This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

declaração de ética: amostras de sangue total utilizados neste estudo não são considerados pesquisa envolvendo seres humanos. Os espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico clínico, que foram satisfeitos, eo restante destes espécimes foi fornecido para o ensaio de pesquisa FINA. As amostras foram codificadas de modo a que os investigadores não foram capazes de determinar facilmente a identidade dos indivíduos. 1. Preparação da FINA Amostra Módulo Preparação <ol><li> Prepare absorvente pad cortando um 35 x 35 mm 2 de um 2,6 mm de espessura almofada de algodão 100%. Corte um pad por espécime. </li><li> Prepare a película de parafina de plástico com uma fita de papel de suporte por uma peça de corte da película de parafina (de 25 mm (H) por 50 mm (W)) e, em seguida, perfurando um orifício de diâmetro 7,14 milímetros, no centro da fita usando um furador conduzido martelo. Prepare uma fita por espécime. </li><li> Prepare uma membrana de separação de sangue de vidro ligado (membrana de captura) de disco perfurando um círculo 8,35 mm de diâmetrousando um furador impulsionado martelo. Perfurar um disco por espécime. O disco tem uma capacidade de retenção de partículas de 2,3 | im. </li><li> Montar o módulo de preparação de amostra FINA, colocando o disco de captura no centro da almofada de blotting usando uma pinça. Colocar a fita da película de parafina sobre o disco de captura de modo que o orifício da fita parafina deixa o centro do disco de captura exposta. </li><li> Garantir o contato máximo entre o disco eo mata-borrão, esticando a fita de parafina ligeiramente para cobrir o mata-borrão e pressionando a fita de parafina com firmeza para colá-la ao mata-borrão em torno de todas as bordas do disco. </li><li> Faça como muitos módulos conforme necessário para o experimento ou estoque para uso futuro. </li></ol> 2. Preparação de qPCR Tubo <ol><li> Prepara-se uma fita de disco 5,1 milímetros que vai ancorar a membrana de captura de células para o lado do tubo de qPCR para evitar que a membrana bloquear a detecção por fluorescência perfurando um círculo de polye com revestimento duploster fita de diagnóstico com um punção accionado martelo a partir de uma folha de a fita. Prepare um disco de fita por espécime. </li><li> Retire um lado do forro da etiqueta da fita. Colocar a fita para um tubo de PCR de 200 ul, aderindo-o para um lado e para o fundo do tubo. Remova o segundo forro etiqueta. O tubo está agora pronto para receber disco preparado. </li><li> Produzir tantos tubos, como necessário para a experiência ou reserva para uso futuro. </li></ol> 3. Contrive amostra de sangue Nota: Se um espécime verdadeiro teste está sendo preparado, vá para a etapa 4. <ol><li> Células descongelamento 8E5-LAV 15 que abrigam uma única cópia dos pró-vírus HIV-1 obtidos a partir do Virology Quality Assurance Laboratory (VQA; Ponta Presbyterian / St Centro de Luke Medical, Chicago, IL.). Nota: São armazenados como sedimentos celulares congelados a uma concentração de 4000 células / ml. A contagem de células foi verificada como descrito anteriormente 9. </li><li> Prepare Sorial de diluição em meio de congelação (90% de soro bovino fetal, 10% de dimetil sul f óxido) a concentrações que variam de 1 a 400 células / mL. </li><li> Pipetar 10 ul de células de cada uma das diluições em série para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 100 ul de EDTA negativo amostra de sangue inteiro fresco HIV-1 tratado a cada tubo para criar uma curva padrão de 8E5-LAV 10-4,000 números de cópias. Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes. </li></ol> 4. Execute FINA Extração <ol><li> Lisar células sanguíneas por adição de Triton-X100) para uma concentração final de 1% (11 ul 10% de Triton-X100 a 110 ul de sangue completo ou células provenientes de passo 3.3). </li><li> Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes. O sangue deve ficar vermelha translúcida. </li><li> Pipeta de todas as amostras de sangue para o disco de captura. Nota: Uma vedação estanque à água entre a fita de parafina e a membrana de captura assegura que o sangue flui através da membrana, e um bom contacto entre a captura membrane e mata-borrão conjunto da almofada garante a absorção da amostra rápida. </li><li> Deixar a amostra para absorver através do filtro. Nota: As mechas de lisado de sangue