This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan tam kan örnekleri insan denekleri araştırma olarak kabul edilmez. örnekler memnun edildi klinik tanı amaçlar için elde edilmiş ve bu örneklerin kalan kısmı FINA araştırma deneyi için sağlanmıştır. Numuneler araştırmacılar kolayca bireylerin kimliğini tespit etmek mümkün değildi böyle kodlanmıştır. FINA Numune Hazırlama Modülü 1. Hazırlık <ol><li> A 2.6 mm 35 x 35 mm 2 kalınlığında% 100 pamuklu ped keserek pedi kurutma hazırlayın. örnek başına bir tane yastığı kesin. </li><li> ve daha sonra bir çekiç tahrik delik yumruk kullanarak bant merkezinde 7.14 mm çapında bir delik delme (50 (w) mm 25 mm (h)) parafin film kesme parça kağıt bant ile plastik parafin filmi hazırlayın. örnek başına bir bant hazırlayın. </li><li> Bir 8.35 mm çaplı daire delme bir bağlı cam kan ayırıcı membran (zar yakalama) diski hazırlayınBir çekiç tahrik delik kullanarak. örnek başına bir diski yumruk. Disk 2.3 um olan bir partikül tutma yeteneğine sahiptir. </li><li> forseps kullanarak lekeleme pad merkezinde yakalama diski koyarak FINA örnek hazırlama modülü monte edin. parafin bant delik maruz yakalama diskin merkezine bırakır, böylece yakalama disk üzerinde parafin filmi bandı yerleştirin. </li><li> lekeleme pedi kapsayacak şekilde hafifçe parafin bant germe ve diskin tüm kenarlarda blot pad sopa sıkıca parafin bant basarak disk ve lekeleme ped arasındaki maksimum temas sağlamak. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar modülleri yapın. </li></ol> qPCR Tube 2. Hazırlık <ol><li> çift ​​kaplamalı Polye bir daire delme ile floresan algılama engelleme zarın önlemek için qPCR tüpün yanına hücre yakalama zarını demir atacak 5.1 mm&#39;lik bant diski hazırlayınbant sacdan bir çekiç tahrik yumrukla teşhis bant kayit yaptirilabilir. örnek başına bir bant diski hazırlayın. </li><li> Bandın etiket astarın bir tarafını kaldırın. bir yüzüne ve tüpün dibine doğru yapışmasını 200 ul PCR tüp içine bandı yerleştirin. İkinci etiket kaplamasını çıkartın. Tüp şimdi hazırlanmış diski almaya hazırdır. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar tüpleri üretin. </li></ol> 3. contrive Kan Numune Not: gerçek bir test numunesi hazırlanmaktadır ediliyorsa, 4. adıma geçin. <ol><li> Viroloji Laboratuvarı Kalite Güvence elde edilen HIV-1 Provirüsün tek bir kopyasını barındıran Çözülme 8E5-LAV hücreleri 15 (MYK; Rush Presbyterian / St Luke Tıp Merkezi, Chicago, IL.). Not: / ml 4000 hücre konsantrasyonunda dondurulmuş hücre peletleri olarak depolanır. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 hücre sayısı kontrol edildi. </li><li> ser hazırlayın/ Ul 1 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlara ortamı (% 90 fetal sığır serumu,% 10 dimetil sülfoksit) donma ial dilüsyon. </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine seri sulandırmaların her birinin arasında pipetleyin 10 ul hücre. 8E5-LAV kopya sayılarının 10-4,000 bir standart eğri oluşturmak için her bir tüpe, taze, HIV-1 negatif EDTA tedavi tam kan örneği 100 ul ekle. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. </li></ol> 4. FINA Ekstraksiyon gerçekleştirin <ol><li> 110 ul tam kan ve aşama 3,3 hücreler)% 1 (11 ul,% 10 Triton-X100 içinde bir son konsantrasyona kadar Triton-X100) eklenerek lize kan hücreleri. </li><li> yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. Kan saydam kırmızı renkte olmalıdır. </li><li> Pipetleyin yakalama diske kan örneğinin tüm. Not: parafin bant ve yakalama membranı arasında bir su geçirmez mühür kan zarından akan sağlar ve yakalama m arasında iyi temaszarı böylesine ve kurutma ped montaj hızlı numune fitilleme sağlar. </li><li> Örnek filtresinden bekletin. Not: kılcal eylemi lekeleme pedine kan lizatı fitilleri, yakalama diskin yüzeyi üzerinde genomik DNA yakalama. o mat göründüğünde lizat disk içine batırılmış gelmiştir. </li><li> yakalama diske 600-1,000 ul 10 mM NaOH damla damla ekleyin. Not: Yıkama tamponu, 600 ul bir hacim ilave olarak eklenebilir. tampon hidrofobik parafin kasete bir damlacık oluşturur ve yaklaşık 20 saniye içinde diske delikten fitil olacak. Filtre hemoglobin beyaz belirten temizlenmesi için kırmızı değişecektir. </li><li> forseps ile lekeleme pedi disketi ayırın ve hazırlanan PCR tüpünde bant diski uygulayın. Filtre üzerinde kalan herhangi bir kırmızı varsa tüp içinde yerleştirmeden önce filtreyi temizlemek için yıkama tamponu 50-100 ul ekleyin. Not: Nadiren, aşırı basınç hazırlanmasında kullanılanlekeleme pad ayrılma sırasında zar katmanlarının bölümleme FINA modülleri sonuçları. Bu diskleri atın ve taze bir örnek hazırlamak. </li><li> Filtre PCR tüpünde yerleştirildikten sonra, hemen numuneleri analiz. Alternatif olarak, bir kutu içeren kalsiyum sülfat kurutucu kuru bir gecede, daha sonra analiz için hazır olana kadar silis kurutucu ve mağaza ile bir folyo kese içinde kap ve yer. </li></ol> 5. qPCR Reaksiyon <ol><li> Daha önce 9,11 açıklandığı gibi HIV spesifik primer ve problar kullanılarak reaksiyon başına 100 ul qPCR master karışımı hazırlayın. Bir iç amplifikasyon kontrolü amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı izlemek için ve negatif örnek bir gerçek negatif olduğunu doğrulamak için ekleyin. Filtre tamamen ana karışımı ile ve filtre reaksiyon boyunca tüpün yanına sabitlenmiş kalmasını kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Daha önce 9 tarif edilen bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hızlı tedavi erişimine bağlı EID nedeniyle HIV enfeksiyonuna 16 bebek ölümlerini azaltmak için ortaya konmuştur. Çünkü bir bebeğin kanında anne antikorların kalıcılığı, hızlı HIV antikor testleri, HIV-maruz kalan bebeklerin durumunu belirlemede yarar sınırlıdır. DSÖ, HIV-1 pozitif annelerden doğan tüm bebeklerin bir virolojik testi 17 kullanılarak, yaş 4-6 hafta test edilmelidir önerir. Biz 61 Güney Afrikalı bebekler 11 küçük alan değerlendirmesinde göstermiştir% 100 duyarlılık ve özgüllük ile tek kopya algılama yeteneğine sahiptir tam kan örneklerinde HIV-1 proviral DNA tespiti ve miktar tayini için bir tahlilin gelişimini bildirmişlerdir. Yüz mikrolitre ya da bütün kan daha parmak veya topuk çubuk yoluyla toplanmış ve FINA modülleri 18,19 ile işlenebilir. Bu kan örnekleri daha sonra amplifikasyon bu yöntem ide yapmadan önce, en az bir ay depolanabiliral laboratuvarlar uzak bebekleri test etmek için. Şekil 3 HIV-1 Negatif tam kandan zoraki örneklerin standart bir eğri sunulan çalışmada Eritilen hücreler, tasvir edilmiştir, HIV-1 proviral DNA barındıran ile arttı. Bu çalışmaya bir uyarı örnek eklenir bazı hücreler nedeniyle zaten potansiyel