenitors, we optimized methods that were initially used to purify neural crest stem cells from fetal mouse intestine2-6. Prior efforts to isolate NC-derived populations relied upon digestion with a cocktail of collagenase and trypsin to obtain cell suspensions for flow cytometry. In our hands these methods produced cell suspensions from the LUT with relatively low viability. Given the already low incidence of neuronal progenitors in fetal LUT tissues, we set out to optimize dissociation methods such that cell survival in the final dissociates would be increased. We determined that gentle dissociation in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manual filtering, and flow sorting at low pressures allowed us to achieve consistently greater survival (&gt;70% of total cells) with subsequent yields of neuronal progenitors sufficient for downstream analysis. The method we describe can be broadly applied to isolate a variety of neuronal populations from either fetal or adult murine tissues.

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An optimized procedure to purify neural crest-derived neuronal progenitors from fetal mouse tissues is described. This method takes advantage of expression from fluorescent reporter alleles to isolate discrete populations by fluorescence-activated cell sorting (FACS). The technique can be applied to isolate neuronal subpopulations throughout development or from adult tissues.

Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...