Name: validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner at JoVE.com

Yazarlar (Bölüm Göz ve Görsel Bilimler) Tıp St. Louis Okulu Washington Üniversitesi&#39;nde Fare Genetik Core Moleküler Genetik çekirdek, Morfoloji ve Görüntüleme çekirdeğinin çalışanlarına teşekkür ederiz. Yazarlar Cellular için McDonnell Merkezi ve Moleküler Nörobiyoloji, Sinir Hastalıkları Umut Merkezi&#39;nden küçük hibe programı tarafından desteklenen, Ulusal Göz Enstitüsü (DH # R01EY022632), Ulusal Göz Enstitüsü Merkezi Çekirdek Grant (# P30EY002687) ve Research sınırsız hibe Göz ve Görsel Bilimler Bölümü&#39;ne Körlük Önlemek için.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler St. Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Fare Islahı ve Genotiplendirme <ol><li> (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 Tg üretmek için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Tg fareler (PCP2-Cre) fareler Breed. Not: Bu protokol kalanı serebellumdaki Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 ekspresyonunu sınırlamak için Tg (PCP2-Cre) fare hattı kullanımı üzerinde odaklanmasına rağmen, benzer bir prosedür başka Tg (Cre) fare ile takip edilebilir ( Şekil 2A). </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 19 hem EGFP ve Cre transgenini barındıran yavrular tanımlamak için genotipleme gerçekleştirin. </li></ol> Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu için Materyallerin 2. Hazırlık <ol><li> -20 ° C&#39;de% 30 PBS sükroz (1x PBS 30 g sükroz / 100 mi) ve deposunun 100 ml hazırlayın. Doku h günlüktranscardial perfüzyonları bir 35 ml şırınganın içine arvesting, çözündürme ve sukroz çözeltisi yük ~ 30-35 ml olmuştur. </li><li> PBS içinde% 4 PFA 40 ml (10 mi,% 16 paraformaldehit ve 30 ml PBS) hazırlayın. Transcardial perfüzyonları için 35 ml şırınganın içine Yük ~ 30-35 ml% 4 PFA. </li><li> Doku diseksiyon 10 ml PBS ile bir 10 cm&#39;lik bir doku kültürü plağı doldurun. </li><li> 16 mg / ml ketamin ve 3 mg / ml ksilazin içeren bir ketamin / ksilazin kokteyli hazırlanır. </li><li> Diseksiyon için% 70 etanol içinde bir çözelti hazırlayın. </li></ol> 3. Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu <ol><li> Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga kullanılarak, vücut ağırlığının her 25 gramı için, ketamin / ksilazin kokteyli 500 ul enjekte edilir ve 15 dakika ~ bekleyin. Alternatif olarak, ilgi biyolojik sistemine uygun olan başka bir kurumsal onaylı sedasyon yöntemi kullanın. </li><li> Sedasyon üzerine hafifçe dorsal tarafı ile strafor tepsi üzerinde tüm pençeleri pin, ağrı yanıtı eksikliği onaylamak için arka pençe tutamfare aşağı bakacak. </li><li> % 70 etanol ile karın Sprey ve kalp erişmek için göğüs kafesinin üst alt karın bir kesi yapmak. </li><li> Kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve kalbin sol ventrikül içine% 30 sukroz çözeltisi içeren şırınga yerleştirin. </li><li> ~ 2-5 mi başına dakika bir hızda çözelti serpmek. Ne zaman boş şırınga kaldırmak ve% 4 PFA çözümü ile tekrarlayın. </li><li> Strafor tepsiden fare sabitlemesini ve beyin erişmek için başını kesmek. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak hayvanın başının etrafında deri kaldırmak. Bir iğne ile kafatasının arka kısmında bir delik Poke ve dikkatli makas ve kesme forseps ile kafatası çıkarın. </li><li> Beyin açıkça erişilebilir bir kez, beyincik kaldırmak ve PBS içinde yerleştirmek için forseps kullanabilir. Bir neşter ile sajital düzlemde beyincik iki eşit parçaya böler ve 4 ° C&#39;de bir gece% 30 sukroz çözeltisi aktarın. Not: hazırlık içinparafin kesitler vardır öncesinde doku gömme ve kesit için% 4 PFA 4 ° C&#39;de gece boyunca beyincik sabitleyin. </li></ol> 4. Doku İşleme ve Kesit <ol><li> Kuru buz ve 2-metil bütan içeren bir bulamaç hazırlanır. Banyosunun sıcaklığı 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> OCT bileşiği ile cryomold doldurun ve kalıba iki eşit parçaya bölünmüş beyincik yarısı yerleştirin. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu ve forseps pozisyon bir çift (beyincik orta hat yakınında) iki eşit parçaya bölünmüş bir yüzey yukarı bakacak şekilde beyincik kullanma. </li><li> Ekim bileşiği, bir doku numunesinin yaklaşık beyaz bir katı matris oluşana kadar 5 dakika boyunca kuru buz bulamaca cryomold aktarın. Not: Gerekirse dondurulmuş numune hemen -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Etiket cere 15 mikron bölümleri toplamak amacıyla üreticinin talimatlarına göre, doku bölümleri toplamak için poli-lisin slaytlar tedavi edilen ön ve Kriyostat hazırlanmasıbellum. Bölümleri toplamak için dikkatle slayt poli-lizin kaplı tarafı Ekim bölümüne başvurun. Bölümünün yönünü korumak için, bu aşama esnasında slayt dönmez. </li><li> Boyama ve görüntüleme ile devam kadar -20 ° C&#39;de saklayın doku bölümleri. </li></ol> 5. Boyama ve Beyincik Bölümlerin Görüntüleme <ol><li> Doku boyamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın: PBS ~ 50 mi ~ PBS içinde% 4 PFA 5-10 mi ~ PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu 10-20 mi </li><li> Çözülme serebellar kesitler. Önemli olarak, EGFP solmasının engellenmesi için, sürekli ve yoğun herhangi bir ışık kaynağı maruz kaldıkları en aza indirir. </li><li> Hidrofobik bir bariyer kalemini kullanarak, doku kesitlerinde etrafına bir dikdörtgen çizin. </li><li> 5 dakika boyunca% 4 PFA ile bölümleri Post-fix. Hidrofobik bariyer (genellikle ~ 500 ul) tarafından tarif tüm alanı kapsayacak şekilde yeterli sıvı kullanın. , Bir vakum ya da pipet yeniden kullanmasabitleştirici doku kesitlerinde rahatsız etmemek için özellikle dikkatli olmak taşıyın. </li><li> Bir pipet ile hafifçe doku bölümleri bozmadan slayt PBS uygulanır. 5 dakika sonra dikkatlice sıvıyı çıkarmak için vakum veya pipet kullanın. PBS üç kez toplam durulama tekrarlayın. </li><li> Bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde, PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu (çözeltisi 900 ul başına 3 ul kalbindin ve / veya Nesprin2 antikoru) uygun bir primer antikor seyreltme uygulanır. Karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir. Not: EGFP-KASH2 dondurulmuş kesitler üzerinde doğrudan floresan mikroskobu ile görünür olacaktır, ve bir anti-EGFP antikor kullanılması gerekli değildir. Parafin kesitleri hazırlanmış, ancak EGFP-KASH2 görüntüleme, bir anti-EGFP antikor ile immunodeteksiyon gerektirir. </li><li> Antikor çözüm çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 1 Hazırlama:% 0.5 Triton X-100 içinde Alexa Fluor sekonder antikor seyreltileri 1000,Karanlıkta% 10 eşek PBS serum ve mağaza. </li><li> Yavaşça Nihai PBS durulama çıkarın ve karanlıkta bir saat süreyle ikincil antikor seyreltme uygulanır. </li><li> Ikincil antikor çözüm çıkarın yıkayın ve bölüm üç kez yıkayın. Gerekirse, ilk PBS uygulama esnasında, örneğin DAPI (~ 300nM) olarak nükleer leke, uygulanır. </li><li> Tamamen doku ve doku bölümünde medya montaj yeri ~ 5-7 ul yerinden PBS çözüm kaldırmak. Doku bölümünün üstünde bir cam lamel yerleştirin ve karanlıkta, oda sıcaklığında ~ 15-30 dakika boyunca bekletin. </li><li> EGFP ve adımları 5,8 / 5,9 kullanılan ikincil antikorlar için uygun olan herhangi bir başka dalga boylarını görselleştirmek için uygun filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanın. Serebellar dilimleri, EGFP-KASH2 nükleer jantlar görüntülemek için bir 20X objektif kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins:+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression?+Nature+reviews.">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li><li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+lamins:+their+structure,+assembly,+and+interactions.">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li><li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton.">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li><li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein.">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li><li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton.">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li><li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei.">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li><li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration.">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li><li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enaptin,+a+giant+actin-binding+protein,+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton.">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li><li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization.">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+outer+nuclear+membrane+protein,+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin.">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li><li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells.">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+protein+Syne-2/Nesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1/2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development.">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation.">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage.">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li><li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness.">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1/2+and+Syne/Nesprin-1/2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice.">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo.">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I.">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li><li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

En kritik aşama başarılı Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modeli, uygun bir Cre fare hattı (ler) i belirlemek için kullanıldığı in vivo LINC komplekslerinin rolünü incelemek için. Cre içindeki yollar yer alan diğer hücre tiplerinde aktif Gerçekten de, eğer, bu sonuçların yorumunu komplike olabilir. Beyincik (Şekil 2B), moleküler ve granül hücre katmanlarında burada gösterildiği gibi Dolayısıyla, bu, at hücreleri incelemek için önemlidir. Aynı şekilde, herhangi bir fizyolojik ilgili fenotipleri maksimize etmek o ilgi hücre tipi genelinde yaygın Cre ifade ile bir Cre zorlanma tespit etmek önemlidir. Bu ilgi sisteminin gelişimi sırasında LINC karmaşık bileşenlerin ekspresyon şablonunun derinlemesine bir karakterizasyonunda üstlenmek için önem taşır. Nitekim, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinin bir dezavantajı Güneş proteinleri veya Nesprins varyantları biyolojik sistemine dahil olduğunuz gibi herhangi bir bilgi sağlamaz under dikkate. Ancak, bu konu hem transkript ve protein düzeylerinde sıkı bir karakterizasyonu üstlenerek aşılabilir. Aslında, bu tür çalışmalar MSS gelişimi sırasında belirli Linc karmaşık bileşenlerin rolü hakkında önemli bulgulara yol açan ve 21,22 homeostazı çeşitli vesilelerle ele alınmıştır. Bu protokol, sabit merkezi sinir dokularının kullanılması üzerine odaklanmıştır getirirken, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fareler, in vitro olarak LINC kompleksleri kesintiye etkisini araştırmak için izole etmek ve kültürü birincil hücreler için de kullanılabilir. Bu düzen, daha izole etmek ve bu zaman atlamalı bir video mikroskobu gibi uygulamalar için EGFP-KASH2-pozitif hücrelerinin primer kültürleri arıtmak mümkündür. Bu nöronlar gibi düşük transfeksiyon verimlilik veya primer kültür sistemleri için gerekli olan lentiviral üretim, atlar. Özetle, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fareler eğlenceli incelemek için yeni ve heyecan verici olanaklar açmakdoku ve hücre tipleri çok çeşitli embriyonik ve postnatal memeli gelişim süreçleri sırasında in vivo Linc komplekslerinin ction temel hücre biyolojisi soruları için.

