This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

注：私達のマイクロ流体デバイス製造用のフォトマスクの設計は、コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して描かれました。設計は、その後の商業サービスを使用してクロムフォトマスクを作製するために利用されました。 PDMSデバイスは、ソフトリソグラフィ技術を用いて製造した。11 リソグラフィによりマスター金型の1製作<ol><li>フォトリソグラフィ工程12の前に、基質として4インチのシリコンウエハを使用し、10分間120℃で、従来のオーブン内でウェーハを脱水します。 </li><li>プラズマクリーナーで30秒間、100ワットで酸素プラズマ処理を使用して脱水したシリコンウェーハをクリーニング。 </li><li>次の焼成工程のために、それぞれ65℃、95℃、2つのホットプレートを予熱。 </li><li>スピンコーターを用いて洗浄されたシリコンウェハ上にネガ型フォトレジスト（PR）のコート5 gであり30秒間1,200rpmで（SU-8 50）における回転は、マイクロチャネル層を作製しました。 </li><li> PRを配置12分間65℃で予熱したホットプレート上のウエハをコーティングし、ソフトベーク処理を行う（厚さ100μmのパターンについて）33分間、95℃でさらに予熱したホットプレートに移します。 </li><li>焼成後、半自動マスクアライナのホルダーにPRコーティングされたシリコンウェハを配置し、25400 dpiの解像度透明度のフォトマスクに合わせます。 </li><li>シリコンウェハ上のフォトレジストパターンを作成するために500ミリジュール/ cm 2の線量でUV光（365 nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを露出させます。 </li><li>アライナからウエハを取り外し、12分間95℃でポストベーク用のホットプレートの上に置きます。 </li><li>アライメントマークを露出させるために12分間、窒素ガスを穏やかに乾燥するための未架橋PRを洗浄するためにSU-8現像液（プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、PGMEA）溶液中にウェーハを浸します。 </li><li>再び、スピンコーターによりウェハ上のネガ型フォトレジストのコート5グラム。 300＆30秒30秒、1,200rpmで（SU-8 10）のために700回転（SU-8 100）におけるスピン＃181;メートルの厚さのパターンと27ミクロンの厚さのパターンは、それぞれのマイクロウェル層を作製しました。 </li><li> （27ミクロンの深キャプチャウェル層のための）8分間、4分間65℃でホットプレート上で95℃でPR塗布されたウエハを配置。そして40分間65℃と（300μmの深い文化ウェル層用）110分間95℃で。 </li><li>冷却した後、UV光を備えたマスクアライナ上にPRコーティングされたシリコンウェハを置きます。 </li><li> （27ミクロンの厚さのパターン用）を250mJ / cm 2であり、（厚さ300μmのパターン用）700ミリジュール/ cm 2の線量でUV光（365nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを公開します。 </li><li>それぞれ5分（27μmの厚さのパターン）、30分（厚さ300μmのパターン）、95℃でのウェハ焼きます。 </li><li>それぞれ、6分（27μmの厚さのパターン）のためにPGMEAおよび25分（厚さ300μmのパターン）により未架橋PRを洗い流し、その後、窒素ガスでそれらを乾燥させます。 </li><li>パターンの高さを測定上の特徴走査型レーザプロフィルメータのXYステージ上にウエハを配置することによって走査レーザープロフィルを有するウェーハ。 <ol><li>焦点面を調整し、明らかにパターンが20X対物レンズの下に「カメラビュー」観察モードを使用することにより、ウエハ上に備えて表示します。 </li><li> 「レーザービュー」に「カメラビュー」から観察モードを切り替えて、特徴の上下位置を設定します。 </li><li>それぞれの測定モード、エリア、品質、および透明（上部）までのz-ピッチ、1ライン（1024×1）、高精度かつ0.5μmで、設定し、測定を開始するスタート底を押してください。 </li></ol></li></ol>単一細胞の単離のためのPDMSデバイスの作製<ol><li> PDMS鋳造する前に、それが簡単にマスターモールドからPDMSのレプリカをはがしすることができ、疎水性​​の表面を、作成するために、トリクロロシランとマスター金型をsilanize。 <ol><li>マスター金型と重み入りのボートを配置200デシケーター中のトリクロロシランのμlの、そして15分間真空（-85キロパスカル）を適用します。 </li><li>真空を停止し、その後、少なくとも1時間室温でマスター金型をsilanizeデシケーターでマスター金型を残します。 </li><li>デシケーターからマスターモールドを取り外し、10センチメートルペトリ皿に各マスターモールドを配置します。 </li></ol></li><li> 10の割合で塩基及び硬化剤を含有する17.6グラムのPDMSポリマーキットの総量ミックス：1、次いでペトリ皿にマスターモールド上にPDMSを注ぎます。 </li><li>デシケーター中でペトリ皿を置き、PDMS中の気泡を除去するために、1時間真空（-85キロパスカル）を適用します。 </li><li>デシケーターからペトリ皿を取り外し、3、65℃で通常のオーブンに入れてください - PDMSを硬化させるために6時間。 </li><li>マスター金型から硬化PDMSのレプリカを削除し、0の内径とパンチャーによって捕獲ウェルアレイPDMSのレプリカでマイクロチャネルの両端に入口と出口のように2つの穴をパンチ。流体チャネル（ 図2A）のための75ミリメートル。 </li><li> PDMSレプリカの表面をきれいにしてから、短時間の酸素プラズマ処理（14秒間100ワット）のためのプラズマクリーナーにPDMSのレプリカを配置するためにテープを使用してください。 </li><li>酸素プラズママシンからPDMSのレプリカを削除します。 </li><li>実体顕微鏡下で手で（キャプチャマイクロウェルを含む）上部と下部のPDMS（培養マイクロウェルを含む）レプリカを合わせ、接触にそれらをもたらします。 </li><li>最終的なデバイスを形成するために、PDMSレプリカとの間の永久的な結合を達成するために24時間65℃のオーブンに整列PDMSレプリカを置きます。 </li><li> PDMSデバイスのマイクロ流路から空気を除去するために15分間（-85キロパスカル）を、脱イオン（DI）でPDMSデバイスを浸し - 水充填された容器と、真空下でデシケーター中でコンテナを配置します。 </li><li>組織培養フードにDI水で満たされたPDMSデバイスを配置し、UV光（光の波長：254 nm）を使用して30マイルのためにデバイスを滅菌しますn個。 </li><li> 1×PBS溶液中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）とPDMS装置にDI水を交換し、PDMSの表面に付着する細胞を防ぐために、37℃で30分間インキュベートします。 注：BSAコーティングは、培養ウェルにキャプチャーウェルから単離された細胞の転送効率を向上することが重要です。 </li><li>滅菌1×PBS溶液でPDMSデバイス中の5％BSA溶液を交換してください。 </li></ol>単一細胞懸濁液の調製<ol><li>培養神経細胞のKT98、およびヒト癌細胞A549およびMDA-MB-435、我々幹PDMSデバイス細胞実験のために細胞を調製するための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、95％湿度）でペトリ皿中。 </li><li> 80％のコンフルエンス - 70まで増殖させた細胞で培養皿から除去し、廃棄する使用済みの培養培地（10％ウシ胎児血清および1％抗生物質を与えDMEM基礎培地）。 </li><li>静かに滅菌PBSで3回細胞を洗浄します。&lt;/李&gt; <li> （詳しい情報については、物質一覧をご参照ください）​​を取り外し、PBSを捨て、およびタンパク質分解、コラーゲン、およびDNアーゼ活性を有する組換え酵素混合物の2ミリリットルを追加します。 </li><li> 5分間、室温で培養皿をインキュベートし、その後細胞の剥離を容易にするために培養皿をタップします。 </li><li>細胞を分散させるために滅菌PBSの4ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を転送します。 </li><li> 3分間300×gでチューブを遠心し、上清を除去します。 </li><li>静かにPBS滅菌1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁し、標準的なトリパンブルー排除法13を用いて、生細胞数をカウントします。 注：この再懸濁手順は、単一細胞分離効率を向上させるために十分に解離し、単一細胞懸濁液を調製するのに重要です。 </li></ol> 4.単一細胞の単離およびクローン培養<ol><li> 2.5×10 - 2.2の濃度の負荷50μlの細胞懸濁液を<suハンドヘルドピペットで装置の出口孔を介して、PDMSデバイスのマイクロチャネルにP&gt; 6細胞/ ml。 注：細胞懸濁液をローディングピペットをマイクロチャネル内に気泡を導入することを避けるために停止し、最初の停止位置に保持する必要があります。 </li><li>均等に細胞と全体のマイクロチャネルを埋めるために、入口孔を通して細胞懸濁液の別の50μLをロードします。 </li><li>入口と出口の穴上の液滴からの静水圧によって誘発される流れを回避するために、プラグ（長い3ミリメートル、直径1mmカットナイロン釣り糸）と出口穴を塞ぎます。 注：プラグは使用前に、組織培養フードの内部に滅菌UVました。 </li><li> 、培地で1ミリリットルの無菌注射器を埋めることから気泡を排出し、シリンジポンプにそれを設定。 </li><li> 23 G鈍針とポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブを経由してPDMSデバイスの入口孔への媒体ロード注射器を接続します。 </li><li>コンセントの穴からプラグを外し、すべてのOW 2分間の時間間隔は、細胞が重力によって単一細胞捕捉ウェルに落ち着くことを可能にします。 </li><li>シリンジポンプによって駆動を600μl/分の流速で培地300μlで捕捉されていない細胞を洗い流します。 </li><li>デバイスを安定させるために2分間待って、閉じた培養システムを形成するためのプラグと、入口と出口の穴をシールします。 </li><li>培養マイクロウェルに捕捉され、単一細胞を転送するために、手でデバイスを反転します。 </li><li> 100-mm組織培養皿にPDMSデバイスを配置し、マイクロチャネルからの培養培地の蒸発を避けるために、デバイスの周りに滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>単一細胞のクローン培養物のための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、95％湿度）で培養皿を動かします。 </li></ol> 5.培養培地補充<ol><li>培養の1日後、細胞PRを改善するために、新鮮な培地でPDMSデバイスに培地を交換しoliferation。 </li><li>次のステップを実行している間、マイクロチャネル内に気泡を導入することを避けるために、入口および出口孔領域の近くにPDMS装置の上に培地二の液滴を置き。 </li><li>入口とマイクロチャネルのための出口としてマイクロ流路の両端近くにPDMSデバイスの上から2穴パンチ。 注：PDMSデバイスの全体的な二層パンチスルーしないでください。代わりに、ちょうどPDMSの最上部層を介してパンチ。 </li><li> 23 G鈍針とPTFEチューブを経由して入口に新鮮な培地を含有する1ミリリットルのプラスチックシリンジを接続します。 </li><li>古い培地を交換するために5分間のデバイスに120μlの新鮮な培地を流します。 </li><li>入口と出口の穴を密閉し、細胞培養インキュベーターにデバイスを戻すために2つのプラグを挿入します。 </li><li> 5.5に手順5.4を繰り返し、続いて、シールプラグを、除去することにより、培養期間中に培地ごとに2日間を更新します。 </li></ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture.">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

マイクロウェルベースのデバイスシステム6,14は 、6を捕捉する大型単セル及び単一造血幹細胞の増殖を15として、単一細胞操作及び分析のために利用されています。ウェルのサイズ、数、及び形状は、特定の用途のために調整可能であるがウェルのサイズを大きくすると、単一細胞分離効率が常に損なわれる。9,15 マイクロサイズは細胞拡散と成長を可能にするために拡大している間に、この制限を克服するために、パークらは 、高単一細胞捕捉率（58.34パーセント）を持つ三角形のマイクロウェルを持つマイクロ流体チップを報告しました。ただし、（サイド〜50μmの長さ）マイクロウェルは最大2日間細胞の増殖をサポートすることができました。16私たちのデュアルウェル戦略は、大規模なマイクロウェル内の単一セルの負荷はポアソン確率によって限定されるものではないことができますDILUを制限する際に遭遇分布ション方法とサイズ、少なくとも7日間（ 図4A）のために、細胞増殖のために十分であった大規模なマイクロウェルの高い単一細胞分離効率（75％以上）を提供することによって実証されるように、オープンウェルシステム3、。高効率簡単な装置と操作手順で、単一細胞の単離およびクローン培養を実行する能力のために、我々は、マイクロ流体プラットフォームは、クローン原性アッセイ17によって、がん幹細胞の選択など、幅広いアプリケーションのための便利なツールを、構成することができることを想像します薬18,19及びハイスループット心毒性スクリーニング。 我々の単一細胞の単離および培養プラットフォームの主要な制限は、培養ウェルで培養した細胞間のクロストークを防止するために、個別に閉じた培養ウェルを形成しないことです。したがって、細胞の挙動は、マイクロ流体デバイス内の他の単離された単一細胞のパラクリン分泌によって影響され得ます。オト我々のプラットフォームの彼女の制限は、高効率単一細胞単離のために、比較的高濃度の細胞懸濁液を調製する必要があることです。この高いセルの消費量は、房水の細胞などの希少細胞の単離と文化の用途を制限することができます。 デバイス操作の前に、マイクロチャネルを充填し、慎重に結合PDMSデバイスから任意の流体の漏れを観察するために、入口孔からDI水を噴射することが重要です。流体漏れが悪影響細胞捕捉と転送結果に影響を与える可能性があり、したがって、マイクロチャネル内の流れの状態に影響を与えます。私たちの単一セルの積載効率の研究結果は、デバイスをひっくり返すことで、ほとんどの細胞が効率的に転送することができたことを示す、培養ウェルへの捕獲ウェルから単離された細胞を転写した後、非常に低いセル損失を示しているがまた、転写効率は、次の場合に低下しますBSAブロッキング工程（2.12）が適切に行われていません。