para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície do disco de captura. O ligado foi embebido no disco quando ele aparece fosco. </li><li> Adicionar 600-1,000 ul NaOH 10 mM gota a gota para o disco de captura. Nota: O tampão de lavagem, também podem ser adicionados como uma adição em massa de 600 ul. O tampão formará uma gota sobre a fita de parafina hidrofóbico e pavio através do orifício para o disco em cerca de 20 seg. O filtro irá mudar de vermelho para apuramento indicando branco da hemoglobina. </li><li> Separa-se o disco a partir do mata-borrão com uma pinça e aplicar o disco à fita no tubo de PCR preparados. Se houver qualquer cor vermelha retido no filtro adicionar 50-100 ul de tampão de lavagem para limpar o filtro, antes de colocar no tubo. Nota: Raramente, o excesso de pressão aplicada durante a preparação daa FINA módulos resultado em particionamento das camadas de membrana durante a separação do mata-borrão. Descartar esses discos e preparar uma amostra fresca. </li><li> Após o filtro é colocado no tubo de PCR, a análise das amostras de imediato. Alternativamente, secar durante a noite em uma caixa contendo sulfato de cálcio dessecante, em seguida, cap e coloque em uma bolsa de alumínio com dessecante de sílica e armazenar até que esteja pronto para análise. </li></ol> 5. qPCR Reaction <ol><li> Preparar 100 ul qPCR Master Mix por reacção usando HIV iniciadores e sondas específicas como descrito anteriormente 9,11. Incluir um controlo interno de amplificação para monitorizar a presença de inibidores de amplificação e para verificar que uma amostra negativa é um verdadeiro negativo. Certifique-se de que o filtro é completamente coberto com a mistura principal e que o filtro fica fixo ao lado do tubo ao longo da reacção. </li><li> Efectue a amplificação utilizando um dispositivo de PCR em tempo real como descrito anteriormente 9. </li></ol>

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

EID ligada ao acesso rápido tratamento foi demonstrada para reduzir a mortalidade infantil devido à infecção pelo HIV 16. Devido à persistência de anticorpos maternos no sangue de uma criança, os testes rápidos anti-HIV têm utilidade limitada para determinar o status de crianças expostas ao HIV. A OMS recomenda que todas as crianças nascidas de mães HIV-1 positivas devem ser testados em 4-6 semanas de idade, usando um teste virológico 17. Nós relataram o desenvolvimento de um ensaio para a detecção e quantificação do VIH-1 em ADN proviral amostras de sangue total que é capaz de detecção de cópia única com demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade em uma pequena avaliação de campo de 61 Sul Africano lactentes 11. Cem microlitros ou mais de sangue total pode ser recolhida através de dedo ou calcanhar vara e processadas através dos módulos da FINA 18,19. Estas amostras de sangue pode, então, ser armazenada durante pelo menos um mês antes da amplificação tornando este método ideal para testar crianças que estão longe de laboratórios. No estudo apresentado na Figura 3, de uma curva padrão das amostras maquinado a partir de HIV-1 de sangue total negativo enriquecida com células descongeladas abrigando o HIV-1 DNA proviral está representado. Uma advertência para este estudo é que algumas das células adicionadas à amostra poderia já lisadas devido ao congelamento / descongelamento, o que poderia potencialmente ter melhorado o nível de detecção do alvo. Um projeto experimental mais rigoroso teria sido ter inventado a amostra usando células recém-cultivadas que teria imitavam mais precisamente sangue total. O método de amostra prep FINA foi projetado para ser incorporado num dispositivo de EID POC qPCR (em desenvolvimento) para o uso em ambientes de recursos limitados 8; No entanto, o formato manual do descrito aqui pode também ser uma adição útil à carteira amostra de preparação de um laboratório. O FINA não usar o bind, lavar e eluir estratégia utilizada na driEd manchas de sangue e de outros sistemas de extracção à base de papel que dilui os ácidos nucleicos extraídos, possivelmente levando a sensibilidade de detecção de sub-óptima 5. O sistema de FINA é altamente flexível e pode ser facilmente adaptada para outros testes genéticos para além de detecção de ADN proviral de VIH. volumes mais baixos de sangue ou outras amostras biológicas podem ser processados ​​para alvos abundantes e volumes mais elevados para os menos abundantes. Na nossa forma de realizao do