The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the "Association Fran&#231;aise pour le Syndrome d'Ondine". FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program "Investissement d'avenir" of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

Not: c-fos algılama çeşitli adımlar (Şekil 1) içeren standart bir prosedürdür. Bütün deneyler, sıçan veya fare üzerinde gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokoller hayvan bakımı için 22 Eylül 2010 (2010/63 / AB) Avrupa Birliği Konsey Direktifine uygun olarak yapılır, Hayvan Deney Charles Darwin (/ 05/2011 CE5) Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve uygun şekilde yapılmıştır hayvan bakımı için Fransız yasaları. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> 0.2 M sodyum fosfat tamponu hazırlayın: karıştırılarak 6.24 gr NaH 2 PO 4 * 2H 2 O ve 22.56 gr Na 2 HPO 4 * H2O 1 L damıtılmış su ilave edilir. </li><li> % 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın: damıtılmış su, 150 ml PFA 20 g ekleyin. karıştırılırken 80 ° C&#39;ye çözelti ısıtılır. çözüm temizlemek için, ısıyı azaltmak ve paraformaldehid çözülür yardımcı olmak için 1 N NaOH 1 veya 2 damla ekleyin. 250 mL Kompleve damıtılmış su ile 0.2 M fosfat tamponu (pH 7.4) 250 ml ekle. 4 ° C&#39;de saklayın. Bu reaktifler kullanılarak, uygun özen gösterin. Bir kimyasal başlık altında eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanınız. Not: perfüzyonları önceki gün% 4 PFA hazırlayın. Yaş, sayı ve hayvan türlerinin bir fonksiyonu olarak% 4 PFA hacmini belirler. </li><li> soğuk önleyici solüsyon hazırlanması: 0.2 M fosfat tamponlu tuz, 250 ml, polivinil-pirolidon, 5 g, sükroz ve 150 g sodyum klorür 2.5 g karıştırın. Tamamen çözüldükten sonra, etilen glikol, 150 ml ilave edilir ve damıtılmış su ile 500 ml&#39;ye ayarlanır. 4 ° C&#39;de soğuk önleyici solüsyon saklayın. </li><li> 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın: karıştırılırken 1 L damıtılmış suya NaCl, 18 g ekleyin. Tamamen çözüldükten sonra, sodyum fosfat tamponu ile 1 L 0.2 M ekleyin. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin% 0.3 ile takviye hazırlayın Triton X100 (PBST): Triton X10 3 ml ekleyinPBS 0 997 ml. </li><li> 0.05 M Tris-tampon maddesi (pH 7.6) hazırlayın: karıştırılırken distile su, 500 ml 3.03 Tris-hidroklorür g ve 0.70 g Tris-bazlı bir ekleyin. </li><li> , Bir plaka için çözelti 30 ml hazırlanması: PBST içinde% 2 keçi serumu hazırlayın. 30 ml PBST için keçi serumu 600 ul ekleyin ve iyice karıştırın. oyuk başına 2.5 ml. Not: kullanılan serum, ikincil antikor üretimi için kullanılan türden gelmelidir </li><li> büyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) ile PBST içinde (4000, SC-52 1), c-fos proteine ​​karşı tavşan poliklonal antikor hazırlayın. bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. 30 mi PBST, büyükbaş hayvan serum albümini, 75 mg ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, C-fos proteine ​​karşı tavşan poliklonal antikorun 7.5 ul ekle. </li><li> serum albümin, sığır (% 0.25) ile PBST içinde: biyotinlenmiş keçi anti-tavşan antikoru (1: 500) hazırlanması. bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. 30 mi PBST, büyükbaş hayvan serum albümini, 75 mg ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra Eklebiyotinile edilmiş keçi anti-tavşan antikoru 60 ul. </li><li> Hazırlama avidin-biyotin-peroksidaz (1: 250), kompleks PBST (ABC solüsyonu). bir plaka için, çözelti 30 ml hazırlar. Reaktif A 120 ul ve 30 ml PBST reaktif B 120 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Not: ABC çözeltisi kullanımdan önce en az 30 dakika hazırlanmalıdır. </li><li> substrat çözeltisi hazırlayın. Kullanımdan hemen önce, (bir levha) aşağıdaki gibi bir çözelti hazırlamak: nikel, amonyum sülfat, 20 mg ve 50 ml Tris-tamponu 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorid 10 mg ekleyin. Filtre ve ışıktan korur. oyuk başına 2.0 ml ilave edilir. Geri kalan çözelti (25 mL) içinde H 17 ul H2O 2 (H2O 2 çözeltisi H2 O içinde% 30) ekleyin. oyuk başına 2.0 ml ilave edilir. Not: Bu reaktif kullanırken Uygun dikkatli olunmalıdır. eldiven ve laboratuvar kat kullanınız. </li></ol> 2. c-fos lnduIn Vivo ction ve Doku İşleme Not: Deneyler fareler (Sprague Dawley) ve farelerde (C57BL / 6) gerçekleştirilmiştir. <ol><li> 2 saat (Şekil 2A) için hipoksik (O 2% 8 dengeli bir N2) ya da hiperkapnik (CO2% 4, O 2% 21 dengeli bir N2) gaz karışımı ile havalandırılmış hava geçirmez kutuya hayvanlar koyun. </li><li> pentobarbital intraperitonal enjeksiyon (100 mg / kg) ile hayvan anestezi uygulayın. % 4 PFA 20 hayvan transkardiyal serpmek. Bir kimyasal başlık altında bakım ve kullanım