Bu çalışma NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH predoctoral Eğitim Hibe 5T32GM007127 (PAE), ve bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (NAE) tarafından kısmen finanse edildi. Biz enjeksiyon protokolüne yararlı geribildirim için CRISPR Sanger sıralama verilerinin üretilmesi için BAC Recombineering ve enjeksiyonlar, Nick Donde gerçekleştirmek için Kevin Schwalbach teşekkür ve Katherine Lipari.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

transgenesis ya da genom düzenleme için enjekte tek hücreli dikenli embriyolar üç ana zorluklar getirmektedir. İlk olarak, Zebra balığı embriyolarının göre, dikenli embriyonik koryon sert ve sık sık iğne kıracak. Bu sorun kısmen kalın ve güçlü cam mikropipetler kullanarak ve koryon dik enjekte edilerek aşılabilir (Protokolü, bakınız Şekil 2). Mümkün olduğunca az su sağlanması embriyoların eklenir (yeterli koryon şişer ve uzak hücreden kaldırmak için neden) koryon sertliği azaltmaya yardımcı olur. koryon zamanla sertleşir, bu nedenle embriyo nemlendirme sonra hızla çalışan önemlidir. kurumasını böylece enjeksiyondan önce bir nem odası embriyolar tutulması da önemlidir. Bazı kavramalar ve hatta bireysel embriyolar sadece çok kalın ve sert chorions var; bazen bir sonraki embriyo geçmeden veya yeni bir kavrama ile çalışıyor en kolay çözümdür. Bir d atlamak için çok daha kolaydır<html> Hasarlı bir iğne yerine daha ifficult embriyo. hazır yedekleme iğnelere sahip enjeksiyonlar iğne kırılması halinde devam sağlayacaktır. BAC&#39;ler enjekte iğne tıkayabilir için, bu yaygındır. İğne veya yapışmasına neden temizlemek için sabit hava basıncı anahtarını kullanarak hafifçe kazıma veya forseps ile ucu yeniden kırarak unclogged edilebilir. İkincisi, embriyo ilk hücre belirlenmesi zordur; genellikle oldukça basık ve zor başlayanlar görmek için, ve ona doğrudan bakıldığında özellikle görünmez. Genellikle blastomere sadece profilinde biraz yükseltilmiş yumru olarak görülebilir. Bu nedenle, (Şekil 3B) profilinde hücreyi tespit etmek en iyisidir ve daha sonra yavaşça ileri embriyo döndürmek ve hücre genellikle bu açıdan görünmez olacak ama yan böylece hücre (açılı iğnenin ucunu karşı karşıya gelecek; Şekil 3&#39;te blastomer karanlık renk) netliği için abartılı. e_content &quot;&gt; Üçüncü olarak, sitoplazma hedefleyen ilk hücre, özellikle düz, özellikle de zordur. sitoplazma yakın sarısı içine enjekte ederken blastomer (genellikle merkezi) şişman bölümü için hedefleyen. sitoplazmaya enjekte şansını artırır başarıyla transgenik balık üretebilir, verimlilik artışı gibi görünüyor ve öldürücü sitoplazma tek iğne ile hedeflenen zaman azalmıştır. Bazen bireysel debriyaj sarısı kaçınarak neredeyse imkansız olacak şekilde, özellikle ince blastomerlerdir sahip olacaktır. Bekleyen uzun 25 dakika daha enjeksiyonlar (bazı kavramalar tam boy blastomer ~ 45 dakika sonrası döllenme kadar oluşturmayan), ancak blastomer boyutu artırmak asla eğer yardımcı olabilir başlamak için, o basık hücreleri enjekte etmek için denemek için daha yumurta yeni bir debriyaj elde etmek çoğu zaman kolay . Aşırı öldürücü aşağıdaki enjeksiyonları çeşitli nedenlerle oluşabilir. Künt iğne ve / veya çok büyük bir iğne deliği boyutu neden olabilir too hücre ve / veya neden sitoplazmaya kadar zarar sızmasına. Bazı DNA yapıları, özellikle