This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Not: Bizim mikroakışkan cihaz imalatı için photomask tasarımları bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak çizildi. tasarımlar daha sonra ticari bir hizmeti kullanarak krom, fotoğraf maskeleri imal etmek yararlanılmıştır. PDMS cihazlar yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılmıştır. 11 Litografi tarafından Usta Kalıpları 1. Fabrikasyon <ol><li> Fotolitografi işlem 12 önce, bir alt-tabaka 4-inç çaplı silisyum gofret kullanımı ve 10 dakika boyunca 120 ° C de, geleneksel bir fırında gofret dihidrat. </li><li> Bir plazma temizleyici 30 saniye boyunca 100 watt oksijen plazma tedavisi ile susuz silikon gofret temizleyin. </li><li> Aşağıdaki pişirme işlemi için, sırası ile 65 ° C &#39;de iki ocak ve 95 ° C, ön ısıtma. </li><li> spin kaplayıcı ile temizlenir silikon gofret üzerinde olumsuz fotorezist (PR) Coat 5 g; 30 sn 1,200 rpm (SU-8 50) spin mikrokanal tabakası üretmek. </li><li> PR yerleştirin12 dakika boyunca 65 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine gofret kaplanmış ve yumuşak bir fırında işlemini gerçekleştirmek için (100 mikron kalınlığında desenler) 33 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir ısıtılmış sıcak plaka aktarın. </li><li> Pişirme sonrasında, bir yarı otomatik maske hizalama sahibinin PR kaplı silikon gofret yerleştirin ve bir 25400 dpi çözünürlük şeffaflık photomask onu hizaya getirin. </li><li> Silikon gofret PR desen oluşturmak için 500 mJ / cm2 dozunda UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa. </li><li> hizalama gelen gofret çıkarın ve 12 dakika süreyle 95 ° C&#39;de post-Pişirme için bir ocak üzerine yerleştirin. </li><li> hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için 12 dakika ve azot gazı ile hafifçe kuru için çapraz bağlanmamış PR yıkayın SU-8 geliştirici (propilen glikol monometil eter asetat, PGMEA) çözeltide gofret bekletin. </li><li> Yine, spin kaplayıcı tarafından gofret üzerinde olumsuz fotorezist ceket 5 g; 300 ve 30 sn için 30 saniye ve 1200 rpm&#39;de (SU-8 10) 700 rpm&#39;de (SU-8 100) spin# 181; m kalınlığında desen ve 27 mikron kalınlığında desen sırasıyla mikro katmanı yapmak. </li><li> (27 um, derin çekme çukurlu katmanı), 4 dakika ve 8 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 65 ° C&#39; de bir sıcak plaka üzerinde PR kaplanmış gofret yerleştirin; 40 dakika boyunca 65 ° C &#39;de ve (300 um derin bir kültür çukurlu tabakası için), 110 dakika boyunca 95 ° C&#39; de. </li><li> Soğuduktan sonra, UV ışığı ile donatılmış maske hizalama PR kaplı silikon gofret yerleştirin. </li><li> 250 mJ / cm 2 (27 mikron kalınlığında deseni) ve 700 mJ / dozunda cm 2 (300 mikron kalınlığında pattern) UV ışığı (365 nm) PR kaplı silikon gofret Açığa. </li><li> sırasıyla 5 dakika boyunca (27 mikron kalınlığında deseni) ve 30 dakika (300 mikron kalınlığında kalıp) 95 ° C &#39;de gofret pişirilir. </li><li> sırasıyla 6 dakika (27 mikron kalınlığında deseni) ve 25 dakika (300 mikron kalınlığında desen), için PGMEA tarafından çapraz bağlanmamış PR yıkayın ve sonra azot gazı ile kurulayın. </li><li> desen özelliklerini yüksekliğini ölçmekBir tarayıcı lazer Profilometrenin xy-sahnede gofret koyarak tarama lazer profilometreyle gofret. <ol><li> açıkça desen 20X objektif mercek altında &quot;kamera görüntüsü&quot; gözlem modu kullanarak gofret özelliklerini göstermek için odak düzlemi ayarlayın. </li><li> &quot;Lazer görünüm&quot; &quot;kamera görüntüsü&quot; dan gözlem moduna geçmek ve özellikleri üst ve alt pozisyonları ayarlayın. </li><li> sırasıyla ölçüm modu, alanı, kalite ve saydam (üstte) kadar z-zift, 1 satır (1.024 