This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

대상 RNA와 Cas9 구축 및 수리 기증자 벡터 1. 준비 <ol><li> gRNAs의 클로닝 <ol><li> 앞서 설명한 25 원리 다음 백시 니아 바이러스의 N1L 유전자 타겟팅 가이드 RNA 표적 서열을 디자인. 백시 니아 바이러스의 게놈에 대한 가이드 RNA 표적 서열 정렬 (이 경우, 백시 니아 바이러스 리스터 균주를) 상관 오프 - 타겟 gRNA 표적 서열을 배제한다. </li><li> 합성하고 이전 25 바와 같이 gRNA 클로닝 벡터 내로 gRNA 올리고 클론. 생거 시퀀싱 (33)에 의해 생성 된 벡터의 각 개별 gRNA의 순서를 확인합니다. 결과 gRNA이 gRNA N2 (33)로 구성 이름을 지정합니다. 주 : gRNA 대상 부위가 N1L 유전자 내이며, 왼팔, 오른쪽 아암 사이의 영역에 있다고 수리 공여체 벡터 커버 (도 1 참조). </li></ol></li><li> 에 핵 이행 시그널 (NLS)를 결여 Cas9 유전자를 복제pST1374 벡터와 PST-Cas9 (33)와 같은 구조를 지정합니다. 주 : 포유 동물 발현 벡터는 복제 Cas9 발현 벡터의 구축에 사용될 수있다. </li><li> HR 수리 기증자 벡터의 건설 <ol><li> 수정 (33)의 대상 영역으로 VV의 N1L 유전자를 사용합니다. 왼쪽과 오른쪽 팔의 길이는 약 500-600 bp의 각 대상 영역을 측면 있는지 확인합니다. 참고 : 왼쪽 팔 / 오른팔 대상 지역 50 bp의 중첩까지 가질 수있다 (그림 1 참조). </li><li> 앞서 33, 34 바와 같이 N1L 영역 수리 공여체 벡터를 복제하고 PT-N1L로 수리 공여체 벡터를 나타낸다. 참고 : 수리 기증자 벡터와 그 대상 지역에 대한 그림 1을 참조하십시오. VV의 다른 영역은 영역 (유전자) - 특정 gRNA (들) 및 지역별 수리 기증자 벡터를 사용하여 대상이 될 수 있습니다. 모든 클로닝 벡터는 수리 공여체 벡터의 구축에 사용될 수있다. </li> &lt;/ OL&gt; </li><li> 플라스미드의 확장 <ol><li> 화학적으로 관할 E.으로 플라스미드를 변환 콜라이 제조업체의 지시에 따라. 제조사에 의해 제공된 프로토콜 참조 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. </li></ol></li></ol> 2. 시드 세포 (1 일) <ol><li> 유지 CV-1, 37 ℃에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 세포 (원숭이 신장 섬유 아세포), 5 % CO와 함께 2. </li><li> 80-90% 합류 있습니다를 Trypsinize CV-1 세포 <ol><li> CV-1 세포를 함유하는 T-175 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거한다. PBS를을 잔류 혈청을 제거하고 대기음하기 위해 멸균 PBS의 5 mL를 단일 층을 씻어. 세포를 커버하고 세포 분리를 돕기 위해 약 5 분 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 배치 할 2.5 mL를 1 × 트립신 - EDTA 솔루션을 추가합니다. </li><li> 더하다세포 배양 배지 10 ㎖의 부드러운 피펫 작용에 의해 세포를 중단한다 (단계 2.1 참조). 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트. </li><li> 6 웰 플레이트에 시드 셀 <ol><li> 6 웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양 배지 2 ㎖에 시드 2 × 105 CV-1 세포 트랜 스펙 션 전날. 참고 : 트립신을 제거하는 추가 원심 분리 단계는 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> Cas9 플라스미드 및 gRNA 플라스미드 3. 형질 (주 2) <ol><li> 0.5 μg의 PST-Cas9 플라스미드와 제조자의 지시에 따라 형질 감염 시약을 이용하여 0.5 μg의 gRNA N2 플라스미드 (단계 2.2.3.1에서 제조) 형질 CV-1 세포. </li><li> 배양기에서 24 시간 동안 세포를 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2) (단계 2.1에 기재되어 있음) 새로운 세포 배양 배지로 2 ㎖의 배지를 교체한다. </li></ol> CV-1 세포 및 셔틀 기증자 V 4. 