sistema original da FINA, que capturar as células a partir de sangue total usando uma membrana de separação de sangue e, em seguida, lisar-los por adição de NaOH a 10 mM 9. Esta versão tem a vantagem de um menor número de passos do utilizador, mas o volume / número de células de sangue que pode ser processada é menor. Para além da membrana de vidro ligada usado neste relatório, a separação do sangue ou outros filtros de recolha de sangue papéis têm sido utilizados com êxito com este método, e vários instrumentos de PCR quantitativas diferentes também têm sido mostrados para amplificar molde incorporado no fdisco ILTER 9. A única condição é que o filtro não bloqueia a leitura da fluorescência do equipamento de PCR em tempo real. Uma limitação significativa de extracção FINA é que existe uma restrição de tamanho do diâmetro da membrana de captura. Um disco de membrana com um maior ou superior a 9 mm não pode ser colocada num tubo de qPCR 200 ul sem a sobreposição de membrana no tubo que limita a área da superfície exposta à mistura de reacção. Além disso, quanto maior o diâmetro do disco, o volume de reacção mais qPCR é necessária para cobrir o filtro o que aumenta o custo e a turn-around-tempo do ensaio. Se o filtro é pequena demais para capturar eficazmente o ADN na amostra, que pode obstruir a prevenção lavagem eficiente. Usando a membrana de captura de vidro ligado, fomos capazes de capturar apenas ADN proviral de HIV-1 e RNA não virai a partir de amostras de sangue total (dados não mostrados). Não sabemos se membranas alternativas ou buffers poderia ser usado tO promover o isolamento de ARN, em vez de ou em adição ao ADN. Se o leitor deseja isolar única de ADN a partir da amostra este protocolo não requer a remoção enzimática de ARN necessária com alguns protocolos. A detecção tanto de HIV-1 RNA e DNA em amostras clínicas que melhoraria a sensibilidade de EID e esta falta de detecção de ARN é uma limitação do nosso teste de diagnóstico. O passo mais importante na adaptação do processo da FINA para um novo ensaio é para validar o tamanho do filtro para acomodar a quantidade de ADN, ou seja, o número de células, na amostra a ser testada. Em geral extracção FINA funciona melhor com as amostras com números mais pequenos de células, de modo que os discos de captura menores podem ser usadas. Para determinar a capacidade de ligação do filtro, basta adicionar um segundo disco de filtro para o módulo de FINA empilhados por baixo da membrana de recolha. Adicionar a amostra e lava-se as membranas tal como nos passos 4,1-4,5. Coloque cada um dos discos de captura de DNA em tubos qPCR separados e amplify. Utilizando uma curva padrão, determinar a percentagem de ADN de entrada capturada em cada filtro. O tamanho do filtro pode ser optimizado para as necessidades do ensaio. Para o ensaio de FINA proviral DNA descrito aqui, mais do que 99% do DNA genómico humano é capturada quando ligado celular é adicionado ao filtro (observações não publicadas) que permite capacidades de detecção superiores. Além de EID, futuras aplicações da FINA poderia incluir a detecção e quantificação de DNA pró-viral como um biomarcador para HIV-1 de monitoramento de doenças com os doentes que atingiram supressão viral devido à terapia anti-retroviral. monitorização do tratamento destinado a erradicar a infecção pelo HIV pode ser realizada por rastreio de outros factores, além do sangue periférico para reservatórios de HIV-1 de células infectadas. testes proviral HIV também pode ser utilizado para rastrear participantes nos ensaios clínicos da vacina para a infecção verdadeira. As amostras de sangue são estáveis ​​durante o armazenamento nos módulos da FINA e podem ser coletadas em condições de campo para posterior envio para central laboratórios para análise de PCR tornando este método ideal para estudos epidemiológicos. Além do HIV-1 de detecção, este método altamente flexível, também poderia ser utilizada para amplificar alvos de precisão medicina encontrados em amostras biológicas, tais como farmacogenética triagem ou outros detecção SNP ou para a rápida genotipagem de modelos animais. métodos de amplificação isotérmica, tais como amplificação de helicase dependente (HDA) ou amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP), também poderiam ser utilizados com FINA extraiu-molde ou o ADN-incorporado no filtro pode ser utilizado como molde para amplificação por PCR convencional.