eldiven kullanınız. </li><li> Perfüzyondan sonra beyin 20 incelemek ve 4 ° C sıcaklıkta 48 saat boyunca 15 ml&#39;lik bir tüp içinde% 4 PFA 7 ml batırın. Sonra PFA gelen beyin kaldırmak ve soğuk önleyici solüsyon içinde tamamen bırakın. -18 ° C (Şekil 3) saklayın. Uygun atık işleme pa tarafından hayvanın vücudunun geri kalanı imhathway. Not: donmaya karşı koruma PFA fiksasyon ve donma arasındaki adımdır. Bu olan dondurma amorf formunda olacaktır çözeltisi ile hücrelerde buz kristallerinin oluşmasını azaltır. Sabit numuneler, 4 ° C&#39;de en az 24 saat süre ile (adım 1.3 hazırlandı) kriyokoruyucu çözelti içinde emprenye edilmelidir. kimyasal başlık altında bakım ve eldiven kullanınız. </li></ol> 3. c-fos indüksiyon ve Doku İşleme Ex Vivo Not: Deneyler, sadece yeni doğmuş sıçan veya farelerde gerçekleştirilmiştir. <ol><li> Suzue 19 tarafından açıklandığı gibi MSS izole eder. MgCI2, 26.0 130.0 NaCl, 5.4 KCl, 0.8 CaCl2, 1.0: bir kayıt odası içine yerleştirin ve 26 ° C&#39;de 21 (ACSF 7.5 mL / dk&#39;lık bir oranda suni serebrospinal sıvı ile sürekli olarak superfuse: mM NaHCO 3, 30.0 D-glikoz,% 95 O2 ve 5 gaz verilerek O 2 ile doyuruldu ve pH 7.4&#39;e ayarlanmıştır% CO2) (Şekil 2B). </li><li> % 95 O2 ile fokurdatıldı hipoksi ya da 10.0 mm &#39;ye düşürüldüğü NaHCOs 3 ile asidifiye aCSF (standart aCSF ile deoksijene CSF (% 95 N2 ve% 5 CO2, pH 7.4 ile kabarcıklar halinde aynı bileşime) ile aCSF yerine hiperkapni% 5 CO2). 30 dakika (Şekil 2B) için stimülasyon uygulayın. </li><li> Ex vivo, indüksiyon süresi sonrasında, daha sonra kullanmak (Şekil 3) için bir kriyokoruyucu çözelti içinde -18 ° C de 48 saat ve mağaza 2.5 ml tüp içinde 2.5 ml% 4 PFA yeni doğmuş fare ve sıçan CNS aktarın. Not: ex vivo, hayvanlar perfüze edilmesi için gerekli değildir. Bir önceki çalışmada küçük numuneler çapı 10 mm&#39;den basit difüzyon 22 ile tespit edilebilir ölçüm düşündürmektedir. aldehit için (dokuya fiksatif difüzyon için mm cinsinden mesafe,) penetrasyon bir alıntı oranı 2 veya 3 mm / saat olduğunu. </li&gt; </ol> 4. Beyin Kesit Not: sona erdirmek için bu aşama kaynaktan, protokol katı, in vivo ve ex vivo indüksiyonu için aynıdır. <ol><li> dilimleme önce, bir tek tek iyi bir 12-çukurlu plaka yerleştirin ve her bir PBS 2.5 ml yerleştirin. </li><li> Bir kriyostat ile beyin sapı seri koronal kesitler (40 mikron) yapın ve 12 plaka bunları toplamak. Tüm yetişkin beyin sapı için, yaklaşık 70 dilim (Şekil 3) yapmak. Not: bir plaka paralel çok sayıda hayvan Kısım doku mümkündür. </li></ol> 5. Immünohistolojik Prosedürler (Tablo 1) Not: süreci boyunca, bölümler de ekler kalır. <ol><li> Gün 1 - Endojen peroksidaz aktivitesi yok edilmesi, spesifik olmayan bağlanma sitesi blokajı ve primer antikor ile inkübasyon (Şekil 4) <ol><li> YıkamaOda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca bölümler (oyuk başına 2.5 mi). 3 kez tekrarlayın. </li><li> Hidrojen peroksit H, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca koronal kesitler inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini bastırır 2 O 2,% 3, 0.1 M PBS (oyuk başına 2.5 mi) içinde. </li><li> Oda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın. </li><li> PBST içinde keçi serumu (% 2) ile birlikte oda sıcaklığında 1 saat için koronal kesitler inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma sahasını bloke eder. </li><li> büyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) (oyuk başına 2.5 mi) ile PBST içinde (4000, SC-52, 1), c-fos proteine ​​karşı tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C &#39;de 48 saat süre ile koronal kesitler inkübe edin. </li></ol></li><li> Gün 3 - sekonder antikor ve renk reaksiyonunun gelişimi ile inkübasyon (Şekil 4) <ol><li> Oda sıcaklığında PBS, 0.1 M, 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın. </li><li> tasarlamakbüyükbaş hayvan serum albümini (% 0.25) (oyuk başına 2.5 mi) ile PBST içinde: biyotinlenmiş keçi anti-tavşan antikoru (1: 500) ile birlikte oda sıcaklığında 1 saat için koronal kesitler. Not: Araştırmacı, bu aşamada, bir flüoresan probun bağlanmış ikincil antikor kullanılabilir. Bu durumda, bu aşamada protokolü durdurmak ve bir floresan mikroskop kullanılarak doğrudan inceleyin. </li><li> Oda sıcaklığında PBST ile 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 3 kez tekrarlayın. </li><li> 1 saat boyunca koronal bölümleri inkübe bir avidin-biyotin-peroksidaz (1: 250), kompleks (oyuk başına 2.5 mi) PBST içinde. </li><li> Oda sıcaklığında PBST ile 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 2 kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında, 0.05 M Tris-tamponu, 10 dakika (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkayın. 