감염엑터 형질 HR에 대한 (3 일) <ol><li> 2 × 105 PFU / ml의 농도로 세포를 DMEM 배지로 백본 VVL15 바이러스 희석. Cas9 및 gRNA 플라스미드의 24 시간 후 형질 전환은 형질 CV-1 세포의 각 웰에 희석 바이러스의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 2 시간 후 바이러스 감염, 제조업체의 지침에 따라 형질 전환 시약을 사용하여 HR에 대한 VVL15 감염된 세포에 1.0 μg의 셔틀 기증자 벡터를 형질. 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 형질 감염된 세포를 놓습니다. </li></ol> 5. 수확 재조합 바이러스 (4 일) <ol><li> 단계 4.2 HR위한 셔틀 도너 벡터 형질 감염 24 시간 후, 세포 스크래퍼를 이용하여 형질 감염된 CV-1 세포를 분리. cryovial에 세포 현탁액을 수집하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장합니다. 참고 : 즉시 살균제있는 모든 세포 배양 배지 유출을 닦아 다음 70 %이든 다시 닦아올. </li></ol> 수정 된 VV 6. 정제 (1 라운드) <ol><li> 1 일에, 아니라 각 3 × 10 5 CV-1 세포와 함께 15 6 웰 플레이트 씨앗. <ol><li> 제 2 일에, 3 분 동안 37 ℃ 수욕 단계 5.1에서 동결 된 세포 현탁액을 해동 및 세포 파편을 제거하지 않은 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 격렬 크리오 바이알 (cryovial)을 소용돌이. </li></ol></li><li> CV-1 세포의 한 6- 웰 플레이트를 감염, DMEM 3 ㎖의 세포 용 해물 1 μL로 희석하고 이미 미디어의 위에, 6 웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포 용 해물을 0.5 mL를 넣고 선물. 단계 6.1에서 제조 된 모든 6 웰 플레이트를 감염. 참고 : 세포 파편의 제거가 필요하지 않습니다. </li><li> 감염 이틀 후에는 (즉, 4 일째), 플라크의 위치를 선회함으로써 마커 펜을 사용하여 플레이트 아래의 플라크 10X 대물 렌즈를 이용하여 형광 현미경 하에서 RFP 양성 플라크를 식별 라벨. 주 : <st룽&gt; 대표 RFP 양성 플라크 그림 3. <ol><li> 여섯 가지 RFP 양성 플라크를 데리러 200 μL의 무 혈청 DMEM 세포 배양 배지를 포함하는 여섯 표시 크리오 바이알 (cryovial)를 준비합니다. 표지 된 플라크 (들) (단계 6.3)를 웰로부터 세포 배양 배지를 흡인. 하는 P200 피펫에 200 μL 팁을 부착 30 μL에 볼륨을 설정 한 cryovial에서 ~ 10 μL 세포 배양 배지을. </li><li> 매체를 방출하지 않고 피펫 푸시 버튼을 누른 채 하나의 표지 플라크의 영역을 스크래치 팁을 사용합니다. 분리 된 세포를 위로 들어 올려 무 혈청 DMEM 190 μL를 포함하는 cryovial로를 전송 피펫 푸시 버튼을 놓습니다. </li><li> (마지막 단계)에서 긁힌 세포와 유리 병에서 다른 10 μL 매체를 가지고 가능한 한 많은 긁힌 세포를 수집하기 위해 동일한 RFP 양성 플라크를 세 번 따기의 절차를 반복합니다. 같은 유리 병에 모든 세포를 전송하고 -80 ° C에서 유리 병을 저장합니다. </ol></li></ol> 수정 된 VV의 7 정제 (두 번째 라운드) <ol><li> 각에 씨앗 3 × 10 5 CV-1 세포 아니라 여섯 6 웰 플레이트와 문화를 24 시간 동안 세포. </li><li> 3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (단계 6.3.3에서) 냉동 크리오 바이알 (cryovial)를 해동 후 세포 용 해물을 얻기 위해 30 초 동안 적극적으로 크리오 바이알 (cryovial) 와동. <ol><li> 6 웰 플레이트 잘 하나에 혼합 세포 용 해물의 0.5 μL를 추가합니다. 각 상패 하나의 6 웰 플레이트를 감염. 2 일 동안 5 % CO 2 (두 번째 라운드 상패 정화)와 37 ° C에서 VV 감염 6 웰 플레이트를 품어. 그런 다음 6.3 절을 반복합니다. 참고 : 이상 여섯 RFP 양성 플라크가 포착 될 수있다 둘 이상의 6- 웰 플레이트는 각각의 플라크 정제를 위해 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 플라크 푸리 8. 또한 라운드문법 없애기 <ol><li> 하나의 양성 플라크 형성 모든 플라크 현미경 RFP 양성인 것으로 나타날 때까지 단계 7에 기재된 동일한 프로토콜 다음 정제의 또 3-5 라운드에서 수행한다. 