ölümcül görünmektedir; DNA konsantrasyonu düşürücü hayatta ama daha düşük transgenesis oranlarını artırabilir. ikinci bir PCR temizleme kiti tarafından izlenen bir endotoksin durulama içeren bir midiprep kiti ile ilk plazmidler temizleniyor toksisitesini inşa azaltır. Son olarak, genom düzenleme embriyolar geliştirmek için öldürücü olan fonksiyon mutasyon kaybı üretebilir. CRISPR veya TALEN mRNA konsantrasyonunun azaltılması ölümleri önlediği embriyonun Mozaiklik artırabilir, ancak mutant alel kurtarma etkinliğini azaltabilir. Bir meganuclease yöntemi 21 kullanılarak transgenik Sticklebacks üretmek için bir protokol daha önce yayınlanmış F 0 kurucu balık bir% 4-7 transgen germ iletim hızını bildirdi. Burada bildirilen Tol2 yöntemi F 0 kurucu balık% 72 transgen germ iletim hızı kadar (birden genomik bütünleşik belirten sonuçlandıiyonlar). Bir meganuclease yöntemi kullanarak önceki çalışma burada bildirilen benzer özel GFP ifade gösteren enjekte edilen embriyoların% 40 bildirmişlerdir. Transgenik F 0 kurucularından benzer oranlar meganuclease ve Tol2 yöntemlerle hem tarafından oluşturulan transgenik balık gözlenir Böylece, germ iletim hızı Tol2 aracılı transgenik için çok daha yüksek görünmektedir. genom düzenleme teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe, daha da spesifik genetik manipülasyonlar dikenli balıkgil ve diğer balık türlerinin mümkün hale gelecektir. Örneğin, yönetmenliğini onarım 46 ve homolog rekombinasyon deniz ve tatlı su dikenli genomları ve modifiye CRISPRs arasında alel swapları özellikle kullanılan etkinleştirmek veya gen ifadesini 47 inhibe olabilir sağlayacaktır. genom düzenleme ve analiz için bu heyecan verici teknolojiler birçok ilginç morfolojik, fizyolojik genetik temeli konusunda yeni anlayışlar ve STIC davranışsal fenotipleri yol açacaktırklebacks ve diğer balık türleri.

biyoçeşitlilik doğada evrimleşmiş fenotipik değişikliklerin genetik ve gelişimsel üsleri belirlemektir nasıl ortaya çıktığını anlamak biri temel bileşeni. Threespine dikenli balık, Gasterosteus aculeatus evrim genetik temeli çalışmak için mükemmel bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sticklebacks deniz balıkları kuzey yarımkürede etrafında sayısız tatlı su ortamları kolonize gibi dramatik morfolojik, fizyolojik sonuçlanan birçok adaptif evrimsel değişikliklere uğramıştır, ve var davranış değişiklikleri 1. Yirmi bir dikenli popülasyonlardan bireylerin genomları dizilenmiş ve birleştirilmiş ve yüksek yoğunluklu bir bağlantı harita daha düzeneğinin 2,3 geliştirmek için oluşturulduktan edilmiştir. Genetik haritalama deneyleri gelişti fenotipler, bazan 4 yatan genomik bölgeleri belirledik - 6 ve bazı durumlarda, belirli aday genlerin fonksiyonel rolleri 7,8 sınanmıştır. Morfolojik değişikliklerin altında yatan genomik bölgelerin bir dizi vaat aday genler ile tespit edilmiştir, ancak bu adaylar henüz işlevsel 9 test edilmemiştir - 12. Buna ek olarak, Sticklebacks populasyon genetiği / genomik 13,14, türleşme 15, davranış 1, endokrinoloji 16, ekotoksikoloji 17, immünoloji 18 ve Parazitoloji 19 çalışmaları için ortak modellerdir. Bu alanların her birinde gelecek çalışmalar Sticklebacks fonksiyonel genetik manipülasyonlar yapmak için yetenek yararlanacaktır. Kendi kodlama dizileri manipüle ek olarak, bir aday genin rol cis -regulatory