2 kez tekrarlayın. </li><li> 0.05 M Tris-tampon maddesi içinde% 0.02 3,3-diaminobenzidin tetrahidroklorid,% 0.04 nikel, amonyum sülfat ve% 0.01 hidrojen peroksit koronal bölümleri inkübe (pH 7.6), birt RT (oyuk başına 2.0 mi). Geri kalan çözelti (25 mi) ilave 17 ul H2O 2 (H2O 2 çözeltisi H2 O içinde% 30) (oyuk başına 2.0 mi) içinde. Not: Araştırmacı ışık mikroskobu altında geliştirme sürelerini belirlemek gerekir. Bununla birlikte, 5 ila 10 dakika iyi bir boyama yoğunluğu sağlar. </li><li> Boyanma yoğunluğu uygun olduğunda, oda sıcaklığında, 0.1 M PBS ile 10 dakika boyunca (oyuk başına 2.5 mi) bölümler yıkanarak reaksiyonu durdurmak, (ışık mikroskobu altında kontrollü, Şekil 5 ve Şekil 6). 4 kez tekrarlayın. Daha sonra, saf su ile bölümleri yıkayın. </li></ol></li><li> Örnekleme montaj (kimyasal başlık altında bakım ve eldiven ile ele) <ol><li> seri slaytlar ve kurumaya üzerine monte bölümleri. Bunun için, dikkatli slaytlarda fırça ile postero-kaudal sırayla bölümleri yayıldı. Açıkça numune göre slaytları etiket. </li><li> Mutlak al ile kurutmakcohol: mutlak alkol banyosunda oda sıcaklığında 30 saniye boyunca slaytlar batırmayın. İki kez tekrarlayın. </li><li> ksilen ile net: oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ksilen banyosunda slaytlar batırmayın. İki kez tekrarlayın. </li><li> orta montaj slaytlar lamel. Bunun için, slayt üzerinde montaj orta 5 damla uygulayın ve sonra hava kabarcıkları dışarı sürerek cam kapak uygulanır. Hava, kuru, 48 saat boyunca. </li></ol></li></ol> 6. Veri ve İstatistiksel Analiz <ol><li> ışık mikroskobu altında bölümleri inceleyin. Görme standart işaretlerini 23,24 kullanarak yüksek büyütme (200x) de FLI nöronlar sayılır. c-fos noktasal boyama nöronların çekirdeklerin içinde yer almaktadır. </li><li> Her analiz alanı için bölüm başına c-FOS-pozitif hücrelerin sayısını saymak ve kontrolü ve uyarılan koşulları arasındaki ortalama sayısını karşılaştırın. Verilerin normallik bağlı olarak, eşleşmemiş student t testi veya Mann-Whitney testi kullanın. Farklılıkların, p ise anlamlı kabul edildi0 0.05. Bir çizim tüp mikroskop bağlı ve bir dijital kamera ile fotoğraflandı (Şekil 5) kullanarak bir çizim (büyütme 100x) üzerine FLI nöronların dağılımını çizilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Curran, T., Teich, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+39,000-dalton+protein+in+cells+transformed+by+the+FBJ+murine+osteosarcoma+virus.">Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus.</a> Virology. 116, 221-235 (1982).</li><li>Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+FBJ+murine+osteosarcoma+virus+genome:+molecular+cloning+of+its+associated+helper+virus+and+the+cellular+homolog+of+the+v-fos+gene+from+mouse+and+human+cells.">Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells.</a> Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).</li><li>Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+fos+proteins:+a+comparative+analysis.">Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis.</a> Cell. 36, 259-268 (1984).</li><li>Herdegen, T., Leah, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+constitutive+transcription+factors+in+the+mammalian+nervous+system:+control+of+gene+expression+by+Jun,+Fos+and+Krox,+and+CREB/ATF+proteins.">Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins.</a> Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).</li><li>Dragunow, M., Faull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+c-fos+as+a+metabolic+marker+in+neuronal+pathway+tracing.">The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing.</a> J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).</li><li>Bullitt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+c-fos-like+protein+as+a+marker+for+neuronal+activity+following+noxious+stimulation+in+the+rat.">Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.</a> J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).</li><li>Greenberg, M. E., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+3T3+cells+induces+transcription+of+the+c-fos+proto-oncogene.">Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene.</a> Nature. 311, 433-438 (1984).</li><li>Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+epidermal+growth+factor+induce+rapid+transient+changes+in+proto-oncogene+transcription+in+PC12+cells.">Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells.</a> J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).</li><li>Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+c-fos+gene+and+protein+by+growth+factors+precedes+activation+of+c-myc.">Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc.</a> Nature. 312, 716-720 (1984).</li><li>Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercapnia+induces+c-fos+expression+in+neurons+of+retrotrapezoid+nucleus+in+cats.">Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats.</a> Brain Res. 635, 353-356 (1994).</li><li>Teppema, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+c-fos+in+the+rat+brainstem+after+exposure+to+hypoxia+and+to+normoxic+and+hyperoxic+hypercapnia.">Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia.</a> J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).</li><li>Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos-like+immunoreactivity+in+the+cat's+neuraxis+following+moderate+hypoxia+or+hypercapnia.">c-fos-like immunoreactivity in the cat's neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia.</a> J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).</li><li>Bodineau, L., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+and+hypothalamic+areas+activated+by+tissue+hypoxia:+Fos-like+immunoreactivity+induced+by+carbon+monoxide+inhalation+in+the+rat.">Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat.</a> Neuroscience. 108, 643-653 (2001).</li><li>Erickson, J. T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+electrical+stimulation+of+the+carotid+sinus+nerve+induce+Fos-like+immunoreactivity+within+catecholaminergic+and+serotoninergic+neurons+of+the+rat+brainstem.">Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem.</a> J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).</li><li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+in+utero+caffeine+exposure+on+respiratory+output+in+normoxic+and+hypoxic+conditions+and+related+changes+of+Fos+expression:+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions:+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat.">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-sensing+properties+of+the+newborn+rat+ventral+medullary+surface+in+vitro.">Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro.</a> J Physiol. 577, 55-68 (2006).</li><li>Voituron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kreisler+mutation+leads+to+the+loss+of+intrinsically+hypoxia-activated+spots+in+the+region+of+the+retrotrapezoid+nucleus/parafacial+respiratory+group.">The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group.</a> Neuroscience. 194, 95-111 (2011).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. , e3564 (2012).</li><li>Rousseau, J. P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+on+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations+from+newborn+rodents+allows+neural+respiratory+network+output+recording.">Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording.</a> J Vis Exp. , e53071 (2015).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+and+hypothalamic+areas+involved+in+respiratory+chemoreflexes:+a+Fos+study+in+adult+rats.">Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats.</a> Brain Res. 857, 30-40 (2000).</li><li>Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+changes+in+Fos-like+immunoreactivity+evoked+by+hypoxia+in+the+rat+brainstem+and+hypothalamus.">Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus.</a> Brain Res. 877, 149-159 (2000).</li><li>Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fos+study+of+ponto-medullary+areas+involved+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression.">Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).</li><li>Takakura, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+chemoreceptor+inputs+to+retrotrapezoid+nucleus+(RTN)+CO2-sensitive+neurons+in+rats.">Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats.</a> J Physiol. 572, 503-523 (2006).</li><li>Mulkey, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+control+by+ventral+surface+chemoreceptor+neurons+in+rats.">Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats.</a> Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).</li><li>Finley, J. C., Katz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+organization+of+carotid+body+afferent+projections+to+the+brainstem+of+the+rat.">The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat.</a> Brain Res. 572, 108-116 (1992).</li><li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+a+new+physiological+role+for+brain+apelin+in+the+regulation+of+hypothalamic+oxytocin+neurons+in+lactating+rats.">Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats.</a> Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).</li><li>Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+arrangement+of+hypercapnia-activated+cells+in+the+superficial+ventral+medulla+of+rats.">Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).