This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

Hedef RNA ve Cas9 Yapıları ve Onarım Donör Vektör 1. Hazırlık <ol><li> gRNAs klonlanması <ol><li> Daha önce 25 belirtilen prensip aşağıdaki aşı virüsünün N1L genini hedef alan bir kılavuz-RNA hedef dizisi tasarlayın. ineklerdeki çiçek hastalığı virüs genomu karşı kılavuz-RNA hedef sekans hizalama (bu durumda, aşı virüsü Lister suşu) bir hedef dışı gRNA hedef sekanslarını ekarte etmek için. </li><li> Sentezlemek ve daha önce 25 açıklandığı gibi bir gRNA klonlama vektörüne gRNA oligos klonlamak. Sanger dizileme 33 ile sonuçlanan vektör içinde her gRNA sırasını onaylayın. Ortaya çıkan gRNA gRNA N2 33 olarak inşa adlandırın. NOT: gRNA hedef site N1L geni içinde ve sol kol ve sağ kol arasındaki bölgede olduğu onarım verici vektör kapakları (Şekil 1). </li></ol></li><li> nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) yoksun Cas9 genini klonlamakpST1374 vektör ve PST-Cas9 33 olarak yapı belirleyin. NOT: herhangi bir memeli sentezleme klonlama vektörü Cas9 sentezleme vektörünün kurulması için kullanılabilir. </li><li> HR onarım donör vektörü İnşaatı <ol><li> Modifikasyon 33 için hedef bölge olarak VV N1L genini kullanın. sol ve sağ kol uzunlukları yaklaşık 500-600 bp her ve hedef bölgeyi komşu olduğundan emin olun. NOT: Sol kol / sağ kol hedef bölge ile 50 bp üst üste kadar olabilir (Bakınız Şekil 1). </li><li> Daha önce 33, 34 anlatıldığı gibi N1L bölge onarım donör vektör Clone ve pT-N1L olarak onarım donör vektör belirler. NOT: onarım donör vektörü ve hedef bölge için Şekil 1&#39;e bakınız. VV Diğer bölgeler bölgesi (gen) -özel gRNA (ler) ve bölgeye özgü onarım verici vektörü kullanılarak hedef alınabilir. Herhangi bir klonlama vektörü onarım verici vektör yapımı için kullanılır. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> plasmid genişletilmesi <ol><li> Kimyasal olarak, yeterli E. plazmidi Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. İmalatçı tarafından sağlanan protokole ilişkin bir plazmid ekstraksiyon takımı kullanılarak plazmit saflaştırılır. </li></ol></li></ol> 2. Tohum Hücreler (Gün 1) <ol><li> Bakım CV-1 37 ° C de% 5 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) &#39;de hücreleri (Maymun böbrek fibroblastları),% 5 CO 2. </li><li> % 80-90 konfluent Trypsinize CV-1 hücreleri, <ol><li> CV-1 hücreleri ihtiva eden T-175 şişesi hücre kültür ortamı çıkarın. PBS kalan serumu çıkarmak ve aspire steril PBS 5 ml tek tabaka durulayın. hücreleri kapsar ve hücre ayrışması yardımcı olmak için yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir 2.5 ml 1 x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. </li><li> EklemekHücre kültür ortamı 10 ml yumuşak bir pipet hareketi ile hücrelerin süspansiyonu (adım 2.1). Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak. </li><li> 6-yuvalı plakalar içinde Hücrelerin Serpilmesi <ol><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, hücre kültür ortamı 2 mL tohum 2 x 10 5 CV-1 hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce. Not: tripsin çıkarmak için ek bir santrifüjleme aşaması gerekli değildir. </li></ol></li></ol></li></ol> Cas9 Plazmid ve gRNA 3. Plasmid transfeksiyonu (Gün 2) <ol><li> 0.5 ug PST-Cas9 plasmidi ile ve imalatçının talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak 0.5 ug gRNA N2 plazmid (adım 2.2.3.1 hazırlandı) Transfect CV-1 hücreleri. </li><li> Bir kuluçka makinesi içinde 24 saat süreyle inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2), ve daha sonra (adım 2.1 tarif edilmiştir), taze hücre kültür ortamında 2 mL orta yerine. </li></ol> CV-1 hücreleri, ve Servis Verici V 4. Enfeksiyonector Transfeksiyon HR (Gün 3) <ol><li> 2 x 10 5 pfu / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar DMEM hücre kültür ortamı ile omurgası VVL15 virüsü seyreltilir. Cas9 ve gRNA plasmidlerin 24 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinde, her kuyuya seyreltilmiş virüs, 100 uL ilave edin. </li><li> 2 saat sonra, virüs enfeksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HR VVL15 enfekte hücrelere 1.0 ug Servisi verici vektör transfekte. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör transfekte edilmiş hücrelerin yerleştirin. </li></ol> 5. Hasat Rekombinant virüs (Gün 4) <ol><li> Adım 4.2 HR mekik donör vektörü ile transfeksiyondan 24 saat sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak nakledilen CV-1 hücreleri ayırmak. kriyotüpe içine hücre süspansiyonu toplayın ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklayın. NOT: derhal dezenfektan ile herhangi bir hücre kültür ortamı Dökülen siliniz ve daha sonra% 70 Ethan ile tekrar silinol. </li></ol> Modifiye VV 6. saflaştırılması (Birinci Tur) <ol><li> 1. günde, her yuva içinde 3 x 10 5 CV-1 hücreleri ile 15 6 oyuklu plakalar tohum. <ol><li> 2. günde, 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde aşama 5.1 dondurulmuş hücre süspansiyonu çözülme ve hücre artıkları çıkarmadan hücre lizatının elde edilmesi için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. </li></ol></li><li> CV-1 hücreleri, bir 6-yuvalı plaka Enfeksiyon için, DMEM 3 mL hücre lizatının 1 uL seyreltilmiş ve daha önce ortam üzerine, 6 oyuklu plakanın her bir seyreltilmiş hücre lizatı 0.5 mL eklemek mevcut. Adım 6.1 hazırlanan 6-kuyucuğu bulaştırmak. Not: Hücre kalıntılarının çıkarılması gerekli değildir. </li><li> Enfeksiyon iki gün sonra (yani, günde 4), plak konumunu çizerek bir işaretleyici kalem kullanarak plaka altında plaklar 10X objektif lens kullanarak bir floresan mikroskop altında RFP-pozitif plaklar tanımlamak ve etiket. NOT: Daha <stRong&gt; temsilci RFP-pozitif plak Şekil 3. <ol><li> altı farklı RFP pozitif plaklar almak için 200 uL serumsuz DMEM hücre kültür ortamı içeren altı etiketli cryovials hazırlayın. etiketli plaka (lar) (adım 6.3) ile iyice hücre kültür ortamı aspire. Bir P200 pipet 200 uL ucu takın 30 uL seviyesini ayarlamak ve bir cryovial gelen ~ 10 mcL hücre kültür ortamı alır. </li><li> orta bırakmadan pipet itme düğmesini basılı tutun ve bir etiketli plak alan kazımak için ucu kullanın. müstakil hücreleri yukarı kaldırın ve serum serbest DMEM 190 uL içeren cryovial içine aktarmak için pipet itme düğmesini bırakın. </li><li> (Son adımından) çizik hücreleri ile şişeden başka bir 10 uL orta alın ve mümkün olduğunca çok sayıda çizik hücreleri toplamak için aynı RFP-pozitif plak üç kez toplayıp işlemi tekrarlayın. Aynı şişenin içine tüm hücreleri aktarın ve -80 ° C&#39;de şişe saklayın. </ol></li></ol> Modifiye VV 7. saflaştırılması (İkinci Tur) <ol><li> Her birine Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreler, altı 6 oyuklu plakalar ve Kültür 24 saat boyunca hücre. </li><li> 3 dakika için 37 ° C su banyosunda (aşama 6.3.3 arasında) dondurulmuş cryovials çözülme daha sonra hücre lizatı elde etmek için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. <ol><li> 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna karma hücre lizatının 0.5 uL ekleyin. Her bir plak, bir 6-yuvalı plaka Infect. 2 gün boyunca% 5 CO2 (ikinci devre plak saflaştırma) ile 37 ° C&#39;de VV enfekte 6 oyuklu inkübe edin. Sonra bölüm 6.3 tekrarlayın. NOT: Daha fazla altı RFP-pozitif plaklar alınabilir; İki ya da daha fazla 6-oyuklu plakalar, her plak saflaştırılması için de kullanılabilir. </li></ol></li></ol> Plak Puri 8. Ek turlarSınıflamasına <ol><li> bir pozitif plak oluşan tüm plaklar mikroskop altında RFP-pozitif gibi görünen kadar 7. adımda açıklanan aynı protokolü takip arınma daha üç beş tur sürdürmektedir. Not: Daha sonra bu plak saf olarak kabul edilir. </li><li> Plak saf kez bölümde 6.3 anlatıldığı gibi (Şekil 4, RFP ifade tüm enfekte hücreler), -80 ° C&#39;de cryovial ve mağaza içine pozitif plak hasat. Aşama 9 ve 10&#39;da tarif edilen protokol izlenerek plak edin. </li></ol> 9. genişletin Saf Plak (ler) <ol><li> Virüs enfeksiyonu önce 6 plaka bir gün her oyuğuna Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreleri. </li><li> Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde 8.2 dondurulmuş cryovial çözülme. CV-1 hücreleri, 6 gözlü bir plakanın bir kuyuya (hücre kalıntıları çıkarmadan) Tüm lisatı, ekleme (adım 9.1 tohumlanmış). 