NMR tabanlı aktivite tahlilleri, belirli bir enzim için inhibitörleri tanımlamak, değerlendirmek ve doğrulamak için etkili bir yöntem sağlar. Özellikle parça taraması için çok uygundurlar. NMR tahlilleri zayıf inhibitörler için gerekli yüksek bileşik konsantrasyonları için münasiptir.
Buna ek olarak, muhabir enzimlerin eksikliği onları yanlış pozitiflere daha az yatkın hale getirir. Trichomonas vaginalis'ten iki enzimin inhibitörlerini belirlemek ve karakterize etmek için laboratuarımızda NMR tahlillerini kullanıyoruz. Her iki enzim de yeni anti-tritrihomonal ilaçlar için yeni hedefler temsil eder.
NMR tahlilleri genellikle enzimleri içeren herhangi bir araştırma alanı için geçerlidir, ve hatta hücrelerin içindeki enzimleri incelemek için kullanılabilir. Tekniğin en önemli yönleri, doğru reaktif hacimlerinin boruya aktarılmasını ve reaksiyon bileşenlerinin iyice karıştırılmasını sağlamaktır. Substrat ve test bileşiklerini hazırlamak için, dört adet 1,5 mililitrelik mikrofuge tüpün her birine 12 mikrolitre substrat ekleyin ve sıfır dakikalık kontrol ve 30 dakikalık kontrol tüplerine altı mikrolitre deuterated DMSO ekleyin.
İlk deney tüpüne altı mikrolitre test bileşiği, test bileşiğinin üç mikrolitresi ve ikinci deney tüpüne üç mikrolitre deuterated DMSO ekleyin. Daha sonra, 2.59 mililitre reaksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe 300 mikrolitre döteryum oksit ekleyin ve ardından 25 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin. Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez ters çevirin ve 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe 1,5 molar hidroklorik asit 10 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, reaksiyon stok çözeltisi ve asit hacminin tamamını sıfır dakikalık kontrol tüpüne aktararak sıfır dakikalık kontrol reaksiyonu başlatın ve söndürün. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir şekilde iki kez azarlama ve dağıtma. Geri kalan üç reaksiyonu şaşırtıcı bir şekilde başlatın ve çalıştırın, reaksiyon stok çözeltisinin 582 mikrolitresini ilk deneysel tüpe hemen aktarın ve numuneyi sadece gösterildiği gibi iki kez karıştırın.
Dikkatli bir aspirasyon ve dağıtım başlatma adımları sırasında tam bir karıştırma sağlar. Diferansiyel karıştırmanın bir değişken olmadığından emin olmak için her örnekle tutarlı olun. 30 saniye sonra, 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisini ikinci deney tüpüne aktarın ve karıştırın, ardından ikinci deney tüpünde reaksiyonu başlattıktan 30 saniye sonra 30 dakikalık kontrol tüpüne 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisi ilave edin.
30 dakika sonra, ilk deney tüpüne 10 mikrolitre 1,5 molar hidroklorik asit ekleyin, ikinci deney ve 30 dakikalık kontrol tüpleri için 30 saniyelik aralıklarla söndürmetekrar. Tüm reaksiyonlar söndürüldüğünde, her reaksiyondan 600 mikrolitre çözeltiyi NMR tüplerine aktarın. Kontrol spektrumu için substrat yüzde dönüşüm hesaplamak için, spektrometre üzerine örnekleri yükleyin, NMR spektrumları toplamak ve sıfır ve 30 dakikalık kontroller için spektrum bindirme.
30 dakikalık denetimle eşleşecek şekilde sıfır dakikalık denetimdeki substrat sinyalini ölçeklendirin ve bu yüzdeye dikkat edin. Ardından, yüzde dönüşümünü substrat sinyallerinin eşleştirilmesinden 100 eksi olarak hesaplayın. Test bileşiği içeren reaksiyonlar için substrat yüzde dönüşüm hesaplamak için, sıfır dakika kontrolü ve 500 mikromolar test bileşiği içeren ilk reaksiyon için spektrum bindirme ve test bileşiği ile spektrum maç için sıfır dakika kontrolü nde substrat sinyali ölçeklendirmek.
Bu yüzdeyi not edin ve az önce gösterildiği gibi yüzde dönüşümünü hesaplamak için kullanın. Daha sonra, sıfır dakikalık kontrol ve 250 mikromolar test bileşiği içeren ilk reaksiyon için spektrumu yeraltın ve test bileşiği ile spektrumu eşleştirmek için sıfır dakikalık kontrolde substrat sinyalini ölçeklendirin. Yüzdeyi kaydettikten sonra, yüzde dönüşümünü hesaplamak için kullanın.
Her test bileşik konsantrasyonu için yüzde reaksiyon ve yüzde inhibisyonu hesaplamak için, ilk olarak, test bileşik yüzde dönüşüm olarak yüzde reaksiyon hesaplamak, kontrol süreleri 100 yüzde dönüşüm bölünür. Sonra yüzde inhibisyonu yüzde 100 eksi reaksiyon olarak hesaplayın. Bir deterjan karşı teşrisi yapmak için, 2,59 mililitre reaksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe 300 mikrolitre döteryum oksit ve 25 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin.
Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez hafifçe ters çevirin ve 20 mililitre reaksiyon tamponuna iki mikrolitre Triton X-100 deterjan ekleyin. Daha sonra, yeni bir 15 mililitre konik tüp için% 0.01 Triton X-100 deterjan içeren reaksiyon tampon 2.59 mililitre ekleyin. Sonra tüp için döteryum oksit 300 mikrolitre ve enzim çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin.
Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez hafifçe ters çevirin. Daha sonra, 100 mikromolar ve 50-mikromolar test bileşikleri için yüzde inhibisyonu belirlemek gibi sadece gösterdi. Reaksiyon stok çözeltisi deterjan olmadan kullanarak, dört tüpler bir set ve dört tüpler ikinci bir set için deterjan ile reaksiyon stok çözeltisi.
Bir sıçrama seyreltme gerçekleştirmek için, reaksiyon tampon 468 mikrolitre ve reaksiyon tampon 53,8 mikrolitre reaksiyon tampon, enzim çözeltisi beş mikrolitre ve 30 dakika boyunca kuluçka olmuştur DMSO 1,2 mikrolitre içeren bir tüp döteryum oksit 60 mikrolitre aktarın. Aspirat ve yavaş, ama kasıtlı bir şekilde karışımı iki kez dağıtmak. Reaksiyon tampon468 mikrolitre ve döteryum oksit 60 mikrolitre bir tüp içeren bir tüp transfer etmeden önce 53.8 reaksiyon tampon, enzim çözeltisi beş mikrolitre, ve test bileşik 1.2 mikrolitre 30 dakika kuluçka olmuştur.
İkinci reaksiyonu gösterildiği gibi iki kez karıştırın. Ve hemen 588 mikrolitre çözeltiyi sıçrama seyreltme DMSO kontrol tüpünden 12 mikrolitre substrat içeren bir tüpe ve karıştırmaya aktarın. Jump-dilution test bileşik tüpünden 588 mikrolitre aktarmaya devam edin, seyreltilmemiş DMSO kontrol tüpü ve seyreltilmemiş test bileşik tüpü üç adet 1,5 mililitrelik tüplerin her birine, tüp başına 12 mikrolitre substrat içeren ve bundan sonra 30 saniyelik aralıklarla karıştırılarak.
Daha sonra reaksiyonları söndürmeden önce 30 dakika bekleyin, NMR spektrumlarını toplayın ve her bileşik için az önce gösterildiği gibi yüzde inhibisyonu hesaplayın. Burada proton NMR kullanılarak yapılan ilk test bileşimi testinde AgNH'ye karşı iki bileşiğitest etme sonuçları gösterilmiştir. Enzim reaksiyonu en kolay gözlenir ve sırasıyla milyon da 8.48 ve 6.09 parça adenozin singlet ve doublet rezonansların kaybolması ile ölçülür.
Ve 30 dakikalık kontrol spektrumunda gözlendiği gibi milyonda 8.33'lük bir adenin bekar rezidansın görünümü. Bu şekilde, proton NMR kullanılarak agnh karşı iki konsantrasyonda bir bileşiğin test sonuçları gösterilmiştir. Gözlemlenen enzim inhibisyonunun bileşik agregasyon un bir artifakı olmadığını gösteren, iki koşul kullanılarak substrat ve ürün sinyallerinin yoğunluklarında sadece minimal farklılıklar gözlenir.
Test edilen bileşik ten ve deterjandan kaynaklanan rezonansların substrat veya ürün rezonanslarına müdahale etmediğini unutmayın. Proton NMR kullanılarak AGNH'ye karşı bir bileşim test etme sonuçları, 20mikromolar reaksiyona göre 20 mikromolar reaksiyonda substrat sinyalinin yoğunluğunun azaldığını ortaya çıkararak inhibisyonun geri döndürülebilir olduğunu göstermektedir. Her reaksiyonun başlatılması sırasında ve sıçrama seyreltmeleri için tam bir numune karıştırma sı önemlidir.
Dikkatli ve tutarlı bir aspirasyon ve dağıtım gereklidir. NMR tabanlı tahliller de reaksiyon tampon ve enzim yerine askıya hücreleri içeren bir çözüm kullanarak, tüm hücrelerde enzim aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Anti-trikünal ilaç keşif çabalarımız, yeni sentezlenen bileşiklerin ribohidrolaz enzimlerine karşı gücünü ölçmek için bu tahlillere dayanmaya devam etmektedir.
Sadece çok küçük miktarlarda kullanılmasına rağmen, reaksiyonları söndürmek için kullanılan hidroklorik asit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanile kullanılmalıdır.