x 1), yüksek doğruluk ve 0.5 mikron, ayarlayın ve ardından ölçüme başlamak için başlangıç ​​altını basın. </li></ol></li></ol> Tek hücreli İzolasyon PDMS Cihazlarının 2. Hazırlık <ol><li> PDMS döküm önce, daha kolay ana kalıpları PDMS kopyaları kalkmasına yapar hidrofobik bir yüzey yaratmak için trichlorosilane ile ana kalıpları Silanize. <ol><li> usta kalıpları ve içeren bir ağırlık tekne yerleştirin200 kurutucuda trichlorosilane ul ve 15 dakika boyunca vakum (-85 kPa) uygulanır. </li><li> vakumu durdurmak ve daha sonra en az 1 saat oda sıcaklığında ana kalıpları Silanize için desikatörde ana kalıpları bırakın. </li><li> desikatöre master kalıpları çıkarın ve 10 cm Petri kabındaki her ana kalıp yerleştirin. </li></ol></li><li> bir taban ve 10 arasında bir oranda bir sertleştirme ajanı ihtiva eden 17.6 g PDMS polimer kitinin bir toplam tutarını karıştırın: 1, ve daha sonra Petri kabındaki ana kalıp PDMS dökün. </li><li> desikatörde Petri kabı yerleştirin ve PDMS hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat vakum (-85 kPa) uygulanır. </li><li> desikatör Petri çanağı çıkarın ve 3 65 ° C sıcaklıkta, geleneksel bir fırında yer - PDMS tedavisi için 6 saat. </li><li> ana kalıpları tedavi PDMS kopyaları çıkarın ve 0 iç-çapına sahip bir puncher&#39;ait yakalama-kuyu dizi PDMS çoğaltma Mikrokanallı iki ucunda iki bir giriş olarak delikleri ve bir çıkış yumruk.Akışkan kanalının (Şekil 2A) için 75 mm. </li><li> PDMS kopyaları yüzeyini temizlemek ve sonra kısa bir oksijen plazma tedavisi (14 sn için 100 watt) için bir plazma temizleyici PDMS kopyaları yerleştirmek için bant kullanın. </li><li> oksijen plazma makineden PDMS kopyaları çıkartın. </li><li> Bir stereomikroskop altında elle bir üst (yakalama mikro içeren) ve (kültür mikro içeren) bir alt PDMS çoğaltma hizalayın ve temas getirmek. </li><li> Nihai cihaz oluşturmak PDMS yinelemeler arasında sürekli bir bağlantı sağlamak için 24 saat boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde hizalanmış PDMS yinelemeler yerleştirin. </li><li> deiyonize (Di) -su doldurulmuş kapta PDMS cihaz ıslatın ve PDMS cihazın mikrokanaldan havayı çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında (-85 kPa) bir desikatör içinde kap yerleştirmek. </li><li> Bir doku kültürü kaputu DI su dolu PDMS cihaz yerleştirin ve UV ışığı (ışığın dalga boyu: 254 nm) kullanmak 30 mil için cihazın sterilize etmekn. </li><li> 1X PBS çözeltisi içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile PDMS cihazında distile su yerine ve PDMS yüzeye yapışmasını engellemek için hücrelerin 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. BSA kaplama izole hücre transferi verimini artırmak için kritik yakalama oyuklu kültür oyuklu: edin. </li><li> sterilize 1x PBS çözeltisi ile PDMS cihazın% 5 BSA çözüm değiştirin. </li></ol> Tek hücreli Süspansiyon 3. hazırlanması <ol><li> Kültür Nöral hücre KT98 ve insan karsinoma hücre A549 ve MDA-MB-435, biz kök PDMS cihaz hücre deneyi için hücreler hazırlamak için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) Petri kabındaki . </li><li> Çıkarın ve geçirilerek kültür ortamı 70 yetiştirilen hücreler kültür kabı (% 10 fetal bovin serumu ve% 1 antibiyotik ile birlikte DMEM bazal ortamı) iptal -% 80 birleşir. </li><li> Yavaşça sterilize PBS üç kez hücreleri yıkayın. &lt;/ Li&gt; <li> (Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi bakınız) çıkarın ve PBS atmak ve proteolitik, kolajenolitik ve DNaz faaliyetleri ile rekombinant enzim karışımı 2 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü çanak inkübe ve daha sonra hücre ayrılması için kültür çanağı dokunun. </li><li> hücrelerin dağıtılması