</li><li>Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+adenosinergic+A1+systems+in+the+occurrence+of+respiratory+perturbations+encountered+in+newborns+following+an+in+utero+caffeine+exposure.+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Neuroscience. 127, 505-518 (2004).</li><li>Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+patterns+of+c-fos+expression+in+the+central+nervous+system+after+seizure.">Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure.</a> Science. 237, 192-197 (1987).</li><li>Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+c-fos+protein+in+brain:+metabolic+mapping+at+the+cellular+level.">Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level.</a> Science. 240, 1328-1331 (1988).</li><li>Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+temporal+and+spatial+distribution+of+JUN,+FOS,+and+KROX-24+proteins+in+spinal+neurons+following+noxious+transsynaptic+stimulation.">Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation.</a> J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).</li><li>Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suckling-induced+activation+of+neural+c-fos+expression+at+lower+thoracic+rat+spinal+cord+segments.">Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments.</a> Brain Res. 954, 100-114 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

C-fos, bir erken gen, ve bunun, ürünün tespiti, c-fos protein klasik in vivo 11,13,25,28 belirli respiratuvar nöral popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılan ve ex vivo 16-18 27,32,33. Protokolün içinde kritik adımlar perfüzyon adımı sırasında dikkatli olun. % 4 PFA çözüm iyi hazırlanmış olmalı ve sabitleme ve post-fiksasyon adımlar optimum dilimleme ve boyama elde etmek için yeterince uzun olmalıdır. Ayrıca, vahiy prosedürünün en önemli adımdır; Steyn etmenin yoğunluğu arka plan gürültüsünü önlemek için kontrol edilmelidir. Mevcut Yöntemlerine Göre Tekniği ve Önemi Avantajları Bazı nöronlar, beni bu c-fos geni 5 ifade görünmemektedir rağmenmetod ile sinir yolları, kimyasal zorluklar sırasında solunum ritim uyarlamasında, örneğin aktif belirlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Diğer hemen erken gen ile karşılaştırıldığında, c-fos, bir test durumu 6 altında, nöronal aktivitenin daha kolay sayılmasına olanak tanıyan, uyarı olmadan düşük bir ifade yer alır. c-fos algılama çok uyarıcıya yanıt olarak dahil sinir hücresi popülasyonlarını analiz etmek için aktivite genel değişiklikleri gösteren bir hücresel bir tekniktir. Aktif tanımlamak için, bu nedenle hücre sayıda aktivite değişiklikleri takdir belirlenmiş bir beyin bölgesindeki hücrelerin sadece küçük bir zaman endişeleri en, c-fos tespiti bir izin veren bir elektrofizyolojik yaklaşımı kullanarak nöronal aktivite analizi ile karşılaştırıldığında bütün MSS alanları. C-FOS algılama elektrikli tarafından nöronal aktivitenin kayıt sırasında durum böyle değil, pervasız ve uyanık hayvanlar ile kolayca uyumluophysiology. stresi ve elde edilen sonuçlar ile anestezik girişimi önler, çünkü bu bir avantajdır. Ex vivo biz stimülasyon 30 dakikalık bir süre kullanılmıştır. Daha önce, bu uyarım nöronal seviyede 34-36 si c-fos ekspresyonu değişiklikleri oluşturmak için yeterli olduğu gösterilmiştir. Stimülasyon beş dakika 15-20 dakika 37 bir latent dönem sonra gözlenir c-fos ekspresyonu değişiklikleri uyarılması için yeterli olmaktadır. C-fos ekspresyonu benzer artışlar uyarımın ilk 10 dakika boyunca aktivitesi yer alarak değişiklikler ile ilişkilidir. Tekniğin Sınırlamalar Uyarmayı müteakip, bir gecikme çekirdeğinde, c-fos birikmesi gerekli olacaktır. yaklaşık 30 dakika bu gecikme, mRNA ve protein sentezi karşılık gelir. Bu öğe obta olabilir sonuçların yakınlık karşı çıkıyorelektrofizyoloji ile nöronların aktivitesini kaydederek çağırın. Bu özel ve geçici uyaran sonrası nöronal aktivitenin hızlı değişimler hakkında bilgi kaybına neden olabilir. C-fos proteini 100 dakika 4 90 bir yarı-ömre sahip gibi, ekspresyonu çevresi hayvan manipülasyonu olarak, sınırlama veya değişikliklerle ilişkili cerrahi prosedürler veya stres etkilenebilir. Bu nedenle, incelenen uyarıcı ile ilgili olmayan nöronal aktivitenin değişikliklere neden olabilir ve fizyolojik uyarıcı sonunda hemen sonra, doku örnekleme yapmak manipülasyonlar en aza indirmek için gereklidir. Tekniğin Değişiklikler ve Sorun Giderme Bu protokolde, vahiy adım 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorür, nikel amonyum sülfat ve hidrojen peroksit içeren bir çözüm kullanılan, ancak peroksidaz ticari kitler al olabilirbu nedenle bu aşama için kullanılır.