참고 : 다음이 플라크가 순수한 것으로 간주됩니다. </li><li> 플라크는 순수되면 6.3 절에 설명 된대로 (그림 4, RFP를 표현하는 모든 감염된 세포), -80 ° C에서 cryovial 및 저장에 긍정적 인 플라크를 수확. 단계 9와 10에 설명 된 프로토콜을 다음과 플라크를 확인합니다. </li></ol> 9. 확장하고 정제 된 플라크 (들) <ol><li> 바이러스 감염 전에 6 웰 플레이트 1 일 각 웰에 씨 3 × 10 5 CV-1 세포. </li><li> 세포 용 해물을 얻기 위해 3 분 동안 37 ° C의 수조에서 8.2에서 동결 해동 cryovial. CV-1 세포의 6 웰 플레이트 잘 하나에 (세포 파편을 제거하지 않고) 모든 해물을 추가한다 (단계 9.1에서 시드). 5 37 ° C에서 감염된 CV-1 세포를 품어최대 3 일 %의 CO 2. <ol><li> 모든 정제 된 플라크 (적어도 세 플라크)를 확장합니다. 주 : 감염 시간 해물에서 바이러스의 양에 따라 1-3일 다르다. </li></ol></li><li> 50 % 이상의 세포들이 현미경 하에서 관찰 된 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낼 때, 셀 스크레이퍼를 사용하여 VV 감염된 세포를 수확 (세포는 쉽게 분리 및 RFP 긍정적 반올림). 15 ㎖의 튜브에 세포 배양 배지와 함께 분리 된 세포를 수집한다. <ol><li> 3 분간 300 g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상층 액을 제거하고 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 세포 펠렛을 유지하거나 10 단계 즉시 세포 펠렛을 사용합니다. </li></ol></li></ol> PCR을 사용하여 돌연변이 VV의 수정 10. 확인 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜을 따르는 DNA 추출 키트를 사용하여 단계 9.3.1에서 제조 된 세포 펠렛에서 VV DNA를 추출합니다. 두 번 증류수 200 μL와 DNA를 용출. 참고 : DNA를 추출하고 복제가 올바른 수정 / 삽입이 포함 된 것으로 확인되면 바이러스 생산을 위해 나머지를 유지하기 위해 펠릿의 볼륨의 절반을 사용합니다. </li><li> N1L 유전자의 삭제와 N1L 영역으로 RFP 유전자 삽입 확인. <ol><li> N1L 유전자 (L025)와 N1L 유전자에 대해 고안된 프라이머를 사용하여 유전자 L026 걸친 DNA 단편을 증폭한다. RFP 특이 프라이머를 사용하여 RFP 유전자를 증폭한다. A52R 특이 적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 A52R 걸친 제어 DNA 단편을 증폭한다. 참고 : 특정 프라이머에 대한 자료 목록을 참조하십시오. <ol><li> PCR의 마스터 믹스 키트를 사용하여 PCR을 수행한다. 25 μL DNA 템플릿의 2 μL를 사용하여 PCR 반응 세트, 2 분 동안 94 ° C에서 PCR 반응을 변성 한 후 다음 단계에 따라 PCR의 30주기를 실행 : 15 초 동안 94 ° C에서 DNA를 변성 후, 어닐링 15 초 동안 52 ° C에서 DNA 템플릿에 프라이머는 30 초 72 ° C에서 PCR 반응을 확장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 1 % 아가로 오스 겔 (33)을 사용하여 PCR 산물을 해결. 자외선 겔 문서를 사용하여 겔 이미지를 캡처. N1L PCR이 부정하고 A52R 및 RFP의 PCR 양성이면 플라크 올바르게 N1L 영역으로 변경된다. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9.">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).</li><li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation:+recombination-independent+selectable+cloning+vectors.">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li><li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper.">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li><li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li></ol>

Authors have no competing financial interests.