için steril PBS 4 ml ve sonra 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 3 dakika boyunca 300 xg&#39;de tüp Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Yavaşça PBS sterilize 1 ml hücre pelletini ve standart Tripan Mavi dışlama yöntemi 13 kullanarak canlı hücre sayısını. Not: Bu yeniden süspansiyon haline adımı tek hücre izolasyon verimini artırmak için iyi ayrışmış tek hücre süspansiyonu hazırlamak için kritik önem taşır. </li></ol> 4. Tek hücreli İzolasyon ve klonal Kültür <ol><li> 2.5 x10 - 2.2 arasında bir konsantrasyonda Yük hücresi süspansiyonu 50 ul <subir el pipet ile cihazın çıkış deliğinden PDMS cihazın Mikrokanallı içine p&gt; 6 hücre / ml. Not: Hücre süspansiyonu yükleme pipet Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması durdu ve ilk durağı konumunda düzenlenecek gerekmektedir. </li><li> eşit hücreleri ile tüm Mikrokanallı doldurmak için giriş delikten hücre süspansiyonu başka bir 50 ul yükleyin. </li><li> giriş ve çıkış delikleri damlacıklar gelen hidrostatik basınç ile uyarılan akışını önlemek için bir tıkaç (3 mm uzunluğunda, 1 mm çapında kesim naylon misina) ile çıkış deliği mühür. Not: Fişler kullanmadan önce bir doku kültürü kaput içinde sterilize UV ​​idi. </li><li> , Kültür ortamı ile 1 ml steril şırınga doldurun ondan hava kabarcıklarını çıkarmak ve bir şırınga pompası kurmak. </li><li> Bir 23 G, kör bir iğne ve bir poli-tetrafluoroethene (PTFE) boru ile PDMS cihazın giriş deliğine orta yüklü şırınga bağlayın. </li><li> çıkış deliği ve tüm prizden çıkarınow 2 dk zaman aralığı hücreleri yerçekimi kuvveti tarafından tek hücreli yakalama-kuyu içine yerleşmek için izin vermek. </li><li> şırınga pompası tarafından tahrik edilen 600 | il / dk&#39;lık bir akış oranında kültür ortamında 300 ul uncaptured hücreleri yıkamak. </li><li> Cihazı stabilize etmek 2 dakika bekleyin ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için fişler ile giriş ve çıkış delikleri kapatın. </li><li> kültür mikro yakalanan tek hücreleri aktarmak için el cihazı çevirin. </li><li> 100 mm doku kültürü çanağı içinde PDMS cihaz yerleştirin ve mikrokanaldan kültür ortamı buharlaşmayı önlemek için cihaz etrafında steril 10 ml PBS ilave edin. </li><li> Tek hücrelerinin klonal kültürü için geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) kültür çanağı hareket. </li></ol> 5. Kültür Orta Yenileme <ol><li> kültür 1 gün sonra, hücre pr geliştirmek için taze ortam PDMS cihazında bir kültür ortamı yerineoliferation. </li><li> Bir sonraki adımı yaparken Mikrokanallı içine hava kabarcıkları almaktan kaçınması giriş ve çıkış delikleri alanların yakınında PDMS cihazın üstündeki kültür ortamının iki damlacıkları yerleştirin. </li><li> Bir giriş olarak, mikrokanalın iki ucunun yakınındaki PDMS cihazın üst ve mikrokanal için bir çıkışı iki delikler. Not: PDMS cihazın tam iki kat üzerinden yumruk etmeyin; Bunun yerine, sadece PDMS üst katmanı sayesinde yumruk. </li><li> Bir 23 G, kör bir iğne ve PTFE tüp vasıtasıyla girişe taze ortam ihtiva eden bir 1 ml&#39;lik plastik bir şırınga bağlayın. </li><li> eski orta yerine 5 dakika süreyle cihaza 120 ul taze orta akış. </li><li> giriş mühür ve delikler çıkış ve hücre kültürü inkübatör cihazı geri dönmek için iki fişleri takın. </li><li> 5.5 adımları 5.4 tekrarlayarak ardından sızdırmazlık tapaları, kaldırarak kültür ortamının kültürünün döneminde her 2 günde bir yenileyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity.">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2005).