C fos geni 1980 1,2 başında ilk kez belirlendi ve ürün gen aktivatör özellikleri 3,4 sahip olan bir çekirdek protein olarak 1984 yılında tanımlanmıştır. Bu nöron uyarılması ile ilişkili uzun vadeli mekanizmalarına katılır. Gerçekten de, nöronal aktivite değişiklikler transkripsiyon faktörü, c-fos üretimini indükleyen erken gen c-fos ekspresyonunu indükler ikinci haberci sinyal iletim yol açar. Ikinci geç genlerinin ekspresyonunu başlatan ve böylece uyarıcı 4 birçok farklı türde sinir sisteminin adaptif karşılıklara katılmaktadır. Böylece, 1980 5,6 yılı sonundan itibaren, c-FOS protein tayini sıklıkla nöronal yolları dışarı haritalama için genel 4&#39;te ve merkezi sinir sistemi (MSS) aktivitesi üzerine gen transkripsiyonu üzerinde dışsal faktörlerin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur farklı fizyolojik yerark koşulları. Bazal c-fos ekspresyonu fare, sıçan, kedi, maymun ve insan da dahil olmak üzere 4 çeşitli türlerde incelenmiştir. Böylece, kendi ifadesinin kinetiği nispeten iyi bilinmektedir. Transkripsiyon aktivasyon (5-20 dakika) 7,8 hızlıdır, ve mRNA birikimi stimülasyon 9 başlamasından sonra 30 ve 45 dakika arasında bir maksimuma ulaşır ve 12 dakika gibi kısa bir yarı-ömrü azalır. C-fos protein sentezi mRNA izler ve 20 ila 90 dakika sonrası uyarım 6&#39;da imünohistokimya ile tespit edilebilir. C-fos ekspresyonunun analizi klasik hipoksi ve hiperkapni 10-14 solunum yanıtlarında rol oynayan merkezi solunum ağı tanımlamak için, in vivo çalışmalarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, bu araç da hipoksi veya h merkezi solunum ağ uyarlamalar keşfetmek için eks vivo beyin preparatlarda kullanılanypercapnia 15-18. Nitekim, bu preparatlar klasik santral solunum sürücüye 19 asimile ritmik bir aktivite oluşturur. Bu nedenle, bu hazırlık tür tamamen deafferented olma avantajına sahiptir ve bu nedenle, c-fos ekspresyonunu ilgili sonuçlar sadece periferal yapıların herhangi bir müdahale olmadan, merkezi bir uyarım sonuçlarını yansıtmaktadır. c-fos algılama immünohistokimyasal ya da immunohistofluorescence yaklaşımlarla yapılabilir. Dolaylı immunodeteksiyon c-fos karşı birincil antikor ve birinci antikorun üretildiği türlere karşı yönlendirilmiş bir ikincil antikoru kullanılmasını gerektirir. Immünohistokimyasal yöntemle, ikincil antikor, bir alt-tabaka (peroksidaz için H2O 2) üzerinde hareket eden bir enzim (örneğin peroksidaz) birleştirilir. enzimatik reaksiyonun ürünü, bir kromojen (3.3-diaminobenzidin tetrahydrochlorid tarafından geliştirilene), burada leke ve ışık mikroskobu altında gözlemlenebilir. Reaksiyon nikel amonyum sülfat kullanılarak takviye edilebilir. Bu yöntemler, farklı fizyolojik uğraşlarınızda aktif nöronların algılama ve bu nedenle tanımlama ve / veya üst üste fizyolojik yanıtlar dahil periferik ve merkezi yolların eşleme sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture plate 12-Well</td>
			<td style="width:71px;">Costa</td>
			<td style="width:119px;">35/3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:216px;">15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3477</td>
			<td style="width:167px;">The 15mm diameter well inserts have 74&#181;m polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-52</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vectastain Elite ABC KIT&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Vector laboratories</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">PK-6101</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(Rabbit IgG-secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaH2PO4*2H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH 0.1N</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">43617</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyvinyl-Pyrrolidone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PVP-360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene-glycol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33068</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisma HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T5941</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisma Base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Rockland</td>
			<td style="width:119px;">DAB50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nickel ammonium sulphate</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">12519</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2O2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33817</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Entellan Neo</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">107961</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-scientific</td>
			<td style="width:119px;">1014356190</td>
			<td style="width:167px;">Superfrost ultraplus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glass</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q10143263NR1</td>
			<td style="width:167px;">24 x 60mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the c-fos protein immunohistological detection: a useful tool as a marker of central pathways involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo

Birçok çalışma, belirli fizyolojik düzenlemelere yer alan beyin bölgeleri belirlemek ve harita çalışırlar. Proto-onkogen, c-fos, ani erken gen çeşitli uyaranlara yanıt olarak nöronlar olarak ifade edilir. protein ürünü hali hazırda aktiviteleri değişiklikleri göstermek nöron gruplarını harita c-fos algılama kullanımına yol immünohistokimyasal teknikler ile saptanabilir. Bu yazıda, hipoksi veya Hiperkapniye solunum sistemi adaptasyonu dahil beyin sapı nöronal popülasyonlarının belirlenmesi üzerinde duruldu. Iki yaklaşım hayvanlarda in vivo nöral popülasyonlarının belirlenmesi amacı ile tarif edildi ve ex vivo deafferented beyin preparasyonlarda. İn vivo koşullarında, hayvanlar. Hiperkapnik ya da hipoksik gaz karışımlarının maruz ex vivo, deafferented preparasyonlar hipoksik ya hiperkapnik yapay serebrospinal akışkan madde ile süperfuz edildi. Her iki durumda da, ya kontrol in vivo hayvan ya da eX in vivo preparasyonlar normoksik ve normokapnik koşullar altında muhafaza edilmiştir. Bu iki yaklaşımın karşılaştırılması nöronal aktivasyon yani kökeni, belirlenmesini sağlayan periferal ve / veya merkezi. In vivo ve ex vivo, brainstems, toplanan sabit ve bölüme dilimlenmiş bulundu. kesitler hazırlandı kez, c-FOS proteini immünhistokimyasal tespiti hipoksik veya hiperkapnik uyarılarla aktive hücrelerin beyin sapı gruplarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Etiketli hücreler beyin sapı solunum yapılarda sayıldı. kontrol koşulu, hipoksi veya hiperkapni ile kıyaslandığında, böylece santral solunum sürücü adaptasyonu nöral yolların kurucu birkaç spesifik beyin sapı sitelerinde c-FOS işaretli hücrelerin sayısı arttı.