ユーザーは、BSAブロッキングプロトコルを変更したり、アルを使用してもよいですそれらの特異的な細胞実験のニーズにternative表面改質方法は、（ 例えば 、より多くの接着細胞タイプが使用されるBSAの濃度や塗布時間を増加させます）。細胞捕捉ウェルの寸法は、関心対象の特定の細胞型のサイズに応じて、捕捉ウェルで最高の単セルの負荷効率を最適化する必要が支配的な要因です。キャプチャウェル中の低細胞積載効率がキャプチャの大きさの指標で幸福であるのに対し高い複数のセル・イン・キャプチャウェルイベントは、目的の細胞型には大きすぎるキャプチャウェルサイズを有することに起因しています小さすぎる。細胞クラスターを捕捉ウェルに単細胞ローディングの効率を低下させることができるように、準備された単一細胞懸濁液中の細胞塊を最小化するためにも重要です。

現在、培養空間内に個別に単一細胞を配置することは、一般に、限界希釈または蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用することによって達成されます。それだけで容易に入手可能であるピペット組織培養プレートを、必要とする多くの研究室は、希釈を制限することは、便利な方法です。この場合には、細胞懸濁液を直列適切な細胞密度に希釈し、その後手動のピペットを使用して培養ウェルに入れました。これらの区画の単一の細胞は、次いで、1コロニー形成2のスクリーニング遺伝的異質性として、細胞分析のために使用されます。限界希釈法のポアソン分布の性質は37％3の最大確率に単一細胞事象を制限するため、この方法は、支援のためにロボットアームを利用することなく、低スループット、労働集約的です。統合されたロボットアームとFACSマシンは正確にPLACによってポアソン分布の限界を克服することができます時間4で培養ウェル内の1つの単一細胞をる。しかし、高い機械的剪断応力5（従って、細胞生存率を低下させ）、機械購入および運用コストは、多くの研究室での使用が制限されています。 上記の制限を克服するために、マイクロスケールデバイスは、高効率マイクロウェル6に単一細胞をロードするために開発されてきました。しかし、マイクロウェルは、ロードされた細胞が原因で、単一セルの負荷の確率を最大化するために単一のセルのそれに近いマイクロウェルそれぞれのサイズを作る必要があるため、増殖するために十分なスペースを提供していません。培養アッセイは、多くの細胞ベースのアプリケーション（ 例えば、クローン原性アッセイ7）で必要とされるように、（90から-直径又は一辺の長さ650ミクロン）より大きいマイクロウェルは、拡張、細胞培養を可能にするために利用されています。しかし、限界希釈法のように、彼らはまた、10に至るまで、低い単セル負荷効率を有している- 。30％8、9 以前、我々は個々のマイクロウェル内の単一細胞を単離し、単離された細胞のクローン原性アッセイにおけるその適用を実証するためにハイスループットマイクロ流体プラットフォームを開発しました。10デバイスは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）で作られた、およびマイクロウェルアレイの2組を備えました主としてそのサイズのマイクロウェルに1つのセルを負荷の効率を向上させることができる別のマイクロウェルのサイズと細胞よりも有意に大きいです。注目すべきことに、この「二重井戸」の概念は、培養領域の大きさを柔軟それは簡単な異なる細胞型およびアプリケーションに合わせて装置の設計を調整すること、単一細胞捕獲効率に影響を与えることなく調整することができます。この高効率の方法は、細胞の不均一性の研究およびモノクローナル細胞株の確立のための長期の細胞培養実験のために有用です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1323">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">AutoCAD software</td>
			<td style="width:225px;">Autodesk</td>
			<td style="width:235px;">AutoCAD LT 2011</td>
			<td style="width:463px;">Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon wafer&#160;</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td style="width:235px;">SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td style="width:235px;">ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td style="width:235px;">AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 50 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131269</td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 100 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanning laser profilometer</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>VK-X 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td style="width:463px;">TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL.&#160; Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products&#160;</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>with 0.75 mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bersing Technology</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Hyclone</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant enzyme mixture</td>
			<td>Innovative cell technology</td>
			<td style="width:235px;">AM-105</td>
			<td>Accumax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:235px;">354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:235px;">703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic syringe (1 mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:235px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">23 gauge blunt needles</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td style="width:235px;">TD21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td style="width:235px;">TFT-23T</td>
			<td>&#160;inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for high-throughput single-cell isolation and culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

単一細胞の単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォームは、マイクロウェルアレイ（ 図2A）の2組のマイクロチャネル（高さ200μm）を備えています。マイクロウェルアレイの2セットは、キャプチャウェル（直径25ミクロン、深さ27μm）とし、それぞれ単一細胞の単離および培養用の培養ウェル（直径285ミクロン、深さ300μm）であり、それぞれと呼ばれています上面図（ 図2B）から見たときに捕捉ウェル培養ウェルの中央に位置しています。デバイス動作について（概略動作フローを図1に示されている）、必要な装置（シリンジポンプ、組織培養インキュベーター、および顕微鏡）や消耗品（シリンジ、ピペット、およびチューブ）は、生物学的実験室で一般に入手可能です。また、プラットフォームの移植性及び透明性は、細胞が容易にConvenとを備えた装置で観察し、分析することが許さ細胞培養実験中的な顕微鏡。 洗浄工程の後にキャプチャ・ウェル中の細胞の捕獲効率は67.80±11.38パーセントから（細胞の種類に応じて）85.16±1.91パーセント（ 図3A）の範囲です。文化ウェルにロードされた細胞（ 図3B）の数を分析することによって確認された、 -また、キャプチャウェルのほとんどは、すべての3つの細胞型（92.98パーセント89.89パーセント）のための単一のセルのみが含まれています。培養ウェル中の最終の単セル分離効率がKT98およびMDA-MB-435細胞のために76％以上であったが、試験した細胞型のうち、セルサイズの違いに起因するA549細胞についてのみ61％。 がん研究のために、単一細胞のクローン原性アッセイは、薬物耐性及び個々の細胞コロニーの増殖速度をテストするために利用することができます。私たちのpにおける単離単一細胞の細胞培養およびクローン原性アッセイlatformを培地ごとに2日間をリフレッシュすることによって行いました。このデモでは、個々の細胞の細胞生存および増殖速度の差を測定することによって、単一細胞レベルでの細胞の不均質性を研究するため、このデバイスの適用性を強調しています。 