치료 목적을위한 VV의 수정에 관한 두 가지 주요 목적이있다. 하나는 항 종양 치료 용으로 바이러스를 감쇠하는 티미 딘 키나제 (TK) 유전자로 특정 유전자를 제거한다. 다른 하나는 (예를 들면 GM-CSF와 같은) 원하는 치료 또는 유전자 (예 : 루시 페라 제 유전자 등) 마커 유전자 VV 팔이다. 이 중 하나를 달성하기 위해서는 대상 지역 / 유전자의 삭제를 포함한다. 직접적인 DNA 라이 게이션 방법 (35) 및 시험 관내 패키징 방법 36 TK 유전자 돌연변이와 변형 된 백시 니아 바이러스를 생성하기 위해 이전에 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법에 의한 게놈에서 고유 한 제한 효소 부위의 부족 게놈의 다른 영역의 돌연변이에 관한 어플리케이션을 한정하고있다. 돌연변이 VV를 만드는 현재의 접근 방식은 상동 재조합 incorporati을 유도 2 시간 VV 감염 후 CV-1 세포에 선택 마커 (RFP 또는 GFP)와 셔틀 (기증자) 벡터의 형질을 포함한다대상 영역으로 선택 마커를 ng를. 마커 양성 플라크의 선택은 자신의 정제 24 시간 후 형질옵니다. 플라크 정제 공정은 10 라운드까지 걸릴 마지막 3~4주 종종 오프 대상 지역에 삽입 선택 마커로 바람직하지 않은 재조합 바이러스에 이르게 할 수 있습니다. DNA 이중 가닥 나누기 효과적으로 포유 동물 세포 37 상동 재조합을 유도 할 수 있으며,이 메커니즘을 활용하여, 돌연변이 VV의 생성 효율을 대폭 향상시킬 수있다. gRNA 유도 Cas9 시스템 성공적 게놈 편집에 사용하고 (25), 진핵 생물 (22)에 상 동성 재조합의 효율을 향상시켜왔다. 최근에, 숙주 세포에서 헤르페스 심플 렉스 바이러스는 gRNA 유도 Cas9 의해 편집 된 I 아데노 바이러스 유형의 게놈 시스템 (24). 이는 최근 CRISPR Cas9 시스템 효율적 VV 게놈 편집 및 표현하는 VV 벡터를 구성하기위한 강력한 도구임을 입증되었다특정 유전자. 두 N1L gRNA 유도 Cas9과 기존의 상동 재조합 (HR) 방법은 N1L의 동일한 대상 사이트에서 성공적인 HR 이벤트의 결과. 흥미롭게도, 그러나 전통적인 HR 방법보다 효율이 훨씬 높은 수준에서 Cas9 유도 HR을 gRNA 유도. 따라서 gRNA 유도 Cas9의 사용은 돌연변이 VVS를 얻기 위해 많은 플라크를 정화 할 필요가 없다. 이 작품에서 우리는 크게 gRNA 유도 Cas9 시스템 (33)을 이용하여 돌연변이 VV의 생성 효율 및 시간 프레임을 개선. 참고로, 상동 재조합의 높은 효율을 얻기위한 하나의 중요한 단계는 종래의 상 동성 재조합을 수행하기 전에 24 시간 동안 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드와 CV-1 세포를 형질 감염이다. 24 시간 간격 Cas9 및 gRNA 합리적인 수준에서 표현 될 수있다. 우리가 다른 gRNA가 t 서열을 발견 게다가 특정 유전자 타겟팅 gRNA 순서 최적화 될 필요가있다argeting N1L 유전자 효율성 33, 34으로 변화. 편집 VV의 CRISPR / Cas9에 대한 제한은 재결합의 첫 번째 라운드에서 RFP 양성 플라크의 낮은 속도입니다. 지루한 스크리닝 1 차 만드는 재조합 바이러스를 포함 RFP 양성 플라크 충분한 수 보통 적어도 10 6- 웰 플레이트가 필요할를 얻었다. 따라서, 이러한 한계를 극복 할 수있는 프로토콜을 최적화 할 필요성이 여전히 존재한다. RFP 양성 플라크의 작은 크기는 6 웰 플레이트를 감염시키기 위해 사용되는 용 해물의 고용량에 의한 또 다른 잠재적 인 문제이다. 이를 극복하기 위하여, 용 해물의 작은 부피가 큰 크기의 RFP 양성 플라크를 획득하기 위하여 6- 웰 플레이트를 감염시키기 위해 사용되어야한다. 분해물의 작은 부피를 사용해도 RFP-부정적인 RFP에서 양성 플라크의 더 나은 분리를 위해 사용된다. 따라서 플라크 정화의 적은 라운드 순수한 RFP 양성 플라크를 얻기 위해 필요합니다. <p효과는 항상 유전자 편집에서 원하지 않는 문제가 있습니다 오프 대상 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;. CRISPR-Cas9 오프 대상 효과를 보여 주었다. VV 33 34 게놈 편집 그러나 gRNA 신중한 디자인, 오프 - 타겟 효과를 회피 할 수있다.이 VV의 게놈을 편집하는 gRNA 유도 Cas9 시스템을 사용하는 특정의 장점이다. 생물 의학 연구 및 병진 의학의 돌연변이 VVS의 개발을 가속화 할 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여, VV의 약속을 감안할 때. 또한, 이러한 시스템은 또한 그 액틴 기반의 운동을 위해 VV에 의해 사용되는 신호 전달 경로의 절개와 같은 세포 생물학의 발견을 촉진한다.