C-fos algılama gibi in vivo (Şekil 2a) hipoksi ve hiperkapni veya bu koşulların ex vivo olarak (Şekil 2B) taklit durumlarda, belirli koşullar altında aktive edilmiş hücrelerin belirlenmesi gruplarını sağlayan bir araçtır. İn vivo koşullarında, yeni doğmuş, genç ya da yetişkinlere kemirgen gaz halindeki bir ortam sürekli tam 30 ila 180 dakika 13,25,26 (Şekil 2A) için tanımlandığı bir bileşim ile bir gaz karışımı ile yenilenir olan hava sızdırmaz bir kutu içine yerleştirilmiştir. Bütün vücuda stimülasyon eylemleri gibi, c-fos, ilgili değişiklik, merkezi ve çevresel aktif yolları hem yansıtıyor olabilir. Ex vivo, medulla oblongata ve omurilik içeren deafferented preparasyonlar sürekli farklı seviyelerde olan bir ACSF superfused bir bölme içine yerleştirilmiştir hipoksik ya hiperkapnik koşulları modellemek amacıyla, O 2 ya da pH ( <strong&gt; Şekil 2B), 30 dakika 16-18,27 için. uyarılması, sadece bu deafferented preparasyonlarda hareket gibi, sadece merkezi mekanizmalar, c-fos tanımlanan yapılarda hücrelerinin aktivasyonu dahil olduğu sonucuna varmak mümkündür. Merkezi sinir sistemi, in vivo sistemik dolaşım yoluyla perfüzyon yoluyla, PFA ile sabitlenmiş ya da olan bir daldırma ex vivo olarak (Şekil 3) ile incelenmiştir. Bu farklılık nedeniyle, sabitleyici difüzyon daha ex vivo, in vivo olarak daha uzundur. Böylece, c-FOS sinyali özellikle derin yapılarda, etkilenebilir. C-fos analiz her zaman kontrol arasındaki karşılaştırmalı bir yaklaşımla gerçekleştirilmiştir ve in vivo hayvan ya da ex vivo preparasyonlarda uyarılır Ancak, bu fark kontrol sıkı bir karşılaştırma sonuçları müdahale ve veri uyarılmış değildir. Bundan sonra, MSS, cryoprotected kesitli ve im meşgul oldumunohistochemical prosedür (Şekil 3, Şekil 4). Bu şekilde, bazı solunum beyin bölgeleri, CO &#39;nin başlıca merkezi Alanı 2 kemo-alış 10,13,28,29 olan retrotrapezoid çekirdeği (DÖNÜŞ) de dahil olmak üzere, hipoksik veya hiperkapnik zorlukları altında aktivitesini modifiye in vivo olarak tanımlanmıştır ventrolateral medulla karotis organları giriş 13,25,26,30 (Şekil 5 projeksiyon alanları (/ mnts c) inspiratuar ritim jeneratörü 13, commissural ve nükleus traktus solitarius medyan bölümden oluşmaktadır (VLM), ), ve medüller rafe çekirdekleri 12,13. Ex vivo, deafferented koşullarda, RTN ve VLM nöronları indirgenmiş O 16-18 Şubat koşulları altında, c-fos immünoreaktivitesi değiştirme tarif edilmiştir. c-fos derunma Ayrıca, aktive edilmiş hücreler 14,31 fenotipinin karakterize etmek için diğer immünohistokimyasal algılamaları ile birleştirilebilir <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53613/53613fig1.jpg" /> Hipoksi veya hiperkapni Solunum uyarlamalar ilgilendim Nöronal Yapılar Harita c-FOS Algılama Kullanımı için Şekil 1. Çalışma Dizaynı. MSS c-FOS algılama tekniği Kronolojik adımlar. CNS: Santral Sinir Sistemi; İHK:. İmmünhistokimya <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53613/53613fig2.jpg" /> Şekil 2, c-fos indüksiyonu (A). In vivo indüksiyonu protokolü. Bir hayvan hermetik C yerleştirilmiştirhamber ve hava (% 21 O2;% 79 N2) ya da maruz kalan, hiperkapnik (% 21 O2;% 4 CO2,% 75 N2) ya da hipoksik (% 10 O2;% 90 N2) gaz 2 saat süre ile bir karışımı. (B) &#160; Ex vivo indüksiyon protokolü. CNS 0 ila 4 gün arası yenidoğan kemirgen dışarı disseke edildi. Medulla oblongata ve omurilik hazırlıklarını elde etmek için büyütme altında izole edildi. Bunlar 26 ± 1 ° C &#39;de aCSF (pH 7.4) ile süperfüze yukarı bakacak şekilde ventral yüzeyi olan bir bölme içine yerleştirilmiştir. In vivo Modelleme hipoksik uyarım% 95 N 2 ve% 5 CO 2 içeren bir anoksik gaz karışımı köpüren tarafından aCSF içinde O 2 kısmını azaltarak gerçekleştirildi. In vivo hiperkapnik uyarımı modelleme NaHCO 3 konsantrasyonunun (azalış) açısından normal aCSF farklılık bir asit aCSF kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Asit aCSF O 2 ve Adju ile doymuş% 95 O2 ve% 5 CO2 ile köpürme pH 7.23 ile sted. Her uyarım durumu 30 dakika boyunca tatbik