עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.

החוקרים אין לי מה לחשוף.

חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). ההבטחה כי מים כמה שפחות מתווסף עובר (רק מספיק כדי לגרום הסיסי להתנפח ולהרים מן התא) עוזר להפחית קשיות סיסית. הסיסי מתקשה לאורך זמן, כך עובדים במהירות לאחר הרטבת העוברים חשוב. שמירה על העוברים בתא לחות לפני הזריקה, כך שהם לא יתייבשו גם קריטי. המצמדים חלקים ואפילו עוברי אדם פשוט יש הרבה יותר עבה וקשוח chorions; לפעמים על מנת להזיז את העובר הבא או מנסה עם מצמד חדש הוא הפתרון הקל. זה הרבה יותר קל לדלג ד אחד<html> העובר ifficult מאשר להחליף מחט פגום. לאחר מחטי גיבוי מוכנים יאפשר זריקות להמשיך במקרה של שבירת מחט. כאשר הזרקת BACS, זה נפוץ המחט כדי לסתום. המחט ניתנת מתפנה על ידי גירוד בעדינות או מחדש לשבור את הקצה עם מלקחיים, או באמצעות מתג לחץ אוויר הקבוע לטהר את הסותמים. שנית, זיהוי התא הראשון העובר הוא מאתגר; לעתים קרובות למדי הוא שטוח וקשה למתחילים לראות, במיוחד בלתי נראה כאשר אתה מסתכל ישירות על זה. לעתים קרובות blastomere ניתן לראות רק כבליטה מוגבהת מעט פרופיל. לכן, עדיף לזהות את התא בפרופיל (איור 3B) ואז בעדינות לסובב את העובר קדימה לצד כך התא תתמודד סוף המחט בזווית (אם כי התא יהיה לעתים קרובות להיות בלתי נראה מהזווית הזאת, את צבע כהה של blastomere באיור 3 הוא מוגזם לבהירות). e_content &quot;&gt; שלישי, מיקוד הציטופלסמה הוא גם קשה, במיוחד אם התא הראשון הוא שטוח במיוחד. היא כיוונה את החלק הכי השמן של blastomere (בדרך כלל במרכז) משפרת את הסיכוי של הזרקה לתוך הציטופלסמה. בעוד הזרקה בחלמון ליד הציטופלסמה יכול לייצר מהונדס דג בהצלחה, את היעילות נראית מוגברות קטלני ירד כאשר הציטופלסמה, מכוונת ניקור מחט אחת. לפעמים, מצמדי פרט יצטרכו בלסטומרים דק במיוחד, כך הימנעות החלמון היא כמעט בלתי אפשרית. ממתין יותר מ -25 דקות להתחיל זריקות עשויות לעזור (מצמד כמה לא יוצר blastomere בגודל מלא עד ~ הפרית 45 דקות פוסט), אבל אם בלסטומרים לא להגדיל את שטחיו, הוא לעתים קרובות קל יותר להשיג מצמד חדש של ביצים מאשר לנסות להזריק תאים שטוחים . זריקות קטלניות מוגזמות הבאים עלולות להתרחש מכמה סיבות. מחטים בלאנט ו / או גדול מדי בגודל מחט נשא עלול לגרום too הרבה נזק לתא ו / או הציטופלסמה הגורם לדלוף החוצה. חלק בונת DNA נראית במיוחד קטלני; הורדת ריכוז של ה- DNA עשויה לשפר את ההישרדות אך שיעורי transgenesis נמוך. ניקיון פלסמידים ראשון עם ערכת midiprep המכילה שטיפת רעלן פנימית ואחריו ערכת ניקוי PCR שנייה מפחית לבנות רעיל. לבסוף, עריכת הגנום עשויה לייצר פסד של מוטצית הפונקציה כי הוא קטלני לפיתוח עובר. הקטנת הריכוז של CRISPR או Talen mRNAs יכולה להגדיל את הפסיפס של העובר כדי למנוע קטלני, אך הוא עשוי להפחית את יעילות התאוששות אלל מוטנטי. פרוטוקול שפורסם בעבר להפקת הקוצנים מהונדס בשיטה meganuclease 21 דיווחו על שיעור התמסורת germline transgene 4-7% מהדגים מייסד 0 F. שיטת Tol2 דיווחה כאן הביאה עד לשיעור שידור germline transgene 72% מ- F 0 מייסד דגים (המציין integrat גנומי המרובהיונים). המחקר הקודם בשיטת meganuclease דיווח 40% של עוברים מוזרקים מראים ביטוי של GFP ספציפי, דומה לזה שדווח כאן. כך בעוד שיעורים דומים של מייסדי F 0 מהונדס הם נצפו עבור דג מהונדס שנוצר על ידי שני meganuclease ושיטות Tol2, קצב שידור germline מופיע הרבה יותר גבוה עבור transgenics בתיווך Tol2. כמו טכנולוגיות עריכת הגנום ממשיכות להתקדם, אפילו יותר מניפולציות גנטיות ספציפיות תהפוכנה אפשריות קוצן ומיני דגים אחרים. לדוגמה, בבימויו תיקון 46 ו הומולוגיים יאפשר חילופי אלל בין ימית הגנום קוצן מים מתוקים, ו CRISPRs שונה יכול לשמש במיוחד להפעיל או לעכב ביטוי גנים 47. טכנולוגיות המרגשות אלה לעריכה וניתוח הגנום תובלנה לתובנה חדשות לגבי הבסיס הגנטי של מורפולוגיים, פיסיולוגי מעניין רבים, פנוטיפים התנהגותיים sticklebacks ומיני דגים אחרים.

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 - 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 - 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs. שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 - 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין. באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין. לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38. מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות קטלניות גבוהה בהרבה RNA לבד. זה אופייני לראות עד 50% (לפעמים אפילו יותר) קטלני או מום (ראה האיור 4D - F, 4I) לאחר הזרקת כתב Tol2 בונה (דומה לשיטת meganuclease שתואר לעיל 21). עם זאת, התוצאות משתנות בהתאם נרחבת על המבנה הספציפי, המורפולוגיה העוברת, ורמת מיומנות. לקבלת משפר פעיל, 40-50% של עוברים בדרך כלל יציג ביטוי transgene רקמות ספציפיות, למשל סנפירי חציון החזה (Figure 5). מידת רקע הקרינה ספציפי (4G איור - I) משתנה בהתאם נרחב על האמרגן בשימוש; אמרגן hsp70l דג הזברה נוטה להיות דולף, במיוחד שרירי רקמה עצבית, ו BACS נוטה להיות ביטוי רקע גבוה בחלמון (בדומה 4G האיור). אמרגן 41 יקטין קרפיון בטא הוא פחות דולף אבל גם דוחף באופן משמעותי ביטוי של GFP חלש. הילוכים של transgenes פלסמיד Tol2 יכולים להיות גבוהים, עם עד 100% של ה- GFP + F 0 צאצאים מהונדסים לייצר דגים (טבלה 2). עם זאת, אחוז צאצאים נושאים את הגן משתנה מאוד, מ &lt;1% עד 72% (טבלה 2). שמירת עוברים GFP + מוזרק רק מגביר יעילות העברת כלל. Bács נוטה להיות בעלי שיעור transgenesis נמוך בהרבה, עם רק עד 10% של עובר קוצן F 0 מוזרק מראים קרינה ברקמות צפויות. חוצהשיעור משימה של BACS נמוך מזו של בונת פלסמיד, עם רק עד 14% של קוצן הוקרן שידור BAC (הטבלה 2), דומה בקצב העברת הדיווח של 15% ב דג זברה 32. בניגוד היעילות הנמוכה יחסית של transgenesis BAC, בדרך כלל 70-100% של דגים הוקרנו הזריקו TALENs יש נגעי פסיפס (ב n = 10 מוזרק מצמדים שהוקרנו עבור נגעים). מספר זה יכול להיות נמוך יותר עם ​​זוג Talen יעיל פחות, ועשוי להשתנות עם איכות הזרקה. איור 6 הראה עיכול PCR / הגבלה במשך 10 עובר מן המצמד יחיד הזריק TALENs מיקוד אתר לחתוך PvuII בתוך Tfap2a. Amplicon נימול בכל אחת עובר המוזרק (נתיבי 1-10) מציין כי חלק מן התאים כל עובר לשאת נגעים על מוקד היעד, אם כי כל עובר הוא פסיפס מאוד עם להקה לחתוך wild-type משמעותי. thamplicon הדואר מעובר uninjected במסלולי 11-12 מתעכל באופן מלא עם PvuII. מוטציות-induced Talen מועברות בקלות לדור הבא. עם שני Talen סטים שונה, 50% ו -90% של הוקרן F 0 s משודרים נגעים לצאצאים, עם 20-90% של צאצאים נושא נגעים ב לופתת חיובית (לוח 3). היעילות בעוד CRISPR / Cas9 לא בוצעה אופטימיזציה ב קוצן, עם מדריך CRISPR אחד מיקוד Pitx2, אחד מתוך שלושה עוברים מוזרקים היה נגעים מבוססים על רצף סנגר של מוצר ה- PCR של יעד CRISPR (הלהקה לא-חתוך רצף הבא עיכול הגבלה, איור 7). ההפסד של איכות רצף באתר לחתוך החזה מצביע על שילוב של נגעים מולקולריים נוכח. דגי הקרנה Fin גזיר מבוגרים F 0 עבור נגעים באמצעות assay PCR ועיכול ההגבלה נמצאו דגי 10/22 עם נגעים סומטיים הסנפיר. לתת-קבוצת נציג של החיות האלה מוצגת באיור 8 &lt;/ Strong&gt;; יש בודדים # 3 אחוז גבוה של ה- DNA עם נגעים, בעוד יש בודדים # 2 אחוז נמוך של ה- DNA עם נגעים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות של עוברים מוזרקים. (א) העובר פסיפס מוזרק עם כרית סיליקון שמניע ביטוי של GFP חזה (כוכבי) וסנפירים החציוני (חץ) בשעה שלאחר הפרית 5 ימים (DPF). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ב) קו יציב של BAC כתב שמניע ביטוי GFP בלב העוברי ב 4 DPF. (ג) העובר פסיפס מוזרק עם משפר Col2a1a שמניע ביטוי mCherry ב notochord ב 4 DPF. משפר A1a col2 שובט מ- DNA קוצן עם פריימרים 5&#39;-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 &#39;5&#39;-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3&#39; אשר להגביר את משפר orthologous משומר שדווח דייל Topczewski2011 45. (ד) דוגמא של עובר מתפתח מוזרק בדרך כלל. (E - F) דוגמאות של עוברים לא תקינים עם טראומת הזרקה; E חסר בעין שמאל ו- F יש רקמת נמקי לאורך הצד הימני (ראשי חץ). (G) דוגמה של הביטוי GFP מפוזר ב חלמון, ככל הנראה תוצאה של הזרקת בחלמון ולא blastomere. (H) דוגמא ביטוי GFP הלא ספציפי באפידרמיס (ראש החץ). (I) מואר, הלא ספציפי, ביטוי של GFP פרטנית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig5.jpg" /> איור 5. יעילות של הזרקת הכתב לבנות. עשר מצמד הזריקו constr משפר Bmp6 קוצן 190 נ&quot;בuct שמניע סנפיר החזה וביטוי סנפיר החציוני 5 DPF 20. מכל מצמד, לפחות 20 עוברים דורגו על כך רקמות ספציפיות (חזה ו / או החציוני סנפיר) ו / או ספציפי (כל רקמות האחרות) ביטוי של GFP. אחוז של כל העוברים שורדים מוזרק שיש הביטוי הלא ספציפית רקמות ספציפיות מוצג בתור boxplot. קווים אופקיים מציינים את הרבעון הראשון, חציון ברבעון השלישי; שפם להאריך הנתון בתוך 1.5 IQR (טווח בין-רבעוני) הרבעון הראשון והשלישי. נתונים מעובדים מנתוני אריקסון et al. 2015. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig6.jpg" /> איור 6. PCR ועיכול הגבלה למסך נגעים מושרים Talen. צמד Talen מיקוד Tfap2a </em<html> &gt; נוצר והזריק כמתואר. DNA הוכן כמתואר לעיל מ 2 עוברים DPF מוזרק ושבר 297 נ&quot;ב שמסביב רצף היעד Talen היה PCR מוגבר על ידי DNA פולימרז באיכות גבוהה באמצעות פריימרים 5&#39;-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 &#39;5&#39;-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3 &quot;. Lanes 1-10 מוזרק, נתיבי 11-12 הם uninjected, מתעכלים פקדים נתיבי 13-14 הן בקרות uninjected, לא מעוכלות. PvuII חותך את רצף wild-type לשתי כ להקות בגודל שווה. להקות נימול המצביעות על נוכחות של נגעים מולקולריים רצף היעד. כל העוברים מוזרקים נתיבי 1-10 להראות סימנים של נגעים מולקולריים (להקות מעוכלות), אולם כל העוברים או שיש מוטציות monoallelic ו / או הם פסיפס כפי שהם גם קצצו (wild-type) להקות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> e = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig7.jpg" /> איור 7. רצף סנגר מ CRISPR F 0 פסיפס / Cas9 מוזרק העובר. RNA מדריך CRISPR (5&#39;-GTGGACCAACCTCACGG-3 &#39;) נגד Pitx2 (מופיע בצד העליון) היה שיתוף הזריקו Cas9 mRNA (עיבד מ- פלסמיד pCS2-nCas9n כמתואר 38) ועוברים הוקרנו נגעים באמצעות assay אנזים הגבלה. הלהקה לא-חתוך חילוץ ג&#39;ל להפיק ולרצף ידי רצף סנגר. איכות רצף מדרדרת באתר מחשוף חזה (חץ למטה) בשל תמהיל פסיפס של נגעים קיים בעובר מוזרק. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig8.jpg" /> איור 8. ניתוח של CRISPR F 0 קליפים סנפיר הזנב. DNA הוכן קליפים סנפיר מ- F 0 קטינים העלה מעוברים הזריקו CRISPRs נגד Pitx2. היעד CRISPR / Cas9 היה מוגבר עם פריימרים 5&#39;-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 &#39;5&#39;-GGCCCAAATTACCCACATTT-3 &quot;, והמוצר היה מתעכל עם EcoRI. ארבעה בני אדם מוצגים; מוצר נימול PCR הוא מצד שמאל וקבע מתעכל המוצר PCR נמצא בצד ימין עבור כל אדם ממוספרים. מוצרים בגודל של הלהקה נימול (~ 230 נ&quot;ב) בנתיב מתעכל מעיד על קיומו של נגע. אנשים 2, 3 ו -4 כל להראות סימנים של נגע מולקולרי, הצביעו עם כוכביות, עם השתנה פסיפס בין יחידים. בגדלי סולם רלוונטיים מסומנים בצד שמאל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54055/54055fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִבנוֹת </td><td> GFP צאצאים / F0 הכולל הוקרן דגים (%) </td><td> F1 צאצאי% חיוביים </td><td> הערה </td></tr><tr><td> BAC </td><td> 6/46 (13%) </td><td> 4-19% </td><td></td></tr><tr><td> BAC B </td><td> 1/41 (2%) </td><td> 4% </td><td></td></tr><tr><td> BAC C </td><td> 5/42 (12%) </td><td> 3-40% </td><td></td></tr><tr><td> BAC D </td><td> 3/22 (14%) </td><td> 5-15% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד </td><td> 2/38 (5%) </td><td> 2-5% </td><td> כל העוברים F0 הוקרן, לא רק GFP + </td></tr><tr><td> פלסמיד B </td><td> 3/16 (19%) </td><td> &lt;1-8% </td><td> כל העוברים F0 הוקרן, לא רק GFP + </td></tr><tr><td> פלסמיד C </td><td> 1/11 (9%) </td><td> 10% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד D </td><td> 2/11 (18%) </td><td> 1-45% </td><td> פלסמיד D מוזרק2 רקע גנטי </td></tr><tr><td> פלסמיד D </td><td> 5/5 (100%) </td><td> 16-72% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד E </td><td> 2/3 (67%) </td><td> 2-22% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד F </td><td> 2/6 (33%) </td><td> &lt;1-65% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד G </td><td> 3/8 (38%) </td><td> 2-56% </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד H </td><td> 3/18 (17%) </td><td> לא קלע </td><td></td></tr><tr><td> פלסמיד לי </td><td> 5/24 (21%) </td><td> לא קלע </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2:. יעילות העברת transgene עבור BACS ובונה משפר F 0 מוזרק עוברים הועלו לבגרות ואז outcrossed לדגים wild-type והצאצאים F 1 וכבש עבור GFP הקרינה. מספר אנשים F 0 ששידר את הגן הוא expressed כאחוז מכלל דגי F 0 הוקרן. הטווח של אחוז צאצאי F 1 נושאים את הגן גם מוצג עבור מצמדים אלה היו GFP דגים חיוביים. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Talen </td><td> % נגעי משדר F0 </td><td> F1 צאצאי% חיוביים </td></tr><tr><td> א </td><td> 9/10 (90%) </td><td> 20-90% </td></tr><tr><td> B </td><td> 4/8 (50%) </td><td> 20-72% </td></tr></tbody></table> טבלה 3:. יעילות הילוכים שני זוגות Talen F 0 מוזרק עוברים הועלו לבגרות ואז outcrossed לדגים wild-type והצאצאים F 1 לגילוי נגעים Talen. אחוז האנשים המוזרקים משדר נגעים מוצג, כמו גם המגוון של אחוז צאצאים עם נגעים ב לופת אלהכי נגעים משודרים. Talen עם מיקוד משפר Bmp6 20, Talen B ממוקד Tfap2a (לא פורסם).

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.8K Views.  University of California, Berkeley.  מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המת...

Video: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...