dizileri inceleyerek ve fonksiyonel olarak arttırmak, azaltmak ya da aday genin ifadesinin elimine ile değerlendirilebilir. Sticklebacks Mikroenjeksiyon ve transgenezi yöntemleri iyi 7,8,20 oluşturulmuş ve ilk kullanılarak geliştirilmiştir bir meganuclease aracılıyöntem, 21, birinci Medaka 22&#39;de tarif. Burada yer alan değiştirilmiş mikroenjeksiyon yöntemi hem Tol2 aracılı genetik dönüştürme için optimize edilmiş ve en son TALENS ve CRISPRs içeren genom düzenleme reaktifleri geliştirilmiştir. Cis -regulatory elemanlara değişiklikler cis -regulatory değişiklikler mutasyonlar 23 kodlama olumsuz pleiotropik sonuçları önlemek gibi, morfolojik evrimi kritik olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, varsayılan sis -regulatory dizileri test ve karşılaştırma evrim çalışmalarında artan sayıda merkezi hedefi haline gelmiştir. Buna ek olarak, çoğu insan hastalık varyantları şiddetle sis -regulatory eleman fonksiyonu ve mantık incelemek için gerekli olan düzenleyici varyantları 24,25 ve model omurgalı sistemleridir. Çok sayıda dışarıdan kendi embriyolar aşılamak balık sis -Yönetmeliği incelemek için güçlü omurgalı sistemleri sunuyoruz. forei burada Tol2 transpozon sistemi,genomuna entegre edilecek gn DNA Tol2 transposase siteleri ve bağlayıcı ile çevrili, Tol2 transposase mRNA ile işbirliği enjekte başarıyla plazmid balık genomları 26 içine yapıları entegre etmek için yüksek verimlilik ile çalışır - 28. Tipik olarak, potansiyel bir güçlendirici, bir Tol2 omurgada bir (örneğin hsp70l 29 gibi), bazal promotör ve flüoresan raportör gen gibi EGFP gibi (gelişmiş yeşil floresan protein) ya da mCherry akım-yukan klonlandı transposaz mRNA 26 enjekte edilir. floresan muhabiri, ya enjekte edilen embriyoların veya stabil entegre transgenlerin ile yavrularda ifade Gözlem, farazi arttırıcı tarafından yönlendirilen gen ifadesinin zamanmekansal yönetmelik hakkında bilgi sağlar. Diğer deneylerde de, geçerliliği arttırıcı ilgi genlerinin dokuya özel aşırı ekspresyonu tahrik etmek için kullanılabilir. Büyük sis -regulatory bölgelerin analizi, yüksek kalite geniş insert genomunabakteriyel yapay kromozom (BAC) ile ic kütüphaneleri hem deniz ve tatlı su Sticklebacks 30 inşa edilmiştir. Bu BAC&#39;ler büyük (150-200 kb) bağlamında bir flüoresan raportör geninin genomik bölge 31, bir gen yerine recombineered edilebilir. BAC olan düzenleyici diziler tarafından belirlenen flüoresan raportör sonra uzaysal model olarak ifade edilir. Balık çalışmaları için, Tol2 siteleri genomik entegrasyon 32,33 kolaylaştırmak için BAC eklenebilir. Gelişiminin sonraki evrelerinde in situ hibridizasyon teknik açıdan zor olarak, BAC floresan okuyucu dikenli kemik morfogenetik protein 6 (Bmp6) 20 için gösterildiği gibi, gen ekspresyonu örüntüleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir bireyde, floresan ekspresyon modelleri, in situ hibridizasyon ile başarılı olamaz zaman üzerinde takip edilebilir. BAC&#39;ler, aynı zamanda bir additiona eklemek için kullanılabilirbir genomik bölgenin L kopya ilgi konusu bir genin dozajı artırmak. Gen fonksiyonunun çalışması için, genom düzenleme organizmaların 34 çeşitli genomik dizileri hedef alan değişiklikleri oluşturmak için kullanılabilecek bir patlayıcı genişleyen bir alandır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ilk olarak tam olarak tercih edilen bir genomik sekansa doğrudan bağlanan ve bir çift şerit 35,36 kırmak oluşturmak için tasarlanmış olabilir bitki patojenleri izole modüler, sekansa özel nükleazlar bulunmaktadır. Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CAS sistemleri ilk bakterilerde bulunan ve kılavuzun 37 tamamlayıcı bir hedef DNA dizisinin bir ara oluşturmak için bir kılavuz RNA ve Cas9 proteini kullanmak edildi. genellikle TALENS ve CRISPRs ile oluşturulan çift iplik kırılım onarımı sonraki hedef sekansın fonksiyonunu bozabilir küçük ekleme veya delesyon, geride bırakır35-37. Sticklebacks olarak, TALENS bir takviye 20 hedef gen ekspresyonunu bölmek için kullanılmaktadır ve TALENS ve CRISPRs iki başarılı dizileri (yayınlanmamış veriler) kodlayan mutasyonlar üretmişlerdir. Zebrabalıkları kullanılmak için CRISPRs üretimi için ayrıntılı bir protokol Sticklebacks 38 için CRISPRs geliştirmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir. Transjenik ve genom düzenleme deneyleri yeni döllenmiş tek hücre embriyoya nükleik asitlerin giriş gerektirir. erken gelişim transgen ya da genom-düzenleme aracı tanıştırarak, embriyo genetik manipüle kızı hücrelerin sayısı maksimize edilir. Enjekte embriyolar daha sonra görsel floresan için tarama ya da moleküler genom değişiklikleri için taranmaktadır. germline katkıda hücreler başarıyla hedef ise, transgen veya mutasyon enjeksiyon sonrası öldürücülüğü yüksek olsa bile, yavru bir alt kümesine geçebilir. mozaik balık outcrossed olabilir veyaintercrossed ve onların yavrularının mutant allel ya da ilgi kararlı biçimde entegre edilmiş transgen kurtarmak için gösterildi. Bu protokol, tek hücreli dikenli embriyolar transgenlerin ve genom düzenleme maddeleri eklemek ve başarılı genomik değişiklik izlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

threespine dikenli balık morfolojik, fizyolojik çeşitli genetik temelini incelemek için güçlü sistemi ve davranışsal fenotipleri olarak ortaya çıkmıştır. deniz ve tatlı su formlarını geçmeye yeteneği ile kombine deniz popülasyonları sayısız tatlı su ortamlarına adapte olarak geliştiğini oldukça farklı fenotipleri, genetik özellikleri gelişti kontrol edilmesi genomik bölgeleri eşleştirmek için kullanılabilecek nadir bir omurgalı sistem sağlar. Mükemmel genomik kaynakları gelişti değişikliklerin moleküler genetik diseksiyon kolaylaştırılması, artık mevcuttur. haritalama deneyleri ilginç aday genlerin listeleri oluşturmak iken, fonksiyonel genetik manipülasyonlar bu genlerin rolleri test etmek için gereklidir. Gen düzenlemesi Tol2 transposaz sistemi kullanılarak genomuna entegre transgenik raportör plazmid ve BACler ile incelenebilir. Belirli aday genler ve sis -regulatory elemanların fonksiyonları hedeflenen indükleyerek değerlendirilebilirTALEN ve CRISPR / Cas9 genom düzenleme reaktifleri ile mutasyonları. Tüm yöntemler, döllenmiş tek hücre dikenli embriyolar nükleik asitleri ilave gerektirir, bir görev dikenli embriyo kalın koryon ve nispeten küçük ve ince blastomere ile zor oldu. Burada, dikenli embriyolar nükleik asitlerin mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol transgenik ve genom düzenleme gen ekspresyonu ve fonksiyon çalışma uygulamaları yanı sıra, transgenesis başarısını değerlendirme ve kararlı çizgiler kurtarmak için teknikler tarif edilmiştir.