5 ile 37 ° C &#39;de enfekte edilmiş CV-1 hücreleri, inkübeEn fazla 3 gün süreyle% CO 2. <ol><li> Tüm saflaştırılmış plaklar (en az üç plaklar) genişletin. NOT: Bu enfeksiyon uzun lizat virüsün miktarına bağlı olarak 1-3 gün arasında değişir. </li></ol></li><li> % 50&#39;den fazla hücreler mikroskop altında incelendi sitopatik etki gösterirken bir hücre kazıyıcı kullanarak VV-enfekte hücreleri hasat (hücreler kolayca sökülüp ve RFP pozitif yuvarlanır). 15 ml tüp içine hücre kültürü ortamı ile ayrılan hücreler toplanır. <ol><li> 3 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C hücre pelletini tutmak veya adım 10 hemen hücre pelet kullanın. </li></ol></li></ol> PCR kullanarak Mutant VV Modifikasyonu 10. Doğrulama <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak aşama 9.3.1&#39;de hazırlanan hücre topağından VV DNA ekstrakte edin. iki kez damıtılmış su, 200 uL DNA yıkayın. NOT: DNA ayıklamak ve klon doğru modifikasyon / ilavesini içeren olarak doğrulandı ise viral üretim için geri kalanı tutmak için pelet hacminin yarısını kullanın. </li><li> N1L geninin silme ve N1L bölgeye RFP geninin sokulması doğrulanması. <ol><li> N1L gen (L025) ile N1L gen karşı tasarlanan primerler kullanılarak L026 geni kapsayan, bir DNA fragmanını çoğaltmak. RFP-spesifik primerler kullanılarak RFP genini çoğaltmak. A52R-spesifik primerler kullanılarak PCR ile A52R kapsayan bir kontrol DNA fragmanını çoğaltmak. NOT: spesifik primerler için Malzeme Listesine bakınız. <ol><li> PCR master miks kiti kullanılarak PCR gerçekleştirin. en fazla 25 uL DNA şablonu 2 uL kullanılarak PCR reaksiyonunun yer alan 2 dakika süre ile 94 ° C &#39;de, PCR reaksiyonu denatüre ve aşağıdaki adımları PCR 30 döngü çalıştırmak: 15 saniye süreyle 94 ° C&#39; de DNA&#39;yı denatüre ardından tav 15 saniye için 52 ° C &#39;de, DNA şablonları primerler 30 s için 72 ° C&#39;de PCR reaksiyonunu uzanır. </li></ol></li></ol></li><li> Bir% 1 agaroz jeli 33 kullanarak PCR ürünleri giderin. UV jel doc kullanılarak jel görüntü yakalamak. N1L PCR negatif ve A52R ve RFP PCR pozitif iseniz, o plak doğru N1L bölgesinde değiştirilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+base-paired+flip-flop+terminal+loops+link+the+two+DNA+strands+of+the+vaccinia+virus+genome+into+one+uninterrupted+polynucleotide+chain.">Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain.</a> Cell. 28, 315-324 (1982).</li><li>Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brock biology of microorganisms, 9th edn. , (2000).</li><li>Cooney, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+and+immunological+response+to+a+recombinant+vaccinia+virus+vaccine+expressing+HIV+envelope+glycoprotein.">Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein.</a> Lancet. 337, 567-572 (1991).</li><li>Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+recombinants:+expression+of+VSV+genes+and+protective+immunization+of+mice+and+cattle.">Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle.</a> Science. 227, 433-435 (1985).</li><li>Legrand, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+potent+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+by+attenuated+vaccinia+virus+vectors+with+deleted+serpin+genes.">Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes.</a> J Virol. 78, 2770-2779 (2004).