hedef algılama düzeyini gelişmiş olabilirdi donma / çözülme, için parçalanmış olabilir olduğunu. Daha sıkı deneysel tasarım daha doğru tam kan taklit olurdu taze kültür hücreleri kullanarak örnek yapmacık olması olurdu. FINA örnek hazırlık yöntemi sınırlı kaynak ayarlarını 8 kullanılmak üzere (geliştirilme aşamasındadır) bir EID POC qPCR cihazın içine dahil edilmek üzere dizayn edilmiştir; Ancak, burada açıklanan manuel biçimi de bir laboratuvarın örnek hazırlık portföyüne yararlı bir ek olabilir. FINA yıkamak, bağlama kullanmak ve Kurutucuyla kullanılan stratejiyi Zehir değilAyıklanan nükleik asitleri sulandırır ed kan lekeleri ve diğer kağıt tabanlı emiş sistemleri muhtemelen sub-optimal algılama hassasiyeti 5 yol açar. FINA sistemi son derece esnek ve kolayca proviral HIV DNA tespiti yanında başka genetik testleri için uyarlanabilir. kan veya diğer biyolojik örneklerin alt hacimleri daha az bol olanlar için bol hedefler ve daha yüksek miktarlar için işlenebilir. FINA sistemi orijinal düzenlemede, bir kan ayırma membranı kullanılarak, tam kan hücreleri yakalama ve daha sonra 10 mM NaOH 9 eklenerek bunları lize. Bu sürüm, bir az sayıda kullanıcı adım avantajına sahiptir, fakat işlenebilir hücre sayısı / kan hacmi daha küçüktür. Bu raporda kullanılan ilişkili bir cam membran ek olarak, diğer kan ayrılması ya da kan toplama filtre kağıtları, bu yöntem ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve çeşitli kantitatif PCR araçları da F gömülü şablonu amplifiye gösterilmiştirilter diski 9. tek şart filtresi real-time PCR aracının floresan okuma bloke olmamasıdır. FINA ekstre önemli bir sınırlama, yakalama membran çapına bir boyut kısıtlaması olmasıdır. 9 mm &#39;den daha büyük bir zar olan bir disk, reaksiyon karışımına maruz kalan yüzey alanı sınırlandıran bir tüp içinde membran üst üste olmayan bir 200 ul qPCR tüpü içerisine yerleştirilmiş olamaz. Ayrıca, disk çapı daha büyük, daha qPCR reaksiyon hacmi maliyetini artırır filtreyi karşılamak ve dönüş etrafında zamanı testinin için gereklidir. Filtre verimli numune DNA yakalamak için çok küçükse, verimli yıkama engelliyor tıkayabilir. Bağlı cam yakalama membranı kullanılarak, bütün kan örneklerinden, HIV-1 proviral DNA olup, viral RNA yakalamak mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Alternatif membranlar veya tamponlar t kullanılabilir eğer biz bilmiyoruzO RNA&#39;nın izolasyonu yerine veya DNA ilave olarak teşvik eder. okuyucu yalnızca örnekten DNA izole etmek istiyorsanız bu protokol bazı protokoller ile gerekli RNA enzimatik kaldırılmasını gerektirmez. EID hassasiyetini ve RNA tespiti bu eksikliği artıracak klinik örneklerde HIV-1 RNA ve DNA hem algılama tanı testi bir sınırlama yoktur. Yeni bir tahlile FINA işlemi uyum en önemli nokta, örnekte, örneğin, DNA, hücre sayısı miktarını karşılamak için test edilecek olan filtre büyüklüğü kontrol etmektir. Daha küçük yakalama diskler kullanılabilir, böylece genel FINA çıkarma hücrelerin küçük sayılarla örnekleri ile en iyi şekilde çalışır. Filtrenin bağlama kapasitesini belirlemek için, sadece toplama membran altında yığılmış FINA modüle ikinci bir filtre diski ekleyin. örnek ekleyin ve adım 4,1-4,5 gibi membranları yıkamak. Ayrı qPCR tüpleri ve amp içine DNA yakalama disklerin her koyunlify. bir standart eğri