백시 니아 바이러스 (VV)는 폭스 바이러스 제품군에 속하는 포락선 DNA 바이러스이며, 천연두의 박멸의 의학에서 가장 큰 업적 중 하나에 중요한 역할을하고있다. 천연두의 포스트 박멸의 시대에, VV는 VV 벡터로 다양한 병원체의 유전자를 삽입하여 HIV 및 기타 전염성 질환 1-7에 대한 백신에 대한 유전자를 전달하는 벡터로 개발되었다. VV 또한 광범위 특히 종양 타겟팅 복제 콜리 틱 백시 니아 바이러스의 개발을 위해 암 면역 8-14을위한 벡터로서 사용되었다. 암세포에 대한 향상된 선택성 효과적인 백신 벡터를 생성하기 위하여, 바이러스 게놈 내에서 변형 유전자 결실 또는 유전자 치료의 도입을 포함해야한다. DNA 기술의 발달과 VV으로 분자 생물학 및 바이러스학, 외래 DNA의 삽입 나은 이해를 달성 하였다 원래D 1980 (15)에 상 동성 재조합 (HR)을 사용. 이 방법은 여전히 ​​VV 벡터를 구성하기위한 널리 사용되는 것입니다. 유전자 변형의 도입 이전에 감염된 세포에서 VV 게놈과 재조합 HR위한 셔틀 벡터를 사용하여 달성된다. 그러나,이 방법은 (1 % 미만의 상동 재조합 효율 16) 매우 비효율적 인 것으로 판명되었다 종종 비 대상 영역 및 / 또는 바이러스 팽창시의 마커의 손실에 선별 마커의 임의의 삽입을 초래한다. 게놈 유전자좌에 외래 DNA를 삽입 DNA 상동 재조합의 효율을 극적으로 이중 가닥 나누기 (DSBs) (17)의 존재로 향상 될 수있다. 따라서, 목표 궤적에서 DSBs을 유도 할 수있는 기술은 VV의 게놈 엔지니어링에 대한 큰 잠재력을 보유하고있다. 최근에 개발 된 CRISPR-Cas9 시스템은 VV 유전자 영역에 DSBs 트리거에 대한 약속을 보여줍니다. CRISPR-Cas9는 RNA-입니다침입 파지 및 기타 해외 유전 재료 18 ~ 20에 대한 적응 면역에 관여 인도 뉴 클레아. 미생물 종 (21)의 범위에서 세 CRISPR-CA는 시스템이있다. 유형 II-CRISPR 카스 시스템은 널리 진핵 세포 대규모 바이러스의 게놈 편집에 사용된다. 그것은 (연쇄상 구균 pyogenes의에서)에 RNA 유도 Cas9 효소로 구성되어, 하나의 가이드 RNA (sgRNA)와 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA) 22-24. Cas9 / sgRNA 복합체는 포유 동물 세포 22 5&#39;- NGG-3 &#39;Protospacer 인접 모티브 (PAM) 서열 23 항 상보 20 뉴클레오티드 게놈 서열을 인식한다. 성공적 유 전적으로 변형 된 세포, 바이러스의 효율적인 생성을 위해 사용 된 및 동물 모델 22-32. CRISPR-Cas9 시스템은 VV의 세포질에서 상동 재조합과 함께 대상으로 게놈을위한 효율적인 도구가 될 입증 CV-1 세포를 감염S는 돌연변이 백시 니아 바이러스를 33, 34을 생성한다. 이러한 방법의 적용 가능성을 확장하기 위해, 우리는 이러한 시스템의 방법론에 대한 상세한 정보를 제시한다. 기술 된 프로토콜은 특정한 유전자 결실 돌연변이 VV를 생성 및 / 또는 치료 용 유전자와 돌연변이 바이러스를 암하는데 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Plasmid #41824</td>
			<td style="width:212px;">41824</td>
			<td style="width:137px;">Addgene</td>
			<td style="width:225px;">gRNA cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pST1374&#160;</td>
			<td>13426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Cas9 cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pGEMT easy</td>
			<td>A1360</td>
			<td>promega</td>
			<td>repair donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E .Coli</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>27106</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dulbecco&#8217;s Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>SH30088.03HI</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin, streptomycin</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Effectene</td>
			<td>301425</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL</td>
			<td>W-06754-96</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>collect virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Olympus BX51 Fluorescence&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>find RFP-positive plque</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>69506</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td>
			<td>AB-0794/B</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PCR reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm culture dish</td>
			<td>Z688819-6EA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell scraper</td>
			<td>C5981</td>
			<td>sigma</td>
			<td>scrap cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XTrypsin-EDTA solution</td>
			<td>T4299</td>
			<td>sigma</td>
			<td>trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>95015661</td>
			<td>Anachem Ltd</td>
			<td>desinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tube</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>hold cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L forward 5&#8217;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L reverse&#160; 5&#8217;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R forward 5&#8217;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R reverse 5&#8217;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP forward 5&#8217;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&#8217;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP reverse 5&#8217;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argarose</td>
			<td>A7431</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>resolve PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G:BOX F3</td>
			<td>G:BOX F3</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>UV gel doc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

새로운 VV 벡터 건설 용 키 시작점 설계 및 게놈의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 도너 셔틀 벡터를 생성하는 것이다. 이 연구에서, VV N1L 유전자는 예를 목표로 하였다. 재결합과 VV의 대상 영역에 대한 도너 셔틀 벡터의 카세트는도 1에 도시된다. 상동 재조합의 효율성을 향상시키기 위해, Cas9와 N1L 특정 gRNA 발현 플라스미드는 CV로 공동 형질 감염시켰다 상동 재조합 (33)을 수행하기 48 시간 전에 세포 -1. 하루 (24 시간) 후 형질은 RFP는 CV-1 세포 (그림 2)로 표현 하였다. 상동 재조합의 전체 해물 (5 단계)와 CV-1 세포의 감염 후 긍정적 인 RFP 및 음의 플라크는 모두 CV-1 세포 (그림 3)에서 관찰되었다. 정화 프로토콜 설명에 따라, 순수 플라크 공동<html> 정화의 3-5 라운드 경기를 얻을 수 ULD. 도 4에 도시 된 바와 같이, 돌연변이 백시 니아 바이러스와 순수 플라크 유래의 세포 용 해물 감염 후 모든 플라크는 RFP 신호를 선보였다. 도 5에 도시 된 바와 같이 VV 정확한 유전자 변형 있던 순수 돌연변이, PCR은 표적 N1L 유전자의 부재를 확인하기 위해 사용되었는지를 확인하기 위해. 변형 된 바이러스의 PCR은 RFP에 긍정적 신호와 N1L 대한 존재 신호 (보여 도 5 레인 AG) 온전한 N1L 영역과 컨트롤 바이러스 (CTR)에 대한 N1L의 PCR 결과 양성된다. A52R의 제어 DNA 단편은 모든 재조합 바이러스 및 클릭률 바이러스에 양성이었다. RFP 양성 플라크의 HR 효율이 실험 (그 이전 일 34에서 94 %에 있었다)에서 100 % (6/6)입니다. 본원에 기재된 방법은 기존의 프로토콜 (33), (34)에 비해 100 배 재결합 효율이 향상되었다. 콘텐츠 &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> 그림 1. 상동 재조합 도너 셔틀 벡터의 카세트 및 VV 게놈의 표적 영역은 정제 마커 유전자 RFP는 H5 프로모터에 의해 구동된다. RFP에 유전자의 영역 N1L 결과 타겟팅 수리 도너 벡터는 상 동성 재조합 후 N1L 영역에 포함된다. &#39;X&#39;는 백시 니아 바이러스 게놈에 동일한 시퀀스를 대체 할 수리 기증자 벡터의 상 동성 순서를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> 그림 2 :. afte 상동 재조합 후 CV-1 세포 1 일 이미징 어느 날R 상동 재조합, 수리 기증자 벡터에 의해 VV 감염과 형질 세포는 RFP-긍정적 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 현미경 이미지 (원래 배율 100 배)가. 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> 그림 3 :. 돌연변이 바이러스의 첫 번째 라운드 정화의 RFP 양성 플라크 돌연변이 바이러스의 1 라운드 정화에는 대상 영역 삭제와 RFP 양성 플라크 (레드 라인으로 동그라미는)에 의해 형성된 플라크에 의해 둘러싸여있다 야생 (노란색 선으로 동그라미) 형 바이러스 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 MICRoscopy 이미지 (원본 배율 100 배). 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> 그림 4 :. VV는 정화의 3-5 라운드 후, 순수한 플라크 모든 플라크로 얻었다 순수한 돌연변이는 RFP 양성이었다 A :. 위상 대비 이미지 (원본 배율 100 배) B :. 형광 현미경 이미지 (원래 배율 100 배) . 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> 그림 5 : VerificatioVV에서 추출 된 순수 돌연변이 VV. DNA의, n은 CV-1 세포를 감염. N1L N1L이 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인 된 대상 영역의 결실은 N1L 영역으로 RFP의 삽입은 RFP의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인 하였다. 레인 AF 여섯 정제 플라크에 해당 차선 G는 이전의 연구 (33)에서 확인 N1L 삭제와 제어 패이고, 차선 클릭률 (제어) (N1L 영역에 그대로 포함) 야생형 우두 바이러스입니다. A52R 유전자는 모든 샘플에 대한 제어 유전자로 증폭되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K 조회수.  Queen Mary University of London.  백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...