</li><li>Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+live+vaccines+by+using+genetically+engineered+poxviruses:+biological+activity+of+recombinant+vaccinia+virus+expressing+influenza+virus+hemagglutinin.">Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.</a> Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).</li><li>Wiktor, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+rabies+by+a+vaccinia+virus+recombinant+containing+the+rabies+virus+glycoprotein+gene.">Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).</li><li>Gallucci, S., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danger+signals:+SOS+to+the+immune+system.">Danger signals: SOS to the immune system.</a> Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+model:+a+renewed+sense+of+self.">The danger model: a renewed sense of self.</a> Science. 296, 301-305 (2002).</li><li>Guo, Z. S., Bartlett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+as+a+vector+for+gene+delivery.">Vaccinia as a vector for gene delivery.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).</li><li>Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vectors+for+cancer+immunotherapy.">Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy.</a> Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).</li><li>Tysome, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lister+strain+of+vaccinia+virus+armed+with+endostatin-angiostatin+fusion+gene+as+a+novel+therapeutic+agent+for+human+pancreatic+cancer.">Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer.</a> Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).</li><li>Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+poxvirus+oncolytic+effects+through+increased+spread+and+immune+evasion.">Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion.</a> Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).</li><li>Park, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+poxviruses+as+cloning+vectors:+insertion+of+the+thymidine+kinase+gene+from+herpes+simplex+virus+into+the+DNA+of+infectious+vaccinia+virus.">Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus.</a> Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> J Virol. 61, 1788-1795 (1987).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).</li><li>Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+that+are+associated+with+DNA+repeats+in+prokaryotes.">Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.</a> Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Cas9+endonucleases+reveal+RNA-mediated+conformational+activation.">Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.</a> Science. 343, 1247997 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing.">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9.">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).</li><li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation:+recombination-independent+selectable+cloning+vectors.">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li><li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper.">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li><li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li></ol>

Authors have no competing financial interests.

tedavi amaçlı VV değişiklik ile ilgili olarak iki ana amacı vardır. Bu tür bir anti-tümör terapötik kullanım için virüs azaltmak için timidin kinaz (TK) geni gibi, belirli bir gen silme etmektir. Diğer (GM-CSF gibi) arzu edilen bir terapötik gen ya da (örneğin, lusiferaz geni gibi) bir işaretleyici gen ile VV kol etmektir. Bunlardan birini başarılması bir hedef bölge / genin silinmesini gerektirir. Bir doğrudan DNA ligasyonu yöntemi 35 ve bir in vitro paketleme yöntemi 36 TK geni modifikasyonları mutant vaccinia virüsleri üretmek için daha önce kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, bağlı genom arasında benzersiz restriksiyon enzimi bölgeleri eksikliğine genomunda başka bölgelerde mutasyon ile ilgili kısıtlı uygulanma