Güçlendirici etkiye sahip raportör gen transgenlerin için, başarılı bir enjeksiyon transgeni (Şekil 4A, 4C) spesifik hücresel ifadesi ile sonuçlanır. Enjekte balıklar sonra kararlı çizgiler (Şekil 4B&#39;de gösterilen bir BAC stabil hattı örneği) üretilmesi için çaprazlanırlar edilebilir. dikenli embriyolara DNA enjekte tipik olarak tek başına RNA çok daha yüksek öldürücülüğü sonuçlanır. Bu% 50&#39;ye varan görmek tipiktir (bazen daha fazla) öldürücülüğü veya malformasyon (Şekil 4D bkz - K, 4I) Tol2 muhabiri enjekte sonra (benzer daha önce tarif meganuclease yöntemine 21) oluşturur. Ancak sonuçlar yaygın özel yapı, embriyo morfolojisi ve beceri düzeyine bağlı olarak değişir. Etkin bir arttırıcı için, embriyoların% 40-50, genellikle (ortalama ve göğüs yüzgeçleri, örneğin F doku spesifik transgen ekspresyonunu gösterirŞEKIL 5). Arka plan ve spesifik olmayan floresan derecesi (Şekil 4G - I) yaygın olarak kullanılan promotör göre değişir; Zebra balığı hsp70l organizatörü özellikle kas ve sinir dokusunda, sızdıran olma eğilimindedir ve BAC (Şekil 4G benzer) sarısında yüksek arka plan ifadeye sahip olma eğilimindedir. Sazan beta aktin 41 organizatörü az sızdıran ama aynı zamanda oldukça sönük GFP sürücüler. Tol2 plazmid transgenlerin İletim GFP + F 0 balık üreten transgenik yavruları (Tablo 2) kadar% 100, yüksek olabilir. Ancak, transgen taşıyan yavruların yüzdesi arasında &lt;% 1% 72 (Tablo 2), büyük ölçüde değişmektedir. Sadece GFP + enjekte embriyolar kaydetme genellikle iletim verimliliğini artırır. BAC beklenen dokularda floresan gösteren F 0 enjekte dikenli embriyoların sadece% 10&#39;a kadar olan, çok daha düşük transgenesis fiyat bilgisi eğilimindedir. transBAC&#39;lerin görevin oranı zebrabalıkları 32% 15 bildirilen aktarım oranına benzerdir BAC (Tablo 2), iletme filtrelenmiş dikenli balıkgil olduğunda, en fazla% 14 olan, plasmid konstruktlarının daha düşüktür. BAC transgenesis nispeten düşük verimlilik aksine, filtrelenmiş balık tipik olarak% 70-100 TALENS enjekte (n = 10 lezyonlar için taranmıştır debriyajlar enjekte) mozaik lezyonlar vardır. Bu sayı, daha az verimli bir TALEN çifti ile daha düşük olabilir, ve enjeksiyon kalitesi ile değişebilir. 6 Talens Tfap2a içinde Pvull bir kesme yerine hedefleme enjekte tek kavrama 10 embriyo için bir PCR / sınırlama sindirimi göstermektedir. enjekte edilen embriyolar (kulvarlar 1-10) her biri bir kesilmemiş amplikon Her embriyo önemli bir vahşi tip kesme bant yüksek mozaik da her embriyo hücrelerinin bir kısmı, hedef lokusun lezyon taşıyan gösterir. thşerit 11-12 enjeksiyon yapılmamış embriyolar E amplikon tam PvuII ile sindirilir. TALEN indüklenen mutasyon kolaylıkla nesil iletilir. İki farklı TALEN setleri ile,% 50 ve ekranlı F 0 s% 90 pozitif kavramalar (Tablo 3) lezyon taşıyan yavruların 20-90 ile%, yavrular lezyonlar iletti. CRISPR / Cas9 verimliliği bir CRISPR kılavuz lezyonlar CRISPR hedefin PCR ürününün Sanger dizileme dayalı olan üç enjekte edilen embriyoların üzerinden PITX2, bir hedefleme ile, dikenli balıkgil optimize edilmemiş olsa da (kesilmemiş bant kısıtlama sindirim, Şekil aşağıdaki sıralandı 7). tahmin kesim yerinde dizisi kalite kaybı moleküler lezyonların karışımı mevcut gösterir. PCR ve restriksiyon sindirimi tahlili kullanılarak lezyonlarda fin kırpma yetişkin F 0 balık ve tarama fin somatik lezyonlar 10/22 balık bulundu. Bu hayvanların temsili bir alt kümesi, Şekil 8&#39;de gösterilmiştir &lt;/ Strong&gt;; Bireysel 2. lezyonları olan DNA&#39;nın düşük bir yüzde sahipken bireysel 3., lezyonları olan DNA yüksek oranda bulunmaktadır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig4.jpg" /> Şekil enjekte edilen embriyoların 4. örnekleri. 