Nükleer zarf (NE) Sitoplazmadan nükleolazma ayırır. Nükleer gözeneklerin bağlamak bir iç ve bir dış çekirdek zarı (INM sırasıyla Onm,) oluşmaktadır. Her iki membranlarla tarif lümen perinükleer alanı (PNS) olarak adlandırılır. Onm granüllü endoplazmik retikulum (ER) bir uzantısı olan ve INM nükleer lamina yapışır, A ve B tipi ile temsil edilen çekirdek tip V ara ipliklerin bir ağ örgüsü 1,2 lamins. Nucleoskeleton ve hücre iskeleti (LINC) komplekslerinin bağlayıcılar fiziksel iskelet ipliklerin ve moleküler motorlar (Şekil 1A) çekirdeğin iç bağlamak için bütün çekirdek zarfı kapsayan makromoleküler monte edilmiş halleridir. Güneş (Sad1 / Unc84) proteinler ve Nesprins (Nükleer Zarf SPectRINS): Bunlar KD ayrılmaz transmembran proteinlerinin iki aileyi karakterize evrimsel korunmuş motiflerinin arasındaki etkileşimleri oluşur. Memelilerde, Sun1 ve Sun2 arN-terminal bölgesi nucleoplasmic A ve B tipi lamins 3-5 ile doğrudan etkileşip etkileşmediği INM e transmembran proteinleridir. PNS içinde INM diğer tarafında, Sun proteinler 150 C-terminal amino asitler, SUN alanı adı verilen ~ evrimsel korunmamış streç barındırır. SUN etki evrimsel korunmuş Kash ile doğrudan etkileşim (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) etki, Nesprins moleküler imza. Kash etki, bir zar geçiş alanı 6 ve ardından PNS içine çıkıntı ~ 30 C-terminal amino asidi bir streç oluşur. En az dört farklı Nesprin genler (Nesprin1-4) NE 7 lokalize proteinler Kash içeren kodlar. Şaşırtıcı bir 1000 kDa (Nesprin1 dev) için boyutları değişir ~ 50kDa (Nesprin4) den Nesprins, sitoplazmik bölgeleri, çoklu spektrin gibi aktin, plectin ve moleküler motorlar 8- olarak iskelet bileşenleri ile etkileşimi sağlayarak tekrar yanı sıra özel motifler içeriyor 13. &lt;omurgalı ve omurgasız p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Araştırmalar Lamin / Güneş / Nesprin / moleküler motorlar bir evrimsel olarak korunmuş &quot;eksen&quot; nükleer göç ve ankraj kontrol teşkil ettiğini göstermiştir. Linc karmaşık bileşenlerin çeşitli knock-out (KO) fare modelleri tanımlanmış ve memeli gelişim 9,14,15 sırasında KD Sun ve Nesprin proteinlerinin rollerini anlamak için bir çerçeve sağlayan aracı vardı oylandı. Ancak, bu modeller en önemlisi mevcut birçok önemli sakıncaları: of fenotipik katkılarını ayırt olmayan özerk etkileri, 2) zorluk hücre nedeniyle fenotipleri yorumlarken 1) zorluk Kash-az Nesprin vs Kash içeren, 3) 16 izoformları Çok sayıda hücre tiplerinde NE Sun ve Nesprin proteinlerin işlevsel fazlalık hem Kash-etki alanı için eksik farelerde 17 tüm SUN-Kash etkileşimleri ve farelerin 4) perinatal öldürücülüğü inaktive karmaşık ıslah planları gerektirirNesprins1 ve 2 yetişkin analizi 18 fenotip engellemektedir. Bu protokol, böylece yukarıda özetlenen sakıncaları birçok atlayarak bir hücre özerk ve gelişimsel olarak düzenlenen bir şekilde in vivo tüm SUN-Kash etkileşimleri bozmak için tasarlanmış yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu Cre / lox tabanlı fare modeli, iki önemli kavramları dayanır: 1) bilinen herhangi bir Nesprin proteininin Kash alanı hücre kültür sistemlerinde KD EGFP hedef ve 2) SUN etki fazla sentezlenmesi, böylece, Kash etki alanları ile etkileşime promiscuously için yeterlidir Herhangi Kash etki tüm endojen Paz etki doyurmak ve dominant-negatif bir şekilde 17 (Şekil 1B) Linc kompleksleri inaktive edecek. Bu protokol, doku hasat ve serebellar Purkinje hücrelerinde tüm SUN-Kash etkileşimlerinin bozulması doğrulamak için kullanılan işlem adımları açıklar.