単離された細胞の細胞異質と増殖率がdaily-取得した画像から解析しました。結果は、単離された単一細胞を7日間培養し、異なる成長パターンを発揮することができることを示しました。細胞の17.5％が15以上の細胞培養の間に形成された細胞コロニー（ 図4A）に分割しているが、例えば、単離された細胞の13％には、細胞分裂がなく、1つの単一細胞（ 図4B）として残りました。 14細胞 - 増殖細胞間の細胞の不均一性は、2つの細胞（4.3％）、三つのセル（2.5％）、及び4を形成し、それらの異なる成長パターンによって証明されました細胞培養実験（ 図4C）で（15％）。 これらの結果は、プラットフォームは、長期細胞培養、クローン原性アッセイ、及び細胞の異質性研究のために使用することができることを示しました。小さな設置面積で成長した個々の細胞コロニーの数が大きくても、また、細胞の顕微鏡分析が容易になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig1.jpg" /> マイクロ流体プラットフォームでのハイスループット単一細胞の単離および培養のための動作フロー図1.模式図単一細胞の単離およびクローン培養するための操作手順は、4ステップを含む：プラスチックチップによってマイクロチャネルにⅰ）ロードセルをと手動ピペット; II）シリンジポンプによって駆動される、新鮮な培養培地で捕捉されていない細胞を洗い流します。 III）プラグを入口および出口開口部を密封した後に、ありますolated細胞は、デバイスを反転することによって、培養ウェルへのキャプチャウェルから移しました。およびiv）培養ウェル中のクローン培養（クローン原性アッセイ）を行う。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig2.jpg" /> 図2. 写真およびマイクロ流体単一細胞の単離と文化プラットフォームのSEM像。（A）単一細胞培養のためのマイクロチャネルおよびマイクロ構造を示している赤い色素でロードされたマイクロ流体プラットフォーム。 （B）切断デバイスから採取代表画像は、マイクロ流体プラットホームにおける3つの単一細胞の単離およびクローン培養装置の側面図を示します。スケールバー：100μmです。単一細胞培養のSEM画像（C）およびD（キャプチャー</strong&gt;）は、異なるサイズの構造（マイクロウェル）。マイクロウェルのサイズは、特定の細胞タイプおよび培養戦略を調整することができます。スケールバー：1ミリメートル<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig3.jpg" /> 図3 KT98、A549およびMDA-MB-435、マイクロ流体プラットホームにおける単一細胞分離効率（A）捕捉されていない細胞を洗い流した後、捕捉ウェルに捕捉KT98、A549およびMDA-MB-435細胞の効率。細胞の捕捉効率は3つの細胞型で67.80重量％から85.16％でした。 （B）の合計文化ウェル（スラッシュバー）における単一細胞比はKT98およびMDA-MB-435用の76％以上が、A549のための61.63パーセントでした。 （C）個々のKT98シングルセルの代表画像クローン培養用の大型培養ウェルで単離された（セルトラッカーで染色した赤、）。スケールバー：300μmの。 （D）KT98セルモデルのセル占有培養ウェル中の細胞数。文化ウェルの割合は、単一細胞で77.3パーセント、16.31パーセント細胞なしで、2細胞と5.96パーセント、以上3細胞と0.43パーセントでした。エラーバーは平均値±SDとして表されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig4.jpg" /> 図4.細胞培養、クローン原性アッセイ、および7日間のマイクロ流体プラットフォームで孤立したA549細胞の細胞異質の研究。（A） は 、単離された単一細胞が成長し、培養ウェルに細胞コロニーに増殖しました。 （B）、単離された単一細胞は、7日後、生き残ったが、分裂していませんでした文化の。スケールバー：100μmです。 （C）、単離された単一細胞は、7日間培養した後、不均質な成長パターンを示しました。エラーバーは平均値±SDとして表されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54105/54105fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K ビュー.  National Health Research Institutes, Taiwan. Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture. 

ビデオ: A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

生物工学

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

ハイスループットマイクロ流体の迅速かつ低コストのプロトタイピング包装方法

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...