olanakları vardır. Mutant VV oluşturmak için mevcut bir yaklaşım, homolog rekombinasyon incorporati endüklemek üzere iki saat VV ile enfeksiyondan sonra CV-1 hücrelerinde bir seçim işaretleyici (RFP veya GFP) ile mekik (donör) vektörünün transfeksiyonu kapsarHedef bölgeye seçim markerini ng. Marker-pozitif plak seçimi saflaştırılması 24 saat sonra transfeksiyonu ile takip edilir. plak saflaştırma işlemi, 10 mermi kadar sürebilir son 3-4 hafta ve genellikle kapalı hedef bölgelerde takılı seçim işaretleri ile istenmeyen rekombinant virüslerin neden olabilir. DNA, iki iplikçikli kırılmalar etkili memeli hücrelerinde 37 homolog rekombinasyona neden olabilir, ve bu mekanizma yararlanarak, mutan VV üretme verimi büyük ölçüde geliştirilebilir. GRNA eşliğinde Cas9 sistemi başarılı bir şekilde genom düzenleme çalışan ve 25, ökaryotik organizmalar 22 homolog rekombinasyon verimliliği arttırır edilmiştir. Son zamanlarda, konakçı hücreler, herpes simpleks virüsü gRNA güdümlü Cas9 tarafından düzenlendiği bir adenovirüs ve tip genleri sistem 24. En son CRISPR yer Cas9 sistemi etkin bir şekilde W genomuna düzenleme ve ifade etmek için bir VV vektörünün elde edilmesi için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirÖzellikle geni. Her iki N1L gRNA güdümlü Cas9 ve geleneksel homolog rekombinasyon (HR) yöntemi N1L aynı hedef bölgeye başarılı İK etkinlikleri sonuçlandı. İlginç bir şekilde, bununla birlikte, geleneksel sıcak yöntem daha verimliliği çok daha yüksek seviyelerde Cas9 neden HR gRNA eşliğinde. Bu nedenle, gRNA güdümlü Cas9 kullanımı mutan VVS elde etmek için çok sayıda plak saflaştırılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu çalışmada, önemli ölçüde gRNA güdümlü Cas9 sistemi 33 kullanılarak mutant VV üretimi için verimlilik ve zaman çerçevesi geliştirmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, benzer bir yeniden birleştirme yüksek verim elde etmek için bir kritik adım geleneksel homolog rekombinasyon gerçekleştirmeden önce 24 saat boyunca Cas9 ve gRNA ifade eden plasmidler ile CV-1 hücrelerini transfekte etmektir. 24 saat aralığı Cas9 ve gRNA makul bir düzeyde ifade edilmesini sağlar. Farklı gRNA t dizileri tespit Dahası, belirli bir geni hedef gRNA sekansı optimize edilmesi gerekebilirargeting N1L geni verimliliklerinin 33, 34 değişiyordu. düzenleme VV CRISPR / Cas9 için sınırlama rekombinasyon ilk turda RFP-pozitif plaklar düşük oranıdır. sıkıcı tarama ilk tur yapar rekombinant virüs içeren TTT pozitif plaklar yeterli sayıda, genellikle en az on 6 oyuklu plakalar ihtiyaç vardır, elde etmek için. Bu nedenle, bu sınırlamayı aşmak için protokol optimize etmek için bir ihtiyaç vardır. TTT pozitif plaklar küçük boyutlu 6 oyuklu plaka enfekte etmek için kullanılan lizat bir yoğunluğu nedeniyle bir başka olası sorun vardır. Bunun üstesinden gelmek için, lizat daha az miktarda daha büyük bir boyutu TTT-pozitif plaka elde etmek için bir 6-yuvalı plaka enfekte etmek için kullanılır. Lizat daha küçük bir hacmi kullanılması da TTT negatif olanlar TTT pozitif plaklar daha ayrılması için sağlayacaktır. Sonuç olarak plak arınma az mermi saf RFP-pozitif plaklar almaları gerekmektedir. <petkiler her zaman gen düzenleme istenmeyen bir sorunu vardır Off-hedefe class = &quot;jove_content&quot;&gt;. CRISPR-Cas9 off-hedef etkilerini göstermiştir. VV 33, 34 genomları düzenlerken Ancak, gRNA dikkatli tasarımı ile, hedef dışı etkileri önlenebilir. Bu VV genomu düzenleme için gRNA eşliğinde Cas9 sistemini kullanarak özel bir şeydir. biyomedikal araştırmalar ve translasyonel tıpta mutant VVS gelişimini hızlandıracak CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak, VV vaatlerde. Buna ek olarak, böyle bir sistem aynı zamanda onun aktin esaslı hareketlilik için VV tarafından kullanılan sinyal yollarının diseksiyonu olarak hücre biyolojisinde keşifler, hızlandırmak olacaktır.