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays.">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells.">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li><li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture.">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li><li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells.">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997 (2009).</li><li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture.">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li><li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses.">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li><li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays.">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li><li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation.">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li><li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+solid+tumors:+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization.">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li><li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays:+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays.">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity.">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikro-tabanlı bir aygıt sistemleri 6,14 örneğin 6 yakalama geniş çaplı tek bir hücre tek kök hücre çoğalması 15 gibi tek hücre manipülasyonu ve analiz için kullanılmıştır. De boyut, sayı ve şekil olsa da, özel uygulamalar için ayarlanabilmektedir kuyunun boyutu artar olduğunda tek hücre izolasyon verimi, her zaman ele almaktadır. 9,15 Mikro boyutu hücre yayılması ve büyümesi için izin vermek için büyütülür ise bu sınırlamayı aşmak için, Park ve ark., Yüksek tek hücreli yakalama oranı (58.34%) sahip üçgen mikro bir mikroakışkan çip bildirdi. Bununla birlikte, (bir tarafı ~ 50 um uzunluğunda) mikro-olduğunda, en fazla 2 gün için hücre çoğalmasını destekleyebilir. 16 Dual-çukurlu stratejisi, büyük mikro tek-hücre yükleme Poisson olasılığı ile sınırlı değildir sağlar dağıtım Dilu sınırlama karşılaşılanyon yöntem ve büyüklüğü en az 7 gün (Şekil 4A), hücre çoğalması için yeterli geniş mikro yüksek tek hücre izolasyon etkinliği (% 75&#39;den daha fazla) sağlanması ile gösterildiği gibi, açık yanı sistemleri 3. Çok verimli bir basit cihaz ve işlem prosedürü ile tek hücreli izolasyonu ve klonal kültürünü gerçekleştirmek için kabiliyetinden dolayı, bizim mikroakışkan platformu clonogenic tahlil 17 kanser kök hücre seçimi de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için yararlı bir araç teşkil ki tasavvur ilaçların 18,19 ve yüksek verimli kardiyotoksisite tarama. Bu tek-hücreli izolasyonu ve kültürü platformun önemli bir sınırlama kültürün-kuyu kültür hücreleri arasındaki çapraz karışmayı önlemek için tek tek kapalı kültür kuyu oluşturmayan olmasıdır. Bu nedenle, hücre davranışını mikroakışkan cihazda diğer izole edilmiş tek-hücre parakrin salgılanmasıyla etkilenebilir. otplatformumuzun onu sınırlaması yüksek verimlilik tek hücre izolasyonu için göreceli olarak yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonu hazırlamak için ihtiyaç vardır. Bu yüksek hücre tüketimi gibi sulu mizah hücreleri gibi nadir hücre izolasyonu ve kültürü, uygulamalarını sınırlayabilir. Cihaz işlemi başlamadan önce, bağlı PDMS cihazdan herhangi bir sıvı sızıntısı Mikrokanallı doldurmak ve dikkatli gözlemlemek giriş deliğinden distile su enjekte etmek için önemlidir. Sıvı kaçağı olumsuz hücre yakalama ve aktarımı sonucu etkileyebilecek böylece mikrokanalda akış durumunu etkiler. Bizim tek hücreli yükleme verimliliği çalışmanın sonuçları cihazı saygısız çoğu hücreleri etkin bir şekilde transfer edilebileceğini belirten kültür-kuyulara yakalama-kuyu izole