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) GFP pektoral (yıldız) ifadesini ve medyan yüzgeçleri (ok başı) süren bir arttırıcı enjekte (A) Mozaik embriyo. Ölçek çubuğu = 500 mikron. (B) 4 dpf&#39;e embriyonik kalp GFP ekspresyonu sağlayan bir muhabir BAC Kararlı hattı. 4 dpf&#39;e Notokordun içinde MCherry ifadesini sağlayan bir Col2a1a arttırıcı enjekte (C) Mozaik embriyo. Sütun2 a1a güçlendirici primerleri ile dikenli DNA&#39;sından klonlanmıştır Dale ve Topczewski bildirilen korunmuş ortolog arttırıcı amplifiye 5&#39;-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 &#39;ve 5&#39;-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3&#39;2011 Bir normal enjekte gelişen embriyonun 45. (D) Örnek. (E - F) enjeksiyon travma ile hatalı biçimlendirilmiş embriyoların örnekleri; E sol göz eksik ve F sağ tarafında (ok başları) boyunca nekrotik doku vardır. Sarısında yaygın GFP, yumurta sarısı yerine blastomere içine enjeksiyon olası sonucunun (g), Örnek. Epidermis (ok başı) spesifik olmayan GFP tanımının (H) Örnek. (I) Parlak, non-spesifik granül GFP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig5.jpg" /> Şekil 5. raportör yapı enjeksiyon Verimlilik. On kavramalar 190 bp dikenli Bmp6 arttırıcı konstrüksiyonlar enjekte edildi20 dpf 5 de göğüs yüzgeci ve medyan fin ifadesini tahrik UCT. Her bir kavrama olmak üzere, en az 20 embriyo dokuya özgü (Göğüs ve / veya mali medyan olarak) ve / veya spesifik olmayan (diğer tüm dokular) GFP tanımı sahip olması açısından değerlendirildi. spesifik olmayan ve dokuya özel bir ifade olan tüm enjekte kalan embriyoların yüzdesi Boxplot olarak gösterilir. Yatay çizgiler ilk çeyreğini, medyan ve üçüncü çeyreğini gösterir; bıyıkları birinci ve üçüncü quartile 1.5 IQR (çeyrekler arası aralık) içinde verisine göre uzatmak. Veri Erickson ve ark., 2015 den uyarlanmıştır <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig6.jpg" /> Şekil 6. PCR ve restriksiyon sindirimi TALEN kaynaklı lezyonlar için ekran. Tfap2a hedefleyen bir TALEN çifti </em&gt; Oluşturulur ve tarif edildiği gibi enjekte edilmiştir. DNA, 2 dpf enjekte edilen embriyolar yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır ve TALEN hedef sekansı çevreleyen 297 bp&#39;lik bir fragmanı, PCR primerleri 5&#39;-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 &#39;ve-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3 5&#39; &#39;kullanılarak yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı ile amplifiye oldu. Şerit 1-10 şerit 11-12, uninjected olan kontroller sindirilmiş, enjekte ve 13-14 uninjected, sindirilmemiş kontroller şeritleri vardır. Pvull, yaklaşık iki eşit boyutlu şeritler halinde doğal tipte sekansını keser. Ham bantlar hedef sekans moleküler lezyonların varlığına işaret etmektedir. Moleküler lezyonlar (sindirilmemiş bantları), 1-10 belirtileri gösteriyor ancak şerit Tüm enjekte embriyolar embriyolar ya tüm monoallelik mutasyonlara sahip ve / veya onlar da (vahşi tip) bantları kestik olarak mozaik vardır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig6large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.</a> Mozaik F 0 CRISPR gelen Şekil 7. Sanger sıralama / Cas9 embriyo enjekte etti. (Üst kısmında gösterilir) PITX2 karşı bir CRISPR kılavuz RNA (5&#39;-GTGGACCAACCTCACGG-3 &#39;) birlikte enjekte Cas9 (38 tarif edildiği gibi pCS2-nCas9n plazmid transkribe) mRNA ve embriyolar ile kısıtlayıcı enzim tahlili kullanılarak lezyonlar için taranmıştır oldu. Kesilmemiş bant, jel ile ekstre edilmiş ve Sanger dizileme ile dizilenmiştir. Dizi kalitesi nedeniyle enjekte embriyo mevcut lezyonların mozaik karışımı (aşağıda ok) tahmin bölünme yerinde alçaltır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig8.jpg" /> Şekil 