Vários relatórios têm discutido o desenvolvimento de métodos de extracção aplicada sobre papel ou à base de membrana para uso em point-of-care (POC) dispositivos 1-5 com o objectivo de tornar a requintada sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular disponíveis para todos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) Doenças Sexualmente Transmissíveis Diagnostics Iniciativa cunhou o termo assegurada (, sensível, específico, rápido e robusto, livre de Equipamentos e entregue a quem precisa fácil utilização acessível) para descrever as características ideais de um POC teste 6. Destas orientações, a característica livre de equipamento é particularmente difícil de conseguir para diagnóstico molecular. No entanto, todas as inovações no campo vai avançar o objetivo de alcançar os mais necessitados, e não há esperança para melhorias de curto prazo no desempenho do teste, adaptando a tecnologia existente 7. Descrevemos aqui um protocolo simples para a extracção de ADN a partir de sangue inteiroque não requer a química complexa ou instrumentação de laboratório. A FINA (isolamento filtração de ácidos nucleicos) método de preparação da amostra foi originalmente desenvolvido para extrair o ADN de leucócitos a partir de sangue total, a fim de detectar o pró-vírus de HIV-1 como parte de um ponto de atendimento (POC) de amostra-para-resposta de PCR quantitativa plataforma (qPCR) no início infantil de diagnóstico (EID) para uso em ambientes de recursos limitados 8-11. Extracção FINA difere dos métodos de purificação convencionais que utilizam membranas de sílica ou partículas paramagnéticas revestidas de sílica para se ligar reversivelmente o DNA na presença de 12 agentes caotrópicos. Em vez disso, utiliza FINA verticais filtração através de uma membrana de separação para extrair o ADN celular directamente a partir de sangue total. A membrana contendo o ADN retido pode ser colocada directamente num tubo de PCR e, ou imediatamente utilizados numa reacção de PCR ou seco ao ar para amplificação posterior 9. Sem caotrópicos agentes, fenol, ou álcoois são utilizados na extracção da amostra, EliminaTing os extensos passos de lavagem necessários para remover inibidores potentes qPCR derivadas do processo de extracção 13,14. A membrana FINA pode capturar tanto células 9 ou ADN genómico libertado por lise da célula 11 antes que a amostra é adicionada à membrana. Para a captura de células, sangue total é adicionado directamente à membrana. As células são subsequentemente lisadas na membrana através da adição de NaOH a 10 mM. A vantagem deste método é que ele envolve apenas três passos: 1) a adição da amostra; 2) lise celular / lavagem e 3) a colocação disco de filtro no tubo de qPCR. A desvantagem deste método é que a membrana pode conter apenas um número definido de células directamente proporcional ao diâmetro do disco de membrana. Para atingir o limite de detecção requerido para Eid, 100 uL de sangue total é necessária para a entrada de amostra, o que implica um filtro que é demasiado grande para ser colocada num tubo de qPCR. Lisar as células do sangue com o detergente antes da adição da amostra para a recolhamembrana adiciona uma etapa de processamento, mas permite o uso de um filtro mais pequeno para o mesmo tamanho da amostra. Fomos capazes de demonstrar a alta reprodutibilidade, detecção de cópia única, e quantificação de menos de 10 cópias do HIV-1 DNA proviral de 100 l de sangue usando esta configuração de teste 11. Neste relatório, nós descrevemos o protocolo FINA como originalmente desenvolvido para uso em laboratório. A sanduíche de membrana / filtro conhecido como o módulo de preparação de amostra FINA pode ser preparado em grandes lotes e armazenadas para uso posterior. Quando as amostras são para ser extraído este processo leva 2 min e pode ser realizada em vários lotes de tamanho. A qPCR pode ser executado imediatamente ou os filtros que contenham o ADN incorporado pode ser armazenado até que seja conveniente para realizar qPCR. Este método é muito conveniente para a análise de rotina de amostras em ambas as configurações de baixa e alta de recursos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, filtração isolamento de ácidos nucleicos, é um método de extracção que utiliza filtração romance vertical, através de uma membrana de separação e uma almofada absorvente para extrair ADN celular do sangue total em menos de 2 min. A amostra de sangue é tratada com o detergente, misturada brevemente e aplicada por uma pipeta para a membrana de separação. O lisado pavios para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície da membrana de separação. O DNA extraído é retida na membrana durante um simples passo de lavagem em que inibidores da PCR são maus para o mata-borrão absorvente. A membrana contendo o ADN retido é então adicionado à reacção de PCR sem purificação adicional. Este método simples não requer equipamento laboratorial e pode ser facilmente implementado com material de laboratório de baixo custo. Descrevemos aqui um protocolo para a detecção altamente sensível e quantificação do VIH-1 ADN proviral de 100 ul de sangue inteiro como um modelo para o iníciofant diagnóstico do HIV que pode ser facilmente adaptada a outros alvos genéticos.