hücreler aktardıktan sonra çok düşük hücre kaybı gösterir, ancak ek olarak, transfer verimi ise azalır BSA engelleme adımı (2.12) düzgün gerçekleştirilmez. Kullanıcılar BSA engelleme protokolü değiştirebilir veya al kullanabilir(Daha yapışık hücre tipi kullanıldığında BSA konsantrasyonu veya kaplama süresini arttırmak, örneğin) kendi özel hücre deneyi ihtiyaçları için ternatif yüzey modifikasyonu yöntemleri. hücre yakalama-deliklerin boyutları ilgi hücre türüne boyutuna bağlı olarak, yakalama-Wells iyi tek hücre yükleme verimliliği optimize edilmesi gerekir baskın faktör vardır. Yüksek çoklu hücre-in-a-yakalama-kuyu olayları ilgi hücre tipi için çok büyük yakalama kuyu boyutuna sahip nedeniyle, yakalama kuyuda düşük hücre yükleme verimliliği refahı yakalama boyutunun göstergesidir oysa çok küçük. Hücre kümeleri yakalama kuyularda tek hücreli yükleme etkinliğini azaltabilir gibi hazırlanan tek hücre süspansiyonu, hücre kümeleri en aza indirmek için önemlidir.

Şu anda bir kültür alanı ayrı ayrı tek hücre yerleştirilmesi genellikle sınırlayıcı seyreltme veya floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak elde edilir. sadece kolayca elde edilebilir Bir pipet ve doku kültür plakaları, gereğine göre bir çok laboratuarlar için, sınırlayıcı seyreltme, uygun bir yöntemdir. Bu durumda, bir hücre süspansiyonu seri uygun bir hücre yoğunluğuna kadar seyreltilir ve daha sonra bir el ile bir pipet kullanarak kültür kuyu içine yerleştirilir. Bu bölmeli tek hücreler daha sonra, 1 ve koloni oluşumu 2 tarama genetik heterojenliğinin olarak, hücre analizi için kullanılmıştır. Sınırlayıcı seyreltme yöntemi Poisson dağılımı doğa% 37 3 maksimum olasılık tek hücreli olayları kısıtlar çünkü Ancak, bu yöntem yardım için bir robot kolu kullanarak olmadan düşük verimlilik ve emek-yoğun, olduğunu. entegre robot kol ile FACS makineleri doğru Plac tarafından Poisson dağılımının sınırlama üstesinden gelebilirBir anda 4 de hiç bir kültürde tek hücreli ing. Ancak, yüksek mekanik kayma gerilmesi 5 (böylece, hücre canlılığını indirdi) ve makine alım ve işletme maliyetleri çok laboratuvarda kullanımını sınırlıdır. Çok verimli bir mikro 6 içine tek hücreler yüklemek için yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, mikro cihazlar geliştirilmiştir. Ancak, mikro-yüklü hücreler nedeniyle tek hücreli yükleme olasılığını maksimize etmek için tek bir hücre olduğu yakın microwell her boyutunu yapma ihtiyacı, çoğalmaya için yeterli alan vermeyin. Kültür deneyleri daha büyük mikro-birçok hücre bazlı uygulamalar (örneğin, klonojenik analiz 7), gerekli olduğu için (90 - 650 um çapında ya da yan uzunluğunda), aynı zamanda uzun bir hücre kültürleri için izin vermek için kullanılmıştır. Ancak, sınırlayıcı seyreltme yöntemi gibi, onlar da 10 arasında değişen, düşük tek hücre yükleme verimliliği sahip -.% 30 89 Daha önce, 10 cihazı poli-dimetilsiloksan (PDMS) ile yapıldı. Ayrı ayrı mikro tek hücrelerin izole edilmesi ve izole edilmiş hücrelerin klonojenik deneyde uygulanmasını göstermek için yüksek verimli mikroakışkan platformu geliştirilmiş ve mikro dizilerinin iki grup ihtiva eder adres büyük ölçüde olan boyutu kuyucuklarda tek bir hücreyi yüklenirken verimliliğini artırabilir farklı mikro boyutlarda olan hücrenin önemli ölçüde daha büyüktür. Özellikle, bu &quot;çift kuyu&quot; kavramı kültür alanının büyüklüğü esnek o basit farklı hücre tiplerini ve uygulamalarına uygun cihazın tasarımını ayarlamak için yapım, tek hücreli yakalama verimliliği etkilemeden ayarlanmasına imkan verir. Bu yüksek verimli bir yöntem, hücre heterojenite çalışmaları ve monoklonal hücre çizgisi oluşturulması için uzun vadeli bir hücre