kullanılarak, her bir filtre üzerinde tutulur giriş DNA oranında belirler. filtre büyüklüğü tahlilinde ihtiyaçlarına optimize edilebilir. Hücre lizatı filtre üstün tespit özellikleri sağlayan (yayınlanmamış gözlemler) ilave edilir Burada tarif edilen FINA proviral DNA testi için, insan genomik DNA&#39;sından fazlasını% 99 yakalanır. EID ek olarak, FINA gelecek uygulamalar bağlı anti-retroviral tedavi, viral bastırma elde hastaların HIV-1 hastalığı izlenmesi için bir belirteç olarak algılama ve proviral DNA kantitatif içerebilir. HIV eradikasyonu amacıyla tedavi izleme, HIV-1 ile enfekte hücrelerin rezervuarlar için periferik kan dışında diğer girdileri tarama tarafından da yapılabilmektedir. HIV Proviral testi de doğrudur enfeksiyon için aşı deneme konularını taramak için kullanılabilir. Kan örnekleri FINA modüllerde depolama sırasında stabil ve ce daha sonra sevkiyat için tarla koşullarında alınabilirepidemiyolojik çalışmalar için bu yöntem idealdir PCR analizi için ntral laboratuarlar. HIV-1 tespit ek olarak, bu son derece esnek bir yöntem, aynı zamanda farmakogenetik tarama ya da başka bir SNP tespiti veya hayvan modellerinde hızlı genotipleme için biyolojik örneklerinde bulunan hassas ilaç hedefleri amplifiye etmek için kullanılabilir. Ayrıca, FINA ile kullanılabilir örneğin helikaz göre amplifikasyonu (HDA) ya da döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), izotermal amplifikasyon yöntemleri şablon ekstre ya da DNA-gömülü filtre üzerinde, geleneksel PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılabilir.

Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları 1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test 6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji 7 adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır. Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını 8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların 12 varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon 9 kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi 13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları. FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi 11 tarafından serbest ya hücrelerinin 9 ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu 11 kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık. Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu, en az 2 dakika içinde tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı emici ped vasıtasıyla dikey filtrasyon kullanan yeni bir ekstraksiyon yöntemi. Kan numunesi deterjan, kısa bir süre karıştırıldı ile muamele edilmiş ve ayırma membranı şekilde kamış ile uygulanır. Lizat ayırma membranı yüzeyinde genomik DNA yakalama, kılcal eylemi lekeleme pedine fitilleri. Ekstre edilen DNA, PCR inhibitörleri, emici lekeleme pedine kötü burada basit bir yıkama aşaması sırasında zar üzerinde muhafaza edilir. yakalanmış DNA içeren zar daha sonra daha fazla arıtılmadan PCR reaksiyonuna ilave edildi. Bu basit yöntem laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen ve kolayca ucuz laboratuar malzemeleri ile uygulanabilir. Burada erken için bir model olarak, 100 ul tam kandan, HIV-1 proviral DNA&#39;nın son derece hassas algılama ve miktar tayini için bir protokol açıklarkolayca diğer genetik hedeflere adapte olabilir HIV fant tanı.