Vaccinia virüsü (VV) poksvirüs ailesine ait zarflı bir DNA virüsüdür ve çiçek eradikasyon tıpta büyük başarılarından biri çok önemli bir rol oynamıştır. Çiçek sonrası eradikasyon dönemde, VV VV vektörleri içine çeşitli patojenlerden genleri ekleyerek HIV ve diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşılar 1-7 genlerini sunmak için bir vektör olarak geliştirilmiştir. VV Ayrıca, bilhassa, tümör hedefli replike onkolitik vaccinia virüsü geliştirilmesi için kanser immünoterapisi 8-14 için bir vektör olarak kullanılmıştır. kanser hücreleri için geliştirilmiş seçiciliğe sahip etkili bir aşı maddesine vektörü oluşturmak için, viral genom içinde modifikasyonlar geni delesyonu veya terapötik genlerin katılmasıyla da dahil olmak üzere, gerekmektedir. DNA teknolojisinin gelişmesi ve VV içine moleküler biyoloji ve viroloji, yabancı DNA&#39;nın yerleştirilmesi daha iyi anlaşılması ile başlangıçta elde edildid 1980&#39;lerde 15 homolog rekombinasyon (HR) kullanarak. Bu yöntem hala VV vektörleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılan olduğunu. genetik modifikasyon giriş önceden enfekte edilmiş hücrelerde VV genom ile birleşir HR, bir mekik vektörü, kullanılarak elde edilir. Bununla birlikte, bu yöntem, (% 1&#39;den daha az homolog rekombinasyon verimliliği 16) son derece verimsiz olduğu kanıtlanmıştır ve genellikle hedeflenmemiş bölgeler ve / veya virüs genişlemesi üzerine, markör kaybı içine seçim işaretleyicinin rastgele ekleme ile sonuçlanmaktadır. Genomik lokuslar ekzojen DNA sokulması için DNA homolog rekombinasyon verimliliği önemli ölçüde çift iplikli kırılmalara (DSBs) 17 mevcudiyetinde arttırılabilir. Bu nedenle, hedef lokusların DSBs uyarabilir teknoloji VV genom mühendisliği için büyük bir potansiyele sahiptir. Son zamanlarda geliştirilen CRISPR-Cas9 sistemin herhangi VV gen bölgesinde DSBs tetiklenmesi için umut vermektedir. CRISPR-Cas9 bir RNA olanişgalci fajlar ve diğer yabancı genetik materyallerin 18-20 karşı adaptif bağışıklık katılan güdümlü nükleaz. Mikrobiyal türlerin 21, bir dizi üç CRISPR-Cas sistemleri vardır. tip II CRISPR-Cas sistemi yaygın ökaryotik hücreler ve büyük virüs genomunu düzenlemek için kullanılır. Bu (Streptococcus pyogenes den), RNA yönlendirmeli Cas9 endonükleaz oluşur tek bir kılavuz RNA (sgRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) 22-24. Cas9 / sgRNA kompleks bir memeli hücre 22 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer bitişik motifi (PAM) sekansı, 23, önceki tamamlayıcı 20 nükleotid genomik dizisini tanır. Başarıyla genetik olarak tadil edilmiş hücreler, virüsler etkin üretimi için kullanılmaktadır ve hayvan modelleri 22-32. CRISPR-Cas9 sistemi VV sitoplazmasında homolog rekombinasyon ile birlikte hedef genom için etkin bir araç olduğu kanıtlanmıştır CV-1 hücre enfekte olans mutant aşı virüsleri 33, 34 oluşturmak için. Bu yöntemin potansiyel uygulama uzatmak için, biz bu sistemin metodolojisi hakkında detaylı bilgi sunmak. Açıklanan protokol, belirli bir geni delesyonu ile bir mutan VV oluşturmak ve / veya terapötik bir transgen mutant virüs kol için de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Plasmid #41824</td>
			<td style="width:212px;">41824</td>
			<td style="width:137px;">Addgene</td>
			<td style="width:225px;">gRNA cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pST1374&#160;</td>
			<td>13426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Cas9 cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pGEMT easy</td>
			<td>A1360</td>
			<td>promega</td>
			<td>repair donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E .Coli</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>27106</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dulbecco&#8217;s Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>SH30088.03HI</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin, streptomycin</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Effectene</td>
			<td>301425</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL</td>
			<td>W-06754-96</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>collect virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Olympus BX51 Fluorescence&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>find RFP-positive plque</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>69506</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td>
			<td>AB-0794/B</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PCR reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm culture dish</td>
			<td>Z688819-6EA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell scraper</td>
			<td>C5981</td>
			<td>sigma</td>
			<td>scrap cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XTrypsin-EDTA solution</td>
			<td>T4299</td>
			<td>sigma</td>
			<td>trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>95015661</td>
			<td>Anachem Ltd</td>
			<td>desinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tube</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>hold cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L forward 5&#8217;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L reverse&#160; 5&#8217;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R forward 5&#8217;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R reverse 5&#8217;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP forward 5&#8217;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&#8217;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP reverse 5&#8217;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argarose</td>
			<td>A7431</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>resolve PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G:BOX F3</td>
			<td>G:BOX F3</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>UV gel doc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Yeni bir VV vektörünün kurulması için, önemli bir başlangıç ​​noktası tasarım ve genomun belirli bir bölgeyi bir verici mekik vektörü inşa etmektir. Bu çalışmada, VV N1L geni örnek hedef olarak kullanıldı. Rekombinasyon ve VV hedef bölge için donör mekik vektörüne kaset Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir., Homolog rekombinasyon etkinliğini artırmak amacıyla, Cas9 ve N1L özgü gRNA ifade eden plasmidler CV birlikte-transfekte edilmiştir homolog rekombinasyon 33 gerçekleştirmeden 48 saat önce -1 hücreleri. Bir gün (24 saat) post-transfeksiyon, RFP CV-1 hücrelerinde (Şekil 2) olarak ifade edildi. Homolog rekombinasyon gelen bütün lizat (aşama 5) CV-1 hücre enfeksiyonundan sonra, pozitif bir TTT-negatif plaklar iki CV-1 hücrelerinde (Şekil 3) tespit edilmiştir. arıtma protokolü tarif ardından, saf bir plak ko<html> arınma 3-5 turdan sonra elde edilebilir uld. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, mutant vaccinia virüsü ile saf plak türetilen hücre lizatı ile enfeksiyondan sonra tüm plaklar bir RFP sinyal verdi. Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, VV doğru gen modifikasyon da saf mutan, PCR, hedef N1L geninin olmadığını teyit etmek için kullanıldı olup olmadığını doğrulamak için. Modifiye virüs PCR RFP bir pozitif sinyal ve N1L için mevcut sinyal (gösterdi Şekil 5, şerit AG), sağlam bir N1L bölge ile kontrol virüsü (TO) için N1L PCR sonuçları olumlu ise. A52R kontrol DNA fragmanları, tüm rekombinant virüs ve Ctr virüsü pozitif bulunmuştur. RFP-pozitif plaklar İK verimliliği bu deneyde (önceki çalışmalarında 34 kadar% 94 idi)% 100 (6/6) &#39;dir. Burada tarif edilen metod, geleneksel protokollere 33, 34 oranla daha fazla 100 misli rekombinasyon verimliliği geliştirdi. içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Şekil 1:., Homolog rekombinasyon için donör Servisi vektör kaseti ve W genomuna hedef bölgesi saflaştırma marker geni RFP H5 promotör ile tahrik edilir. RFP geninde N1L bölgesi sonucu hedef onarım verici vektör, homolog rekombinasyon sonrası N1L bölgesine dahil edilmiştir. &#39;X&#39; aşı virüsü genomu aynı diziyi yerini alacak tamir donör vektörü homolog sırasını gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Şekil 2:. Aften homolog rekombinasyon sonrası CV-1 hücreleri, bir gün Görüntüleme bir günr homolog rekombinasyon, onarım donör vektörle VV ile enfekte ve transfekte hücreler RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Şekil 3:. Mutant virüs ilk turda saflaştırma bir RFP-pozitif plak mutant virüs ilk tur saflaştırma, hedef bölge silme ile RFP pozitif plak (kırmızı çizgi ile çember) tarafından oluşturulan plaklar ile çevrilidir vahşi (sarı çizgi ile çember) tipi virüsü A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan microscopy görüntü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Şekil 4:. VV arınma 3-5 tur sonra, saf plaklar tüm plaklar olarak elde edildi saf mutant RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X) . Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Şekil 5: VerificatioVV elde edildi, saf mutan VV. DNA N, CV-1 hücrelerini enfekte. N1L N1L primerler kullanılarak PCR ile doğrulanmıştır hedef bölgesinin silinmesi, N1L bölgeye RFP yerleştirme RFP primerler kullanılarak PCR ile onaylandı. Lanes AF altı saflaştırılmış plaklar karşılık, şerit G önceki çalışmalarda 33 doğrulandı N1L silinmesi ile kontrol plak, şerit Ctr (kontrol) (N1L bölge bozulmamış) vahşi tip aşı virüsüdür. A52R gen tüm örnekler için kontrol geni olarak çoğaltıldı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Görüntüleme.  Queen Mary University of London.  Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır. 

Video: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...