O fluxo de trabalho para a extracção de ADN proviral de sangue total enriquecida com células 8E5-VAE é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra o módulo da amostra FINA e preparado tubo qPCR. Este método permite a amplificação eficiente de VIH-1 a partir de células pró-vírus LAV-8E5 em diferentes números de cópias, tal como mostrado na curva padrão de espécimes artificiais (Figura 3). PCR teve uma eficiência de 103%, como calculado a partir Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação). Equação da reta foi y = -3.25x + 27,95, com uma correlação de R² = 0,996. A curva padrão de ADN proviral de VIH replica também têm amplificação altamente reprodutível, como evidenciado na Tabela 1. Adicionalmente, um controlo interno de 500 cópias Hydroxypyruvate Redutase está presente para mostrar que não há nenhuma inibição da PCR resultante de extracção de sangue com FINA, independente do número de cópias do HIV-1 provirus presentes (A Figura 4). amplificação CI foi obtido de forma eficiente em todas as 18 amostras testadas, com uma média de Cq 21,92 ± 0,25 e um CV de 1%. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho para a detecção de DNA pró-viral do sangue total enriquecida com células 8E5-LAV para qPCR. (A) a partir da esquerda para a direita, o módulo de FINA preparado, depois o sangue é adicionado à membrana de captura e depois de tampão de lavagem foi adicionado. Tubos (B) qPCR com discos de captura de presas de fita dupla revestida com mistura principal qPCR acrescentou. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig2.jpg" /> Figura 2: FINA módulo in-house e preparação tubo qPCR. </stRong&gt; (a) um disco de membrana de captura de diâmetro 8,35 mm foi ensanduichada entre um quadrado 707 mata-borrão e uma folha fina de fita de parafina contendo um orifício de 7,14 mm de diâmetro no centro de modo a que o furo da fita de parafina foi centrado sobre o disco de captura para a aplicação direta de sangue lisadas por pipeta. (B) Uma fita de diagnóstico de poliéster 5,1 milímetros duplo revestimento está preso no lado de 200 tubo de qPCR ul. O segundo forro da fita é removida para expor a superfície adesiva para aplicação de disco de captura quando estiver pronto. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig3.jpg" /> Figura 3:. Curva padrão de espécimes inventados HIV-1 DNA proviral parcelas de amplificação (A), obtidos a partir de 100 ul de 4 repetições de HIV-1 NEgativos sangue total enriquecida com 4.000, 400, 40 e 10 células 8E5-LAV com 500 cópias / reacção dos controles internos linhas sólidas = parcelas de amplificação; linha pontilhada = limiar. Eixo Y representa as unidades de fluorescência e o eixo X é o número do ciclo de qPCR. (B) curvas padrão de valores Cq calculado a partir trama de amplificação versus o número de cópia log de ​​células 8E5-LAV por 100 ml de sangue total. Equação da reta: y = -3.25x + 27,95; R = 0,996; Eficiência da PCR = 103,23%, calculada através de Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig4.jpg" /> Figura 4: Controle interno indica que não há qPCR inibição 500 cópias Hydroxypyruvate redutase Amplification plasmídeo controle adicionado por reacção.. Sólidolinhas = terrenos de amplificação; linha pontilhada = limiar. Média Cq de IC = 21,92 ± 0,25. CQS variou 21,21-22,32. Coeficiente de variação (CV%) = 1%; N = 18. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Células 8E5-LAV / </td></tr><tr><td> 100 ul WB </td><td> Ave. Cq </td><td> SD </td><td> CV (%) </td></tr><tr><td> 4.000 </td><td> 16.27 </td><td> 0,14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 19.54 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 22.56 </td><td> 0,3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 24.83 </td><td> 0,15 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>Tabela 1: Média Cq, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV%) de 4.000, 400, 40 e 10 cópias de curva padrão 8E5-LAV com extracção FINA e HIV-1 iniciadores específicos e sondas. N = 4. WB = sangue total.

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K visualizações.  Northwestern University.  Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos. 

Vídeo: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biologia

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.