edilmiştir. aCSF. yapay beyin omurilik sıvısı <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53613/53613fig3.jpg" /> Şekil 3. sinir merkezi sistemi, örnekleme. İn vivo koşullarında, merkezi sinir sistemi vasküler sistem üzerinden perfüze% 4 paraformaldehid ile tespit edici işlemden sonra diseksiyon ile elde edildi. Ex vivo, merkezi sinir sistemi ile doğrudan ayrıldıktan sonra,% 4 paraformaldehid içinde daldırılmıştır. Daha sonra, merkezi sinir sistemi, bir kriyokoruyucu çözeltisine daldırma ile kriyo-korumalı bir kriyostat kullanarak 40 mikron kalınlığındaki taç kesitler halinde kesilmiştir. medulla Rostro-kaudal bölümler befor PBS içeren 12 oyuklu bir plaka içerisinde yerleştirildie immünohistokimyasal işlemler. CNS: Santral Sinir Sistemi; PBS:. Fosfat Tamponlu Tuzu <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53613/53613fig4.jpg" /> Şekil 4. dolaylı immünohistokimyasal yöntemleri. Bölümleri önce, c-fos proteine ​​karşı tavşan poliklonal birincil antikor ile inkübe edilmiştir. Daha sonra, birincil antikor karşı biyotinile edilmiş keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile tedavi edildi. Bu inkübasyonun ardından, kesitler sinyali güçlendirme özelliğine sekonder antikor sıkıca bağlanan bir avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi ile tedavi edildiler. Gerçekten de, kompleks, yüksek boyama yoğunluğuna gelen birçok peroksidaz moleküller içerir. Son olarak, bölümler 3.3-diamino bir çözeltisi kullanılarak boyandıobenzidine tetrahidroklorür ve peroksidaz enzimi varlığında koyu gri çökelti üreten nikel amonyum sülfat. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53613/53613fig5.jpg" /> Şekil 5 in vivo hipoksi gönderilen kontrol farelerinde ve farelerde medulla oblongata bölümleri c-fos pozitif nöronlarının. Paxinos ve Franklin 24 (bregmadan -7, 48 mm uyarlanan medulla oblongata bir bölümü (A) Çekme ). Noktalı alan nükleus traktus solitarius c / MNC commissural ve medyan parçaları delimitates. kutusu Mikroskobik (B1 ve B2) ile izah yapıları gösterilmektedir. (B) Photomicrographs c / mnts seviyesi normoxia (B1. kontrolü, siyah çerçeve) veya hipoksi altında (B2. mavi çerçeve) (x100) uygulandı. Siyah oklar, c-fos-pozitif hücrelerin göstermektedir. (C) normoxia (siyah çubuk) veya hipoksi (mavi bar) altında c / mnts düzeyinde Bölüm başına c-FOS-pozitif hücrelerin ortalama sayısını gösteren Histogram. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. * Normoxia ve hipoksi değerleri arasında anlamlı bir fark gösterir - Öğrenci eşleştirilmemiş t testi; *** P &lt;0.001. CC: omuriliğin merkezi kanal; c / mnts. nükleus traktus solitarius ve commissural ve medyan parçalar <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53613/53613table1.jpg" /> Tablo 1. Immünohistolojik Prosedürü. CF kronolojik adımlarİşletim prosedürü. AB-I, birincil antikor; Ab-II, ikincil antikor; BSA, sığır serum albümin; DAB, 3.3-diaminobenzidin tetrahidroklorür; Ni, nikel, amonyum sülfat; PBS 0.1 M, 0.1 M fosfat tamponlu tuz (pH 7.4); PBST, 0.1 M fosfat tamponlu tuz ile takviye edilmiş% 0.3 Triton X-100; Serum, ikincil antikor üretimi için kullanılan türlerden alınan serum. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53613/53613table1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

c-FOS Protein Immünohistolojik Algılama: Belirli Fizyolojik Yanıtları ilgilendim Merkez Pathways bir Marker Olarak Faydalı Aracı<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; Ex Vivo</em

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

the-c-fos-protein-immunohistological-detection-useful-tool-as-marker

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

33.2K Görüntüleme.  University Paris 13. Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Video: The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Görselleştirme ve miktar Mezenkimal hücre Adipojenik farklılaşma potansiyeli bir Lineage belirli Marker ile

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...