kültür deneyleri için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Part No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Silicon wafer&amp;nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Conventional oven</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasma Treatment System</td></tr><tr><td>SU-8 50 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2&quot; ~ 6&quot;</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td></tr><tr><td>Scanning laser profilometer</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Space saver vacuum desiccator 190&amp;nbsp;mm white base</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>with 0.75 mm inner-diameter</td></tr><tr><td>Removable tape</td><td>3M Company</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basal medium</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Recombinant enzyme mixture</td><td>Innovative cell technology</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) cell membrane dye</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Used as a cell tracker</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastic syringe (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge blunt needles</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>inner diameter, 0.51&amp;nbsp;mm; outer diameter, 0.82&amp;nbsp;mm</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for high-throughput single-cell isolation and culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Tek hücre izolasyonu ve kültürü için mikroakışkan platformu mikro dizileri iki set (Şekil 2A) ile bir mikrokanal (yükseklik 200 mm) içerir. Mikro dizilerin iki set yakalama oyuk (çapı 25 mm ve derinliği 27 mm), sırasıyla, tek hücreli izolasyonu ve kültürü için, kültür oyuk (çapı 285 mm ve derinlik 300 mm), ve her olarak adlandırılır üst görünümü (Şekil 2B) görüldüğü zaman yakalama-kuyu kültür-kuyu merkezinde konumlandırılmış. Cihaz işlemi (şematik işlem akışı Şekil 1&#39;de gösterilmiştir), gerekli ekipman (şırınga pompası, doku kültürü inkübatör ve mikroskoplar) ve malzeme (şırınga, pipet ve tüp) biyolojik laboratuvarlarda yaygın olarak mevcuttur. Ayrıca, platformun taşınabilirliği ve şeffaflık hücreleri kolayca konvansiyonel olan bir cihaz gözlenen ve analiz edilmesine izinHücre kültürü deney sırasında tional mikroskobu. 85,16 ± 1.91% (hücre tipine bağlı olarak) (Şekil 3A) için 67.80 ± 11.38 den% yıkama aşaması aralıkları sonra yakalama kuyularda hücrelerin yakalama etkinliği. Kültür-deliklerin (Şekil 3B), yüklü hücrelerin sayısı analiz ile teyit edilmiştir, - Ayrıca, yakalama kuyuların çoğu tüm üç hücre (92,98% 89.89%), yalnızca bir tek hücre ihtiva eder. Kültür-kuyu son tek hücre izolasyon verimi KT98 ve MDA-MB-435 hücreleri için fazla% 76, ancak test edilen hücre tipleri arasında hücre boyutu farkları nedeniyle A549 hücreleri sadece% 61. Kanser Araştırma için, tek hücre klonojenik analiz ilaç direnci ve tek tek hücre kolonilerinin çoğalmasının oranlarını test etmek için kullanılabilir. Bizim p izole tek hücrelerin hücre kültürü ve clonogenic tahlillatform kültür ortamı her 2 günde bir yenileyerek yürütülmüştür. Bu gösteri hücre canlılığı ve bireysel hücrelerin çoğalması oranlarındaki farklılıklar ölçerek tek hücre düzeyinde hücresel heterojenliği eğitim için bu cihazın uygulanabilirliğini vurgulamaktadır. İzole hücrelerin hücresel heterojenite ve çoğalma oranı günlük edinilmiş görüntülerden analiz edildi. Sonuçlar izole tek hücreler 7 gün süreyle kültüre ve farklı büyüme modelleri sergilenecek olabileceğini gösterdi. Hücrelerin% 17.5 den fazla 15 hücre ve kültür sırasında oluşan hücre kolonileri (Şekil 4A) ayrılır ise, örneğin, izole edilmiş hücrelerin% 13 hücre-bölünmesi vardı ve tek bir hücre (Şekil 4B) olarak kaldı. 