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Slides</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antibody</td><td></td><td></td><td>Previously described in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Bu protokol, Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak beyincik Purkinje hücreleri için EGFP ekspresyonu KASH2 kısıtlamak için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinde yararını göstermektedir. Tg olarak (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-pozitif kenarı benzeri deseninin gösterdiği gibi, EGFP-KASH2 çekirdek zarfına hedeflenmektedir. Herhangi bir fizyolojik fenotipi en üst düzeye çıkarmak için, bir hücreye özel bir antikor işaretleyici ile birlikte boyandı EGFP-KASH2 pozitif hücrelerin yüzdesi hesaplanarak EGFP-KASH2 hedeflenen hücrelerin büyük bir çoğunluğu ifade sağlamak için önemlidir. Bu örnekte, EGFP-KASH2 sentezleme Calbindin pozitif Purkinje hücreleri (Şekil 2B) daha fazlasını,% 70 tespit edilmiştir. Bu Klima cihazlara iseleri, biz 10 aylık Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) fareler 20 önemli histolojik veya davranışsal fenotipleri dikkat etmedi. Bu, herhangi bir morfolojik veya davranışsal fenotip istenmeyen hücre tipi / doku EGFP-KASH2 ektopik ekspresyonu nedeniyle değil sağlamak için önemlidir. Bu açıdan için EGFP-KASH2 tanecik hücre katmanlarında ya da Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Şekil 2B) moleküler tabakasında gözlenmedi. Son olarak, EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerde Linc karmaşık bozulma derecesini onaylamak için hayati önem taşımaktadır. Bu EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerin, KD bunların yerinden vurgulamak yüksek kaliteli anti-Nesprin antikorlar kullanılarak elde edilebilir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 Reta ifade ettiklerini ise, endojen Nesprin2 EGFP-KASH2 eksprese Purkinje hücrelerinin çekirdek zarfına (Şekil 3 üst panel, san oklar) kaydırılırNükleer zarf endojen Nesprin2 (Şekil 3 üst panel, beyaz ok). Beklendiği gibi, Cre rekombinaz-ifade etmeyen kontrol litermatlarının, bütün Purkinje hücresi nüfusu (Şekil 3, alt beyaz oklar) nükleer zarfa Nesprin2 gösterir. Çeşitli raporlar, artık bu tür iskelet kas lifleri ve koni fotoreseptörlerin 19,21 gibi ek doku ve hücre tipi endojen Nesprins, yer değiştirmesi eşlik EGFP-KASH2 ekspresyonunu, doğruladı. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> Şekil 1. Linc kompleksleri sitoskeletona çekirdeği bağlamak ve EGFP-KASH2 aşın tarafından bozulur. Sitoplazmik sitoskeletona çekirdeğin içinin bağlamak Linc kompleksleri (A) Tasvir. SUN etki Kash alanları ile promiscuously etkileşim unutmayınTüm Nesprins den (Nesprins 1-4). EGFP-KASH2 (B) aşırı ekspresyonu, böylece çevredeki sitoplazmik iskeletinin gelen çekirdek kesme, bir baskın negatif bir şekilde, ER çekirdek zarfına endojen Nesprins değiştirir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Tg (PCP2-Cre) Tg fareler sonuçları (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) yavrular Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ve EGFP-KASH2 Şekil 2. aşırı ekspresyonu özellikle serebellar Purkinje hücreleri hedefleyen. (A) Damızlık burada Cre rekombinaz beyincik Purkinje hücreleri spesifik olarak ifade edilir. İfade (P6) üzerine, Cre rekombinaz bu LacZ ORF excises ve EGFP-KASH2 ekspresyonunu indükler çekirdek içine geçiş yapar. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) fareler özellikle serebellar Purkinje hücrelerinde IDENTIF EGFP-KASH2 ekspresKalbindin ile ied (kırmızı renkli). Moleküler tabakasının her iki serebellar granül nöronlar ve ara EGFP-KASH2 ifadesi için negatif olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: Mol: Moleküler tabaka PCL: Purkinje hücre tabakası ve GCL: Granül hücre tabakası. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> Şekil serebellar Purkinje hücrelerinde endojen Linc komplekslerinin 3. bozulması. EGFP-KASH2 Tek konfokal düzlemi gösteren ifade Purkinje hücrelerinin çekirdek zarftan (kırmızı renkli) endojen Nesprin2 (üst sarı oklar) değiştirir. EGFP-KASH2 ifadesini eksik Purkinje hücreleri nükleer zarf endojen Nesprin2 (beyaz ok üst) korumak olduğunu unutmayın. Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol littermates, hiçbir EGFP sinyali görülmektedir ve Nesprin2 tüm Purki nükleer zarf tespit edilir Bu protokol yararlılığını göstermektedirTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modeli Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak serebellar Purkinje hücrelerine EGFP-KASH2 ifade özgürlüğünü kısıtlamaya. Tg olarak (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-pozitif kenarı benzeri deseninin gösterdiği gibi, EGFP-KASH2 çekirdek zarfına hedeflenmektedir. Herhangi bir fizyolojik fenotipi en üst düzeye çıkarmak için, bir hücreye özel bir antikor işaretleyici ile birlikte boyandı EGFP-KASH2 pozitif hücrelerin yüzdesi hesaplanarak EGFP-KASH2 hedeflenen hücrelerin büyük bir çoğunluğu ifade sağlamak için önemlidir. Bu örnekte, EGFP-KASH2 sentezleme Calbindin pozitif Purkinje hücreleri (Şekil 2B) daha fazlasını,% 70 tespit edilmiştir. Bu koşullarda, herhangi bir önemli histolojik ya behaviora gözlenmedi10 aylık Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) farelerde 20 l fenotipleri. Bu, herhangi bir morfolojik veya davranışsal fenotip istenmeyen hücre tipi / doku EGFP-KASH2 ektopik ekspresyonu nedeniyle değil sağlamak için önemlidir. Bu açıdan için EGFP-KASH2 tanecik hücre katmanlarında ya da Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Şekil 2B) moleküler tabakasında gözlenmedi. Son olarak, EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerde Linc karmaşık bozulma derecesini onaylamak için hayati önem taşımaktadır. Bu EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerin, KD bunların yerinden vurgulamak yüksek kaliteli anti-Nesprin antikorlar kullanılarak elde edilebilir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, endojen Nesprin2 EGFP-KASH2 eksprese Purkinje hücrelerinin çekirdek zarfına (Şekil 3 üst panel, san oklar) kaydırılır EGFP-KASH2 çekirdek zarfına endojen Nesprin2 korumak ifade yoktur Purkinje hücreleri (Şekil ise 3 </strong&gt; üst panel, beyaz ok). Beklendiği gibi, Cre rekombinaz-ifade etmeyen kontrol litermatlarının, bütün Purkinje hücresi nüfusu (Şekil 3, alt beyaz oklar) nükleer zarfa Nesprin2 gösterir. Çeşitli raporlar, artık bu tür iskelet kas lifleri ve koni fotoreseptörlerin 19,21 gibi ek doku ve hücre tipi endojen Nesprins, yer değiştirmesi eşlik EGFP-KASH2 ekspresyonunu, doğruladı. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> Şekil 1. Linc kompleksleri sitoskeletona çekirdeği bağlamak ve EGFP-KASH2 aşın tarafından bozulur. Sitoplazmik sitoskeletona çekirdeğin içinin bağlamak Linc kompleksleri (A) Tasvir. O Paz etki tüm Nesprins (Nesprins 1-4) den Kash alanları ile promiscuously etkileşim unutmayın. (B) aşırı ekspresyonu of EGFP-KASH2 böylece çevredeki sitoplazmik hücre iskeletinin gelen çekirdeğini çıkardıktan bir dominant negatif moda, ER nükleer zarf endojen Nesprins değiştirir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Tg (PCP2-Cre) Tg fareler sonuçları (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) yavrular Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ve EGFP-KASH2 Şekil 2. aşırı ekspresyonu özellikle serebellar Purkinje hücreleri hedefleyen. (A) Damızlık burada Cre rekombinaz beyincik Purkinje hücreleri spesifik olarak ifade edilir. İfade (P6) üzerine, Cre rekombinaz bu LacZ ORF excises ve EGFP-KASH2 ekspresyonunu indükler çekirdek içine geçiş yapar. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Özel Kalbindin ile özdeşleşmiş serebellar Purkinje hücrelerinde EGFP-KASH2 ifade eden fareler () kırmızı renkli. Moleküler tabakasının her iki serebellar granül nöronlar ve ara EGFP-KASH2 ifadesi için negatif olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: Mol: Moleküler tabaka PCL: Purkinje hücre tabakası ve GCL:. Granül hücre tabakası <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> Şekil serebellar Purkinje hücrelerinde endojen Linc komplekslerinin 3. bozulması. EGFP-KASH2 Tek konfokal düzlemi gösteren ifade Purkinje hücrelerinin çekirdek zarftan (kırmızı renkli) endojen Nesprin2 (üst sarı oklar) değiştirir. EGFP-KASH2 ekspresyonunu yoksun Purkinje hücreleri, çekirdek zarfına endojen Nesprin2 korumak (katiyen Note) Üst ok. Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol littermates, hiçbir EGFP sinyali görülmektedir ve Nesprin2 tüm Purkinje hücreleri (beyaz oklar alt) nükleer zarf tespit edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner at JoVE.com

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Video: Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Gelişim Biyolojisi

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Davranış

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all females are heterozygous for X-linked gene expression. One of the key regulators of XCI is Xist, which is essential for the initiation and maintenance of XCI. Previous studies have identified 13 trans acting X chromosome inactivation factors (XCIFs) using a large-scale, loss-of-function genetic screen. Inhibition of XCIFs, such as ACVR1 and PDPK1, using short-hairpin RNA or small molecule inhibitors, reactivates X chromosome-linked genes in cultured cells. But the feasibility and tolerability of reactivating the inactive X chromosome in vivo remains to be determined. Towards this goal, a Xist&#916;:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp mouse model has been generated with non-random XCI due to deletion of Xist on one X chromosome. Using this model, the extent of inactive X reactivation was quantitated in the mouse brain following treatment with XCIF inhibitors. Recently published results show, for the first time, that pharmacological inhibition of XCIFs reactivates Mecp2 from the inactive X chromosome in cortical neurons of the living mouse brain.

Here, we describe a protocol to generate a viable female murine model with non-random X chromosome inactivation, i.e., the maternally-inherited X chromosome is inactive in 100% of the cells. We also describe a protocol to test feasibility, tolerability, and safety of pharmacological reactivation of the inactive X chromosome in vivo.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Nörobilim

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Prostat Kanseri

Hayvan modeli çalışmaları

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

Source: Pang, X., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64059">A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Source: Pang, X., et al. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. ...

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla