We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

Hayvan Kaynakları Rochester Üniversitesi Komitesi Üniversitesi Bu yazıda yapılan tüm işlemleri onayladı. 1. Ön cerrahi hazırlanması (ve fare) <ol><li> Gerekli tüm ekipman ile cerrahi alan hazırlayın. Önceden% 70 etanol kullanılarak işlem sırasında kullanılan tüm araçları sterilize edin. İsteğe bağlı olarak, bir cam boncuk sterilizatör kullanın veya araçları sterilize etmek otoklav. </li><li> Bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odasında fare yerleştirin. 1 L / dakikalık bir hızda 4% izofluran seviyelerini ayarlayın. Not: astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgen, burada bildirilen deneylerde, fareler için 10 HIV etkisini incelemek için kullanılmıştır Daha önce tarif edildiği gibi 7,10 -1, serebral vasküler yapısı üzerinde nöro-inflamasyonu neden olmuştur. </li><li> Yavaşça ve fare gözlemlemek için indüksiyon odasına ipucu# 39; ın düzeltilmesi refleks. Düzeltilmesi refleks bastırılmış edildikten sonra,% 2 izofluran düzeyini ayarlamak ve cerrahi tezgah burun konisi indüksiyon odasından hava akışını yönlendirmek. </li><li> Hızla su infüzyon ısıtma pedi indüksiyon odasından fareyi hareket ettirin. Burun konisi ile izofluran (% 1.5-2) uygulanmaya devam. Solunum hızı (RR) izleme yoluyla değerlendirilen bireysel fare toleransına göre anestezi ayarlayın. Not: RR depresyon serebral kan akımı ve damar çapı değerlendirmesini değiştirerek fizyolojik gaz parametrelerini perturb olabilir. Dakikada 55-65 nefes arasında RR tutmaya çalışın. Kalp atım hızı (KAH), aynı zamanda anestezi derinliği değerlendirmek kullanılabilir; damar çapı fizyolojik değişiklikleri önlemek için dakikada 300-450 atım arasında HR tutun. Tipik olarak, anestezi verilen bir fare 1 L / dk 1.5-2.0 izofluran% arasında yeterli olacaktır. </li><li> Ayrıca anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin. Fare, iletişimi yanıt vermezsecerrahi girişim rüler. </li></ol> İnce kafatası Kranial Window 2. Hazırlık <ol><li> Fare gözlerine yapay gözyaşı jeli uygulayın. Tamamen makas veya elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare derisi saç kaldırmak. </li><li> Povidon-iyot çözeltisi uygulayarak saç derisini sterilize; kurumasını bekleyin. Sonra, bir ışık mikroskobu altında, tamamen parietal kemikler işaretleme, kuyruk frontal kemik ve Bregma açığa fare derisi deri kaldırmak. </li><li> Kolay çıkartılması için membranlar kurutmak için kafatasına% 10 ferrik klorür solüsyonu az miktarda uygulanır. Yavaşça kafatası kazıyarak # 5/45 forseps ile kurutulmuş membranlar çıkarın. </li><li> Headplate pencerenin etrafında tutkal ince bir tabaka sürün. Yavaşça pencereye merkezindeki ilgi alanı tutmak, fare kafatası karşı headplate basın. Tutkal polimerize etmek headplate dental çimento bir damla uygulanır. </li><li> Ince bir tabaka sürünheadplate penceresinin kenarında tutkal tuzlu tutmak için bir rezervuar oluşturmak için. Tutkal kuruduktan sonra, fare headplate koşum içine headplate vida. Not: Bu prosedürde kullanılan fare headplate kablo demeti, bir metal taban ve iki metal sütunlu bir yapıdır. Her sütunda bir bahar ve bir kanat somun var. Headplate bahar üstüne yerleştirilir ve baş seviyesi ve hareket etmiyor kadar kanat somun sıkılır. </li><li> 6000 rpm&#39;de Microtorque matkap bağlanmış bir matkap ucu ile headplate penceresinden herhangi bir tutkal çıkarın. Gemilere yapısal hasarlara neden olabilir fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için her 10-15 saniyede durdurun. <ol><li> Yeni bir matkap ucu yardımıyla, orta hatta (headplate penceresinin çapının üçte biri) yanal olarak Microtorque matkap 1,5 mm yerleştirin. 4000 rpm&#39;de ince bu konum etrafında kafatası başlayın. Doğrudan aşağı yönlü baskı ile kafatası arasında hafifçe matkabı hareket ettirin. </li><li> Kes drilling her 10-15 sn fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için. Bu süre zarfında, bir sıkıştırılmış hava spreyi kullanarak birikmiş kafatası tozu temizleyin. </li><li> 5-10 saniye kafatası soğumaya RT tuzlu su damla. Yavaşça kafatası inceltme devam etmek yumuşak bir doku ile tüm sıvıyı çıkarın. </li></ol></li><li> Kafatasının son incelme için, headplate haznesindeki tuzlu küçük bir hacim yerleştirin ve hafifçe küçük damarlar açıkça görülebilir kadar ilgi alanı üzerinde diş MicroBlade süpürün. </li></ol> Fizyolojik Parametrelerinin 3. İzleme <ol><li> Kafatası tamamen inceltilmiş sonra, sahibinden fare ayırmak ve sırtında üzerine yerleştirin. Yavaşça açıkça medial uyluk açığa her iki arka bacaklarını aşağı bantlayın. </li><li> Makas veya elektrikli tıraş makinesi ile hem medial uyluk üzerinde saç çıkarın. Povidon-iyot ile uyluk kapsayan cerrahi siteyi dezenfekte edin. </li><li> Femoral ven üzerinde medial sağ uyluk cilt üzerinde Pinchve arter 5. forseps kullanarak. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Not: Sol uyluk cerrahi komplikasyon (vasküler anomaliler, rüptüre damarlar) durumunda saklıdır. </li><li> Cerrahi siteye% 0,9 tuz yaklaşık 3-5 damla uygulayın. Bu damarların büyük büyütme, hem de damarların nemli sitesi tutmak ve önlenmesi kurutma sağlar. Açık açık iki # 5/45 forseps kullanılarak femoral nörovasküler demet içine diseksiyon ile arter femoral ven ayırın. </li><li> Yaklaşık 1 cm arayla femoral arter altında cerrahi sütür iki, 3 cm&#39;lik parçalar yerleştirin. Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemek için yardımcı olacak bir damar turnike oluşturmak için üst dikiş saat yönünde çevirin. </li><li> Yaylı makas kullanılarak femoral arter küçük bir kesi yapmak. Kateter arter içinde sıkıca kadar kesi ve peşin yoluyla arter kateteri yerleştirin. </li><li&gt; sızıntı ve uygun kateter yerleştirme değerlendirmek için üst sütür (turnike) açılmak. Sütürler kullanılarak geminin içindeki kateter etrafında iki knot bağlayarak femoral artere kateter sabitleyin. </li><li> Kan pıhtılaşmasını önlemek için kateter ile heparin 10 ul (100 lU / ml) enjekte edilir. Sonra, cerrahi basit bir kesintiye desen 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sağ uyluk kapatın. </li><li> Intraperitoneal sağ alt kadranda içine üretan 50 ul (1.2 mg / g) enjekte edilir. Beş dakika sonra intraperitonal üretan 100 ul bir toplam sol alt kadrana bir 50 ul enjeksiyon ile tekrarlayın. Eşzamanlı anestezi derinliği için fare tekrar kontrol ederken yavaşça yaklaşık% 0.25 izofluran seviyesini düşürür. Not: bağırsakları perfore kalmaması arka karın duvarı boyunca periton boşluğu içinde yüzeysel iğne tutun. Bu karın rektus mu kısma yapılabiliruzak iç organlardan ve sonra enjekte scles. </li><li> Kılcal tüp kullanarak, kateter arter kan 40 ul örnek toplamak. Bir tuzlu dolu dört yollu ve heparin şırınga ile donatılmış kan basınç dönüştürücü kateter takın. </li><li> Kateterin istenmeyen kaldırılmasını önlemek için cerrahi alete tansiyon dönüştürücüyü bantlayın. Ortalama arter basıncı izleme başlayın. </li><li> Bir kan gazı analizörü giriş portuna kan dolu kılcal tüpü yerleştirin. Tüm kan ekstre edildikten sonra, giriş portundan kılcal tüp kaldırmak. O 2 ve CO 2 kan gazları, kan gazı analizörü yazdırılan bir kağıt üzerinde görünecektir. </li></ol> Floresan Boya 4. Enjeksiyon <ol><li> 5. forseps kullanarak medial sol uyluk üzerinde cilt sıkıştırın. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Dekstran konjuge kırmızı yayan rhodamine boya hazırlayın(70 kDa) (serum fizyolojik içinde eritilmiş 10 mg / kg). </li><li> Femoral bağlı bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga vein.Using bulun şırınga 130 ul hattına görüntüleme için uygun bir floresan boya daha önce hazırlanan çözelti çizin. Şırınga içine tamamen boya çizim ve sıkıca şırınga duvara iterek tüm hava kabarcıklarını çıkarın. <ol><li> Viraj sert bir yüzey konik tarafı yukarı bastırarak yaklaşık 30 derecelik bir açıyla 30 G iğne. Boya ile iğne doldurun ve 100 ul örneği bırakarak, herhangi bir aşırı sıvı atın. </li></ol></li><li> Yavaş yavaş femoral ven içine boya 100 ul örneği enjekte edilir. İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon siteye sürekli hafifçe baskı uygulayın. Boya 5 dakika dönmesine izin verin. Not: alternatif, sağ femoral ven başka cerrahi sitenin yaratılması yoluyla daha fazla kan kaybını önlemek için floresan boya enjeksiyon için yerine kullanılabilir. Buna ek olarak, eğerHayvan cerrahi siteden kontrolsüz kanama, bu çok fazla heparin kateteri yıkamak için verildiğini bir göstergesi olabilir. Orada 10-15 dakika içinde hiçbir pıhtılaşma ve fare kanama hala devam ediyorsa, yeni bir fare ile deney yeniden başlatmayı düşünün. </li><li> Daha sonra dikkatli bir şekilde mide üzerine fareyi çevirmek, 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sol uyluk kapatın ve fare headplate koşum içine yerleştirin. </li></ol> Vivo İki-Foton Görüntüleme 5. <ol><li> Sürekli anestezi seviyesini korumak için emin olun, iki foton mikroskop cerrahi cihazı taşıyın. Headplate rezervuar içine% 0,9 tuz az miktarda koyun ve tuzlu su ile temas, böylece mikroskop objektif indirin. Aydınlık görüntüleme objektif kullanılarak ilgi alanı bulun </li><li> Floresan boya için uygun bir dalga boyuna iki-fotonlu lazer uyarımı ayarlayın. 25x o kullanan iki foton görüntüleme başlayınbjective. Bu deneylerde 780 nm&#39;lik bir dalga boyunda heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan unutmayın. Emisyon filtresi bandpass 607/36 bir boya floresans tespit etmek ve emisyon filtresi bandpass 480/20 arteryal otoflüoresan tespit etmek için kullanıldı </li><li> Görünümü ekranda yatak bir kılcal bulun ve iki foton görüntüleme yazılımı kullanarak kılcal damarların optik zoom 2. Edinme görüntüleri kullanarak bu bölgeyi büyütmek. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, dekapitasyon servikal dislokasyon ile fare kurban. </li></ol> 6. Ex Vivo İki Foton Görüntüleme <ol><li> Ekstra ince makas kullanarak, fare frontal kemikler interparietal kemikleri kafa derisi bir kesi yapmak. Işaretçi parmak ve başparmak ile kafatası kenarlarına cilt sabitleyin. </li><li> Medial interparietal kemik altında ekstra ince makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca kafatası kesti. Bregma işaretleme sonra yaklaşık 3 mm kafatası kesme durdurun. Not: Beyni kesilmesini önlemek için kafatası keserken yukarı yönlü baskı uygulayın. </li><li> # 5 forseps kullanarak, beyinden gelen kafatası ayırmak ve dikkatle beynin yüzeyine herhangi meninksler kaldırmak. Kalan Meninksler yanlışlıkla beyin lacerate olabilir; Aşırı bakım Bunu önlemek için alınmalıdır. Beyin kafatası boşalana kadar yavaşça yavaşça ileri ilerleyen beynin altında 5. forseps kaydırın. Not: aşağı yönlü baskı beyin delinmesiyle önlemek için kullanılması gerektiğini söyledi. </li><li> Fareler için belirli bir beyin kesit aracı beyin yerleştirin. Beynin üzerinde yapay beyin omurilik sıvısının damla uygulayarak beyin yıkayın. </li><li> Bregma bregma 0 dan beynin 2 mm koronal bölümü çıkarın -2. Yukarı bakacak 0 bregma ile yapay beyin omurilik sıvısı içeren içbükey cam slayt üzerine koronal bölümü (bölümün en kafatası parçası) yerleştirin. Yavaşça beyin sl kapakBir cam kapak slip ile buz. Not: Bu damar mimarisini deforme olabilir bir kez beyin bölümünde yer cam basarak kaçının. </li><li> Mikroskop sahneye slayt aktarın ve kapak kayma% 0,9 tuz az miktarda koyun. Bu tuzlu su ile temas edene kadar mikroskop objektif indirin. Aydınlık objektif kullanarak beynin orta hat bulun. </li><li> İki foton görüntüleme başlayın ve tekrar 25x objektif kullanarak orta hat bulun. Koronal bölümün kortikal yüzeyinde boyuna fissür arayarak bunu gerçekleştirmek. Orta hat üzerinde görüntüleme ekranın sağ kenarına yerleştirin ve yanal üç tam kare (orta hattan yaklaşık 1.5 mm) izleyici ekran üzerinde hareket. Bu deneylerde, görüntüleme parametreleri adım 5.2 not belirtilenlerle aynı olduğunu not edin. </li><li> Kılcal damarlar görünümü ekranda zorlukla görülebilir hangi derinliğe bulun. Odak ilave 20 uçağı düşürünmikron z-yığınının üst belirlemek için. </li><li> 1 mikron görüntü kalınlığı ayarlayın. 100 um için görünüm ekranı indirin ve piksel% 1&#39;den az doygun olduğu gibi boyunca lazer gücünü ayarlamak. Not: z-yığın görüntüleri 100 ardışık 500x500x1 um görüntülerin bir dizi derlenmektedir. Daha doğru post işleme hesaplamaları olacak z yığın büyük. Genellikle, 100 mm veya daha büyük bir z-yığını toplamak için çalışmayın. </li><li> Bitişik XY simgesi ardından XY tekrarlayın simgesine basın. Z-yığın tamamlandığında, Seri Bitti simgesine basın ve dosyayı kaydedin. </li></ol> 7. Veri İşleme <ol><li> ImageJ yazılım in vivo kapiler görüntüyü açın. Elle iki foton yazılımı elde edilen değerlere dayalı uzaktan oranı piksel olarak ayarlayın. <ol><li> Araçlar menüsünden * düz * simgesini seçin. Oppo bir kılcal duvardan uzanan bir çizgi çizinsitesi kılcal duvar ve ImageJ tarafından sağlanan uzunluğu kaydedin. Bu açık bir şekilde, kapiler duvarlardan kenarlarını görselleştirmek amacıyla görüntüyü yakınlaştırmak için gerekli olabileceğini not edin. </li><li> Kılcal boyunca farklı yerlerde adımı yineleyin 7.1.1, yanı sıra görüntüde birden kılcal damarlar. </li></ol></li><li> Böyle Amira gibi analitik yazılım içine z yığın dosyasını açın. Alt uygulama araç çubuğundan Filament Editör simgesini seçin <ol><li> Üst veya z-yığının altına ya yaklaşık 20 Move izleyiciyi izleyici kalınlığını ayarlayın. </li><li> İz simgesini seçin ve yüklenen görüntü üzerine imleci. Şekil 2C açıklanan yerlerde kılcal damarların yerleştirin düğümleri; segmentler otomatik komşu düğümler arasında görünecektir. Tüm z-yığınının boyunca kılcal Trace. Not: thr kılcal izlemek için uç noktaları ve şube noktaları arasında düğümleri yerleştirmek için gerekli olacaktırZ-yığın oughout. </li><li> Bu düğümler kaldırmak için, Ara Kaldır simgesini tıklatın. Not: Bu Kaldır Seçili simgesini seçerek Seç Tek simgesini kullanarak döngü seçerek ve elle kaldırılması gerekir hatalı döngüye segmentleri oluşturabilirsiniz. Döngüler izleme sırasında aynı bölgede görünmeye devam ederse, bu düğümlerin farklı kılcal damarların yerleştirildi olasıdır. </li><li> Izleme tamamlandıktan sonra, otomatik olarak ayıklanır vasküler parametreleri içeren bir elektronik tabloyu açmak için Graph Bilgisi simgesini seçin. Düğümleri ve segment sayısının ana görünümü ekranda mevcuttur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coat+of+many+colors:+neuroimmune+crosstalk+in+human+immunodeficiency+virus+infection.">A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection.</a> Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).</li><li>Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+associated+dementia:+symptoms+and+causes.">HIV-1 associated dementia: symptoms and causes.</a> Retrovirology. 3, 28 (2006).</li><li>Antinori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+research+nosology+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders.">Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).</li><li>Clifford, D. B., Ances, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-associated+neurocognitive+disorder.">HIV-associated neurocognitive disorder.</a> The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).</li><li>Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-associated+neurocognitive+disorder:+pathogenesis+and+therapeutic+opportunities.">HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities.</a> Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+production+of+IL-17A+induces+glial+activation,+microvascular+pathology+and+enhances+the+neuroinflammatory+response+to+systemic+endotoxemia.">CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia.</a> PloS one. 8 (2), e57307 (2013).</li><li>Silva, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+central+nervous+system+expression+of+HIV-1+Tat+leads+to+accelerated+rarefaction+of+neocortical+capillaries+and+loss+of+red+blood+cell+velocity+heterogeneity.">Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity.</a> Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Bruce-Keller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+causes+rapid+increases+in+glial+activation+and+neuronal+injury+in+the+striatum+of+inducible+HIV-1+Tat+transgenic+mice.">Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice.</a> Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).</li><li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence.">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li><li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+hypercapnia+reveals+an+underlying+cerebrovascular+pathology+in+a+murine+model+for+HIV-1+associated+neuroinflammation:+role+of+NO-cGMP+signaling+and+normalization+by+inhibition+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterase-5.">Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).</li><li>Farber, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+and+agent-specific+dilation+of+intracerebral+microvessels+by+volatile+anesthetics+in+rat+brain+slices.">Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices.</a> Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tarif edilen yöntem, deneysel modeller / ayarları geniş bir beyin mikrovasküler yapılarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı olması için, üç kritik adım hakim olması gerekmektedir. İlk olarak, ince kafatası penceresi kafatası ya da altta yatan beyin zarar vermemelidir. Bu inceltme sırasında kafatası delinme ya da ısı kaynaklı damar kaçağa neden kolaydır. Floresan boya odak düzlemi içine sızabilir ve kılcal belirsiz gibi bu görüntüleme engelleyebilir. Kafatası sık ince kafatası hazırlanması sırasında bozulursa, büyük olasılıkla çok büyük bir aşağı yönlü baskı neden olur. Çapak mümkün olduğunca yakın Microtorque matkabı Holding kafatası üzerinde aşağı yönlü baskı azalacak fazla dokunsal kontrol sağlar. İkincisi, arteriyel kateterizasyon mümkün olduğunca çabuk arter kesilmiş edildikten sonra yapılmalıdır. Hızla kateter eklemek için başarısızlık zorunlu olacak aşırı kan kaybına neden olabilirFare fizyolojik bütünlüğü romise. Kateterin yerleştirilmesi güçlüğü femoral artere göre kateterin nispeten büyük bir boyuta genellikle. Bu onun çapını azaltmak üzere kateter germek için gerekli olabilir. Ayrıca, 5. forseps ipuçları kateterin yerleşim kolaylığı arter yapılan açılış kapmak ve büyütmek için kullanılabilir. Üretan anestezisi kısa sürede tatbik edilebilir ve böylece Üçüncü olarak, in vivo cerrahi prosedürler süresi en aza düşürülmesi gerekmektedir. Izofluran anestezisi böylece kılcal çap verileri skewing, serebral kan damarlarının 13 vazodilatasyona neden olabilir. Bu Amira analitik yazılımı otomatik olarak elle takip gemilerin yarıçapına ayıklamak kabul edilmelidir; ex vivo beyinleri z-yığın görüntüleri analiz etmek için bu özelliği kullanırken, ancak değer yanlış olur. Bu af, çünkübeyin çıkarmadan ter, beyin kılcal damarlar artık basınçlı, ve morfolojik bozulabilir. Kılcallar, normal fizyolojik koşullar altında, basınca dayanıklı olduğu in vivo kılcal çap ölçümü, bu problemi aşılmaktadır. Ayrıca, bu yöntem, bir kısıtlama olmaksızın olmadığını belirtmek gerekir. İlk olarak, bir çok eğitim in vivo görüntüleme hazırlığı ana için gereklidir. Bir araştırmacı verimli iki teknik olarak zor teknikleri (ince kafatası kortikal pencere ve arteriyel kateterizasyon) gerçekleştirmek için öğrenmek gerekir; Her iki teknikte bir hata deney uzlaşma ve verileri geçersiz olabilir. İkincisi, ex vivo z-yığınlarının analizi zaman yoğundur. Tek z-yığın görüntü iskeletleştirme 2.5 saat kadar sürebilir. Bu analiz dikkatli manuel tr içeren iskeletleştirme sürecinin tutarlılığını (sağlamak için deneyimli bir araştırmacı tarafından tamamlanmış olması Dahası, bu tavsiye edilirkan damarlarının Acing). Bir kez bu protokolün tüm yönleriyle elde edilen veriler görüş alanı başına birim hacim başına kılcal veya kılcal damarların olarak kılcal yoğunluğunu gösteren diğer geleneksel olarak kullanılan yöntemlere göre daha derinlemesine ve vasküler parametrelerin fizyolojik doğru kantitatif sağlamak, hakim edilir. In vivo görüntüleme yöntemi de dahil olmak üzere diğer parametrelere çalışması için izin verir, aynı zamanda uzunlamasına çalışmalarda incelenmelidir mümkün olabilir, kırmızı kan hücresi hızı, arteriol genleşme ve kırmızı kan hücresi akı 7,12 ancak bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, kolayca adapte ve beyin mikrovasküler yapısı ile ilgili araştırma soruları incelemek için modifiye edilebilir. Bu tür çalışmalar, diğer bilişsel hastalıklarda kılcal morfolojisi patojenik değişiklikler miktarlarının veya kılcal yoğunluğunda yaşa bağlı değişiklikleri ölçerek içerebilir. Bu nedenle, bu makalede sunulan yöntem Quantität için çok yönlü ve güçlü bir araçtırserebral damar yapılarının ive analizi.

İnsan Bağışıklık Yetmezliği Virüsü 1 (HIV-1) virüs enfeksiyonunun akut fazında beyni işgal ve verimli onların aktivasyon yol mikroglia ve beyin ikamet makrofajlar hem bozar - ve her iki konak kaynaklı inflamatuar mediatörlerin ve çözünür HIV-1 serbest bırakma Böyle Tat ve (1,2 gözden) gp120 olarak virotoxins. Sonuç olarak, kronik nöroenflamatuar devlet HIV-1 İlişkili Nörokognitif Bozuklukları (EL) 3-5 patogenezine katkıda düşünülmektedir MSS içinde kurulmuş olur. HIV-1 Tat veya farelerin merkezi sinir sistemi içinde, interlökin (IL) -17A arasında kronik aşırı mikrovasküler seyrelmesi 6,7 ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu kronik Nöroenflamasyon serebral damarlarda üzerindeki etkileri yoluyla EL patogenezine katkıda bulunabileceği ihtimalini yükseltir. Ayrıca bu soruyu incelemek için, biz serebral vasküler yapıda çalışılmıştır ölçmek için yöntemler geliştirmişlerdirtures. Bu kağıt, kademeli bir uzunluğu, toplam kademeli bir uzunluk ve ortalama kılcal çap ve ince bir kafatası kortikal pencereden kılcal ağ şebekeleri in vivo görüntüleme kullanılarak total kılcal hacmi ve ortalama kılcal düğümleri, kılcal kesimlerinin sayısı ölçülmesi için bir yöntem tarif eder (daha önce tarif edilen modifiye protokolleri) 8,9, hem de iki foton mikroskopi kullanılarak beyin bölümlerinin ex vivo görüntüleme. In vivo ince kafatası kortikal pencere serebral çevrenin korunması için izin verir çünkü beyin dilimleri kılcal ağları ex vivo görüntüleme rekonstrüksiyonu sağlarken Bu kombine yaklaşım, serebral vasküler parametrelerin bütünsel bir kantitatif sağlar üç boyutlu, tam kılcal ağ şebekeleri, - daha sonra ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak belirlenebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Leica Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MZ8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High Intensity Illuminator</td>
			<td style="width:105px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:105px;">Stryker&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TP3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">T/PUMP</td>
			<td style="width:105px;">Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">TEC-4 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:105px;">Datex Ohmeda</td>
			<td style="width:119px;">447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Artificial Tear Gel</td>
			<td style="width:105px;">Butler AHS</td>
			<td style="width:119px;">7312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Povidone-Iodine solution&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aplicare</td>
			<td style="width:119px;">52380-1855-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumot #5 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Ferric Chloride Solution</td>
			<td style="width:105px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">3120-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td>
			<td style="width:105px;">Henkel</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dental Cement</td>
			<td style="width:105px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Microtoruqe II Handpiece Kit</td>
			<td style="width:105px;">Pearson Dental</td>
			<td style="width:119px;">R14-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">005 Burr for Micro Drill</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Norland Blade (Dental Microblade)</td>
			<td style="width:105px;">Salvin Dental</td>
			<td style="width:119px;">6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Urethane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td>Group 2B Carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Braided Suture</td>
			<td style="width:105px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">735G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">&#160;Arterial Catheter</td>
			<td style="width:105px;">SAI Infusion Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MAC-01</td>
			<td>The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Moniter</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-BP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Transducer and Cable</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RAPIDLab Blood Gas Analyzer&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Siemens&#160;</td>
			<td style="width:119px;">248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">40 &#956;l Capillary Tube</td>
			<td style="width:105px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">15401-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td style="width:105px;">Zivic Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olypmus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000 MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td>
			<td style="width:105px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:105px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Amira Software</td>
			<td style="width:105px;">Visage Imaging&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

İnce kafatası kortikal pencere kortikal kılcal damarların in vivo iki foton görüntüleme (Şekil 1) sağlar. Görüntüye uygun alan çok sayıda, farklı kılcal (Şekil 1A) gösterir. Aynı görüş alanında, herhangi bir arteryel hücre duvarı otofloresansı vardır ve ikinci harmonik üretimi 11 (Şekil 1B) ile indüklenen örneğin kolajen floresan gibi diğer floresan sinyalleri, söz konusu olabilir. Beyin dilim hazırlanması işlemi tamamlandıktan sonra, yaklaşık 1.5 mm orta hat bulunan bir görüntüleme alanı (Şekil 2A). Bir 100 um z yığın Witt analitik yazılım (Şekil 2B) analiz için kullanılan üç boyutlu bir görüntü elde edilir. Kapiller ağ daha sonra elle başında ve bir kılcal sonunda, ya da herhangi bir yerde, bir kılcal b düğümleri koyarak izlenirBaşka (Şekil 2C) içine çiftliklerde. Bu morfolojik parametreleri otomatik olarak ekstre edildiği, tamamen iskeletize görüntü (Şekil 2D) üretir. Kılcal düğümleri, segment sayısı, bölüm uzunluğu, toplam bölüm uzunluğu ve fare beyin dilimleri iki foton ex vivo görüntüleme kullanarak elde edilebilir toplam kılcal hacmi (Şekil 2) anlamına gelir. Şekil 3 bu yazıda sunulan yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, HIV nöro bir transjenik fare modeli 10 kullanılmıştır. Tat virotoxin HIV üretimi 12 hafta boyunca doksisiklin infüzyon gıda Tat + farelerinde indüklenmiştir. Kontrol grubu aynı yemek beslenen Tat- littermates oluşuyordu. Ölçülen kılcal parametrelerden herhangi Tat + ve Tat- fareler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Böylece, beynin 12 haftalık maruziyet tisHIV-1 Tat dava beyin mikrovasküler yoğunluk azalmasını oluşması için yeterli değildir. Buna karşılık, bizim önceden yayınlanmış veriler daha serebral damarlarda 7 rarefaction Tat sonuçları kronik CNS ifadesini uzamış (20 hafta) olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, burada gösterilen veriler (Şekil 3), merkezi sinir sistemi içinde, farelerin Tat ile indüklenen vasküler yeniden kinetiği açısından değerli, yeni bilgi sağlar. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig1.jpg" /> Kortikal kılcalın Şekil 1. kazanılması. (A) ince bir kafatası kortikal penceresi hazırlanmasını ve intravenöz fluoresan boya enjeksiyonu takiben, iki foton mikroskopi görüntüsü serebral damar için kullanılmıştır. Deneylerde, biz 780 nm&#39;de heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan ve floresans emisyon filtresi bandpass 607/36 bir geçiş görselleştirildi. <strong&gt; (B) aynı görüş alanı emisyon bandpass filtresinin 480/20 a ile tespit hiçbir arteriyel otofloresans göstermelidir. Ikinci harmonik üretimi diğer floresan sinyalleri filtrelerden 11 üzerinden görünmesini neden olabilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53582/53582fig2.jpg" /> Iskeletize kılcal ağ şebekeleri Şekil 2. nesil (A). Fareler damardan bir floresan boya ile enjekte edildi ve kurban edildi. Beynin bir 2 mm koronal kısmı bregma 0 ve bregma -2 arasında alındı ​​ve görüntüleme orta hat 0 bregma yaklaşık 1,5 mm gerçekleştirilmiştir. A Bir C57BL / 6 fare görüntüleme (kara kutu) için seçilen kortikal konumu temsili görüntü gösterilir. Bu bölge, somDaha önce Tat + farelerinde 12 bu bölgede oluşabilir, serebral kan bu düzensizliği göstermiştir, çünkü atosensory korteks seçildi. (B) kılcal ağ şebekeleri Temsili üç boyutlu z yığın ve görüntüler. (C) Diyagram yönteminin El ile izlemek için kullanılan damar ölçümü sırasında kılcal damarlar. (D) iskeletize z-yığın görüntü Temsilcisi görüntü. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53582/53582fig3.jpg" /> Tat Besin virotoxin aday HIV maruz kalan farelerin karşı Tat- farelerde serebral vasküler mimari Şekil 3. Kantitasyonur 12 hafta sonra. astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgeni olan fareler üzerinde HIV-1&#39;in neden olduğu nöro etkisini incelemek için kullanılmıştır serebral vasküler bir yapı olarak tarif 7. Bu fareler (Tat +, n = 3) Tat indüksiyon kronik (12 hafta) rejimine maruz bırakıldı (DOX yani., 12 hafta). Tat- fareleri (n = 4), (bu fareler, HIV-1 Tat eksprese etmeyen nedenle Tat + farelerin transgenik olmayan littermates karşılık gelir ve) yaş uyumlu kontrol olarak kullanılmıştır. Tat + fareler gibi, Tat- fareler de DOX maruz kalma 12 hafta aldı. O Tat (Tat-) maruz kalmamış karşı 12 hafta (Tat +) için Tat maruz kalan farelerde, düğümler (A) sayısında anlamlı bir fark, segment sayısı (B), bölüm uzunluğu ortalama oldu (C), ya da toplam kapiler uzunluğu (D), kılcal çap (üzereTat + fareleri, biz 6 görüntüleme alanlarında 14 kılcal damarları incelendiğinde; Tat- fareler için), biz 4 görüntüleme alanlarda 7 kılcal) (E) analiz, ya da toplam kapiler hacmi (F. Veriler normal (Shapiro-Wilk testi ile belirlendiği gibi) dağıtılan değildi bu yana, tam Wilcoxon rank sum testi (p &lt;0.05 olarak bu durumda belirlenen) istatistiksel olarak anlamlı. Hesaplamak için kullanılan <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu rakam.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation at JoVE.com

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Görüntüleme.  University of Rochester Medical Center. This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Video: Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Nörobilim

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

In vivo üç boyutlu Iki-foton mikroskobu çalışma bir cam mikro-pipet kullanarak yerel ATP ejeksiyon tarafından vasküler tepkiler yürütülen eğitim

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...