14 hücreleri - çoğalan hücreler arasındaki hücresel heterojenlik iki hücre (% 4.3), üç hücreye (% 2.5) ve 4 oluşturabilen Farklı büyüme modelleri kanıtladığıHücre kültürü deneyi (Şekil 4C) (15%). Bu sonuçlar, bir platform uzun süreli hücre kültürü, klonojenik tahlilleri ve hücre heterojenite çalışmaları için kullanılabileceğini göstermiştir. az yer kaplayan bir bölgede yetiştirilen tek tek hücre kolonileri bir sayıda olması da hücrelerin kolay mikroskopik analizini yapar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig1.jpg" /> . Mikroakışkan platform yüksek hacimli tek hücreli izolasyonu ve kültürü için işlem akışı Şekil 1. şematik gösterimi tek hücre izolasyonu ve klonal kültürü için çalışma prosedürü 4 aşamaları içerir: plastik bir ucu ile mikrokanalın içine i) yük hücresi ve manuel pipet; ii) bir şırınga pompası tarafından tahrik edilen taze kültür ortamı ile uncaptured hücreleri yıkamak; iii) fişli giriş ve çıkış açıklıkları kapatıldıktan sonra, birolated hücreler cihazı saygısız kültür-kuyulara yakalama-kuyulardan transfer edildi; ve iv) kültür-kuyularda klonal kültürünü (clonogenic tahlil) gerçekleştirin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig2.jpg" /> Şekil 2. Fotoğraf ve mikroakışkan tek hücre izolasyonu ve kültürü platformu SEM görüntüleri. (A) Tek hücre kültürü için mikro ve mikro yapılarını gösterir kırmızı boya ile yüklenen mikroakışkan platformu. (B) mikroakışkan platformda üç tek hücre izolasyonu ve klonal kültür birimlerinin yan görünümünü gösteren, bir kesim cihazdan alınan bir temsilci görüntü. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Tek hücreli kültürü (C) ve yakalama SEM görüntüleri (D </strong&gt;) farklı boyutlarda yapılar (mikro-). mikro boyutları, özel hücre tipleri ve Kültür stratejileri için ayarlanabilir. Ölçek çubuğu:. 1 mm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54105/54105fig3.jpg" /> Şekil 3. KT98, A549, ve MDA-MB-435 mikroakışkan platformda tek hücreli izolasyon verimi. (A) uncaptured hücreleri uzak yıkandıktan sonra yakalama kuyularda yakalanan KT98, A549, ve MDA-MB-435 hücreleri Etkinliği . Hücrelerin yakalama verimi üç hücre tiplerinde 85,16% ile 67,80% oldu. (B) toplam kültür kuyularda tek hücre oranı (çizgi bar) KT98 ve MDA-MB-435 daha fazla,% 76, fakat A549 için 61.63% idi. (C) tek tek KT98 tek bir hücre için temsili görüntüsüklonal kültürü için büyük kültür-kuyulardan izole (hücre izci ile boyanmış kırmızı). Ölçek çubuğu: 300 mikron. KT98 hücre modelinde hücre işgal kültürü kuyularda (D) hücre sayısı. kültür kuyularının oranı, tek hücreli% 77.3 idi, hücre bulunmayan 16.31%, iki hücre, ve en fazla üç hücreleri ile% 0,43 ile% 5.96. Hata çubukları ± SD olarak temsil edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54105/54105fig4.jpg" /> Şekil 4. Hücre kültürü, klonojenik analiz, ve 7 gün için mikroakışkan platformda izole A549 hücrelerinin hücresel heterojenlik çalışması. (A), izole edilmiş bir tek hücre büyüme ve Kültür oyuklu bir hücre kolonisi için çoğalmıştır. (B) bir izole tek hücreli 7 gün sonra, hayatta, ama bölmek vermedikültür. Ölçek çubuğu: 100 mikron. (C) 7 gün boyunca kültüre edildikten sonra heterojen büyüme modelleri sergilendi izole tek hücre. Hata çubukları ± SD olarak temsil edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture at JoVE.com

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Görüntüleme.  National Health Research Institutes, Taiwan. Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture. 

Video: A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Biyomühendislik