8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kandan proviral DNA çıkarmak için iş akışı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 2 FINA örnek modülü göstermektedir qPCR tüp hazırlanır Şekil. Zoraki örnekleri (Şekil 3) standart eğride gösterildiği gibi bu yöntem, farklı kopya numaraları de 8E5-LAV hücrelerinden, HIV-1 provirüs verimli amplifikasyonu için izin verir. PCR Verimliliği = -1 + 10 (-1 / eğim) hesaplanan,% 103 bir etkinliği vardı. Doğrunun denklemi r² = 0,996 bir korelasyon ile = -3.25x + 27.95 y oldu. HIV proviral DNA standart eğri Tablo 1 &#39;de görüldüğü gibi, aynı zamanda, yüksek ölçüde tekrarlanabilir amplifikasyon sahip çoğaltır. Buna ek olarak, hidroksipiruvat Redüktaz sayısından bağımsız FINA ile kan ekstrakte bir sonucu olarak ortaya PCR inhibisyonu olduğunu göstermek için mevcut olan 500 kopya bir iç kontrol mevcut HIV-1 provirüsün kopya (Şekil 4). IC amplifikasyonu verimli 21.92 ± 0.25 ortalama Cq ve% 1 bir CV ile, test edilen tüm 18 numune elde edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig1.jpg" /> Şekil 1: tam kandan proviral DNA tespiti için iş akışı qPCR için 8E5-LAV hücreleri ile çivili. Kan yakalama zara ve yıkama tamponu ilave edildikten sonra ilave edildikten sonra (A), sağdaki hazırlanan FINA modülü yaptı. QPCR Master karışımı ile çift kaplamalı bant yapışmış yakalama disklerle (B) qPCR tüpleri eklendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig2.jpg" /> Şekil 2: FINA içi modülü ve qPCR tüp hazırlanması. </stRong&gt; (A) Bir 8.35 mm çaplı yakalama membran disk kare 707 lekeleme pedi ve merkezi bir 7.14 mm çapında bir delik içeren parafin bant ince bir tabaka arasında sıkışmış olan bu tür parafin bant delik merkezli olduğunu pipet ile parçalanmış kan doğrudan uygulama için yakalama diski. (B) 5,1 mm çift kaplamalı polyester tanı bant 200 ul qPCR tüp tarafında kalmış. Bandın ikinci astar hazır olduğunda yakalama diski uygulamak için yapışkan yüzeyi açığa çıkarılır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54289/54289fig3.jpg" /> Şekil 3:., HIV-1 proviral DNA uydurulmasının örneklerin standart eğrisi 4 100 ul elde edilen (A), amplifikasyon çizimini, HIV-1 KD çoğaltır500 kopya / iç kontrol Katı hatlar = amplifikasyon araziler reaksiyonu ile 4,000, 400, 40 ve 10 8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kan gatif; Noktalı çizgi eşiğini =. Y ekseni floresans birimleri ve X ekseni qPCR döngü sayısı. Cq değerleri (B), standart eğriler 100 ul tam kan başına 8E5-LAV hücre günlük kopya sayısı karşısında amplifikasyon grafiğinden hesaplanmıştır. Doğrunun denklemi: y = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; PCR verimi = 103,23% Verimliliği hesaplanan = -1 + 10 (-1 / eğim) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54289/54289fig4.jpg" /> Şekil 4:. İç kontrol hidroksipiruvat Redüktaz Amplifikasyon kontrol plazmid reaksiyon başına eklenmiş qPCR inhibisyonu 500 kopya gösterir. Katıçizgiler = amplifikasyon araziler; Noktalı çizgi eşiğini =. IC Ortalama Cq 21.92 ± 0.25 =. CQS 21.21 den 22.32 arasında değişmektedir. varyasyon (% CV) katsayısı% 1 =; N = 18. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 8E5-LAV hücre / </td></tr><tr><td> 100 ul DB </td><td> Ave. cq </td><td> SD </td><td> ÖZGEÇMİŞ (%) </td></tr><tr><td> 4.000 </td><td> 16.27 </td><td> 0.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 19.54 </td><td> 0.15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 22.56 </td><td> 0.3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 24.83 </td><td> 0.15 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>4000 Ortalama Cq, standart sapma (SD) ve değişim katsayısı (% CV), 400, 40 ve FINA çıkarma ve HIV-1 spesifik primerler ile 8E5-LAV standart eğrinin 10 kopya: ge = &quot;1&quot;&gt; Tablo 1 sondalar. N = 4 WB = tam kan.

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Görüntüleme.  Northwestern University.  Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir. 

Video: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biyoloji

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.