8. CRI AnaliziSPR F 0 kuyruk yüzgeci görüntüleri. DNA F fin kliplerden PITX2 karşı CRISPRs ile enjekte edilen embriyoların kaldırdı 0 gençlere hazırlandı. CRISPR / Cas9 hedef primerleri 5&#39;-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 &#39;ve 5&#39;-GGCCCAAATTACCCACATTT-3&#39; ile büyütüldü ve ürün EcoRI ile sindirildi. Dört kişi gösterilir; Bir kesilmemiş PCR ürünü solda ve sindirilmiş PCR ürünü her numaralı birey için sağda. Ürün sindirilmiş şeritte kesilmemiş bant (~ 230 bp) boyutu bir lezyon varlığını gösterir. Bireyler 2, moleküler lezyon 3 ve 4 tüm belirtileri gösteriyor, bireyler arasındaki Mozaiklik değişen, yıldız işareti ile belirtilmiştir. İlgili merdiven boyutları sol belirtilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> inşa etmek </td><td> GFP yavrular / toplam F0 (%) balık ekranlı </td><td> % F1 yavrular pozitif </td><td> Not </td></tr><tr><td> BAC A </td><td> 6/46 (% 13) </td><td> 4-19% </td><td></td></tr><tr><td> BAC B </td><td> 1/41 (% 2) </td><td> % 4 </td><td></td></tr><tr><td> BAC C </td><td> 5/42 (% 12) </td><td> 3-40% </td><td></td></tr><tr><td> BAC D </td><td> 3/22 (% 14) </td><td> % 5-15 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid </td><td> 2/38 (% 5) </td><td> % 2-5 </td><td> Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + </td></tr><tr><td> plazmid B </td><td> 3/16 (% 19) </td><td> &lt;% 1-8 </td><td> Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + </td></tr><tr><td> plazmid C </td><td> 1/11 (% 9) </td><td> % 10 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid D </td><td> 2/11 (% 18) </td><td> 1-45% </td><td> plazmid D enjekte2 Genetik arka </td></tr><tr><td> plazmid D </td><td> 5/5 (% 100) </td><td> 16-72% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid E </td><td> 2/3 (% 67) </td><td> 2-22% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid F </td><td> 2/6 (% 33) </td><td> &lt;1-65% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid G </td><td> 3/8 (% 38) </td><td> 2-56% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid H </td><td> 3/18 (% 17) </td><td> gol değil </td><td></td></tr><tr><td> plazmit </td><td> 5/24 (% 21) </td><td> gol değil </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2:. BACS ve güçlendirici yapıları için Transgen iletim verimliliği F 0 enjekte embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve sonra GFP floresan için attı yabani tip balık ve F 1 yavrulara outcrossed bulundu. Transgen iletilen F 0 bireylerin sayısı İfade olduğunuTüm elenmiş F 0 balık yüzdesi olarak işlenmesinde. Transgeni taşıyan F 1 yavru yüzdeleri aralığı da GFP pozitif balık vardı o kavramaları için gösterilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> TALEN </td><td> % F0 verici lezyonlar </td><td> % F1 yavrular pozitif </td></tr><tr><td> bir </td><td> 9/10 (% 90) </td><td> % 20-90 </td></tr><tr><td> B </td><td> 4/8 (% 50) </td><td> 20-72% </td></tr></tbody></table> Tablo 3:. İki TALEN çifti için İletim verimlilikleri F 0 embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve daha sonra yabani tip balık ve TALEN lezyonlar için elenmiş F 1 yavrular çaprazlanırlar enjekte edilir. lezyonlar iletilmesi enjekte bireylerin yüzdesi, bu kavramalar lezyonlarıyla yavru yüzdeleri hem de aralık gösterilirBu iletilen lezyonlar. TALEN A Bmp6 arttırıcı 20 hedef, TALEN B (yayımlanmamış) Tfap2a hedef.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.8K Görüntüleme.  University of California, Berkeley.  Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur. 

Video: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Gelişim Biyolojisi

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...