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient disease since CTCs are rare and heterogeneous. CTCs are detached from the primary tumor, enter the blood circulation system, and potentially grow at distant sites, thus metastasizing the tumor. Since CTCs carry similar information to the primary tumor, CTC isolation and subsequent characterization can be critical in monitoring and diagnosing cancer. The enumeration, affinity modification, and clinical immunofluorescence staining of rare CTCs are powerful methods for CTC isolation because they provide the necessary elements with high sensitivity. Microfluidic chips offer a liquid biopsy method that is free of any pain for the patients. In this work, we present a list of protocols for clinical microfluidic chips, a versatile CTC isolating platform, that incorporate a set of functionalities and services required for CTC separation, analysis, and early diagnosis, thus facilitating biomolecular analysis and cancer treatment. The program includes rare tumor cell counting, clinical patient blood preprocessing, which includes red blood cell lysis, and the isolation and recognition of CTCs in situ on microfluidic chips. The program allows the precise enumeration of tumor cells or CTCs. Additionally, the program includes a tool that incorporates CTC isolation with versatile microfluidic chips and immunofluorescence identification in situ on the chips, followed by biomolecular analysis.

The clinical microfluidic chip is an important biomedical analysis technique that simplifies clinical patient blood sample preprocessing and immunofluorescently stains circulating tumor cells (CTCs) in situ on the chip, allowing the rapid detection and identification of a single CTC.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Automated and High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking Using The Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors are hindered by cumbersome procedures and low throughput, impeding the rapid progress of microbial culturomics research. To address these challenges, we had successfully developed the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell), an automated high-throughput platform that utilizes droplet microfluidic technology for microbial monoclonal isolation, cultivation, and screening. This system can generate a large number of single-cell droplets and cultivate, screen, and collect monoclonal colonies in a short time, facilitating an integrated process from microbial isolation to picking. In this protocol, we demonstrated its application using the isolation and cultivation of human gut microbiota as an example and compared the microbial isolation efficiency, monoclonal culture performance, and screening throughput using the solid-plate culture method. The experimental workflow was simple, and reagent consumption was very low. Compared to solid-plate culture methods, the MISS cell could cultivate a greater diversity of gut microbiota species, offering significant potential and value for microbial culturomics research.

This protocol describes how to use the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) to perform microbial monoclonal isolation, cultivation, and picking. The MISS cell achieves an integrated workflow based on droplet microfluidic technology, which offers excellent droplet monodispersity, high parallel cultivation, and high-throughput biomass detection.

Tek Hücreli Mikrolitre Damlacık Kültürü Omik Sistemini Kullanarak Otomatik ve Yüksek Verimli Mikrobiyal Monoklonal Yetiştirme ve Toplama

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors ...