המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. 1. גידול העכבר וGenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרבות עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) עכברים עם Tg (PCP2-Cre) לייצר Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. הערה: בעוד שאר פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בקו Tg העכבר (PCP2-Cre) כדי להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי פורקינג בתוך המוח הקטן, הליך דומה יכול להיות אחריו עם כל עכבר אחר Tg (Cre) ( איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע genotyping לזהות גורי מחסה שני transgenes EGFP וCre כפי שתואר קודם לכן 19. </li></ol> 2. הכנת חומרים לאוסף Dissection ורקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של סוכרוז 30% PBS (30 סוכרוז גרם / 100 של 1x PBS מיליליטר) ולאחסן 100 מיליליטר ב -20 ° C. היום של ח הרקמהarvesting, הפשרה ועומס ~ 30-35 מיליליטר של תמיסת סוכרוז לתוך מזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של PFA 4% בPBS (10 מיליליטר 16% paraformaldehyde ו -30 מיליליטר PBS). טען ~ 30-35 PFA מיליליטר של 4% למזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לנתיחה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל קטמין / xylazine בהיקף של 16 מ&quot;ג / מיליליטר קטמין ו -3 מ&quot;ג / מיליליטר xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 70% אתנול לנתיחה. </li></ol> 3. Dissection ואוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מיליליטר, להזריק 500 μl של קוקטייל קטמין / xylazine לכל 25 גרם של משקל גוף ולחכות ~ 15 דקות. לחלופין, להשתמש בשיטת הרגעה אישרה מוסדי אחרת שמתאימה למערכת הביולוגית של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ההרגעה, בעדינות לצבוט כפה האחורית כדי לאשר את חוסר תגובה לכאב, להצמיד את כל כפות על מגש קלקר עם צד הגב שלהעכבר כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הבטן עם 70% אתנול ולעשות חתך מהבטן התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות כדי לקבל גישה ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעלייה הימנית של הלב ולהכניס את המזרק המכיל תמיסת סוכרוז 30% לתוך החדר השמאלי של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הפתרון בשיעור של ~ 2-5 מיליליטר לדקה. כאשר ריק, להסיר את המזרק וחזור עם 4% פתרון PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא סיכה העכבר ממגש הקלקר ולערוף כדי לגשת למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור סביב ראשו של בעל החיים באמצעות מלקחיים ומספריים. נקבו חור בחלק האחורי של הגולגולת עם מחט ולהסיר בזהירות את הגולגולת עם מספריים ומלקחיים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח הוא בבירור נגיש, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח הקטן ולמקם אותו ב- PBS. לחצות את המוח הקטן במטוס sagittal עם אזמל ולהעביר לפתרון סוכרוז 30% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. הערה: כדי prepהקטעים פרפין, לתקן את המוח הקטן לילה ב 4 מעלות צלזיוס PFA 4% לפני הטבעה וחתך רקמות. </li></ol> 4. עיבוד רקמות וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרחיף של קרח יבש ווטאן 2-מתיל. לאפשר את הטמפרטורה של האמבטיה לאזן במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא cryomold עם מתחם OCT ולמקם את מחצית המוח הקטן החצוי לתבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח וזוג מלקחיים עמדת המוח הקטן, כך שהמשטח החצוי (ליד קו האמצע של המוח הקטן) פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את cryomold לslurry הקרח היבש במשך 5 דקות עד למתחם אוקטובר יצר לבנה מטריצה ​​מוצקה סביב דגימת הרקמה. הערה: כעת ניתן לאחסן הדגימה הקפואה ב -20 ° C אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית מראש שטופלה שקופיות פולי-ליזין לאיסוף קטעי רקמה ולהכין את cryostat פי הוראות היצרן כדי לאסוף 15 מיקרומטר חלקים של והנוזלbellum. כדי לאסוף את החלקים, פנה בזהירות את סעיף אוקטובר עם הצד המצופה פולי-ליזין של השקופית. כדי לשמר את הכיוון של הסעיף, לא לסובב את השקופיות במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי רקמות חנות ב -20 ° C עד שתמשיך עם כתמים והדמיה. </li></ol> 5. מכתים והדמיה של המוח קטן סעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות לפני מכתים הרקמות הבאים: ~ 50 מיליליטר של PBS ~ 5-10 מיליליטר של PFA 4% ב- ​​PBS ~ 10-20 מיליליטר של 0.5%, 10% חמורים בדם Triton X-100 ב PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי המוח הקטן הפשרה. חשוב לציין, לצמצם את החשיפה שלהם לכל מקור של אור רציף והאינטנסיבי כדי למנוע דהייה של EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עט מחסום הידרופובי, לצייר מלבן סביב סעיפי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את החלקים עם PFA 4% במשך 5 דקות. השתמש מספיק נוזלי כדי לכסות את כל השטח שמסומן על ידי המחסום הידרופובי (בדרך כלל ~ 500 μl). באמצעות ואקום או פיפטה, מחדשלהזיז את מקבע להיות זהיר במיוחד שלא להפריע את סעיפי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת, בעדינות להחיל PBS בשקופית מבלי להפריע סעיפי רקמות. לאחר 5 דקות להשתמש בוואקום או פיפטה כדי להסיר את הנוזל בזהירות. חזור על PBS לשטוף כולל של שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להחיל בזהירות את הדילול המתאים של נוגדנים עיקריים (3 μl Calbindin ו / או נוגדן Nesprin2 לμl 900 של פתרון) ב 0.5% X-100, 10% חמורים בדם טריטון בPBS. דגירה של שעה אחת בטמפרטורת חדר בחושך. הערה: EGFP-KASH2 יהיה גלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הישיר על חלקים קפואים, ואין צורך להשתמש בנוגדן אנטי-EGFP. עם זאת, אם חלקי פרפין ערוכים, הדמיה של EGFP-KASH2 דורשת immunodetection עם נוגדן אנטי-EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1: 1,000 דילולים של נוגדנים משני Alexa-פלואוריד ב 0.5% Triton X-100,10% חמורים בדם בPBS וחנות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות ולשטוף PBS הסופי ולהחיל את דילול נוגדנים משני במשך שעה אחת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני, לשטוף ולשטוף את הסעיף שלוש פעמים. במידת הצורך, יחול כתם גרעיני, כגון DAPI (~ 300nM), במהלך יישום PBS הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את פתרון PBS מרחבי הרקמה והמקום ~ 5-7 μl של ההרכבה תקשורת בקטע הרקמה. מניחים coverslip זכוכית על גבי קטע הרקמה ומניח בצד ל~ 15-30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים המתאימים לדמיין EGFP וכל אורכי גל אחרים מתאימים לנוגדנים משני המשמשים בצעדים 5.8 / 5.9. בפרוסות המוח הקטן, להשתמש אובייקטיבי 20X כדי להציג המכון גרעיני EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins:+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression?+Nature+reviews.">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li><li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+lamins:+their+structure,+assembly,+and+interactions.">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li><li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton.">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li><li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein.">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li><li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton.">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li><li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei.">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li><li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration.">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li><li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enaptin,+a+giant+actin-binding+protein,+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton.">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li><li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization.">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+outer+nuclear+membrane+protein,+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin.">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li><li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells.">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+protein+Syne-2/Nesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1/2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development.">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation.">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage.">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li><li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness.">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1/2+and+Syne/Nesprin-1/2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice.">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo.">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I.">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li><li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבות מולקולריות של התא וגרגיר של המוח הקטן (איור 2). כמו כן, על מנת למקסם את כל פנוטיפים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית חשוב לזהות מתח Cre עם ביטוי Cre נרחב על פני סוג התא של עניין. זה גם חיוני לבצע אפיון מעמיק של דפוס הביטוי של רכיבים מורכבים LINC במהלך הפיתוח של המערכת של עניין. ואכן, חסרון אחד של מודל עכבר Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא שהוא אינו מספק כל מידע על שחלבוני שמש או גרסאות Nesprins מעורבות במערכת הביולוגית uשיקול nder. עם זאת, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי ביצוע אפיון קפדני בשתי רמות התמליל והחלבון. למעשה, מחקרים כאלה כבר התחייבו בכמה הזדמנויות שהובילו לממצאים חשובים על תפקידו של רכיבים מורכבים LINC הספציפיים במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית והומאוסטזיס 21,22. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה הוא על השימוש ברקמות מערכת העצבים המרכזית קבועות ממוקד, עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) יכולים לשמש כדי לבודד ותאים ראשוניים תרבות כדי לחקור את ההשפעה של שיבוש מתחמי LINC במבחנה. באמצעות שיטה זו, ניתן לבודד ולטהר תרבויות עיקריות של תאי EGFP-KASH2 החיוביים עבור יישומים כגון מיקרוסקופיה וידאו הזמן לשגות. זה עוקף את יעילות נמוכה transfection או ייצור lentiviral הנדרש למערכות תרבות עיקריות, כגון תאי עצב. לסיכום, Tg העכברים (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לפתוח אפשרויות חדשות ומרגשות ללמוד הכיףction של מתחמי LINC in vivo בתהליכי התפתחות עובריים יונקים ולאחר לידה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאי מטרה לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה של תא.

מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א &#39;וב&#39; מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג 3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו&quot; הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני 6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE 7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים 8 13. &lt;class = &quot;jove_content&quot; p&gt; מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים &quot;ציר&quot; אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים 9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms 16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים 17 ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים 18. פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי 17 (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Slides</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antibody</td><td></td><td></td><td>Previously described in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

פרוטוקול זה ממחיש את התועלת של (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) מודל עכבר Tg להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את כל פנוטיפ פיסיולוגי, חשוב להבטיח כי EGFP-KASH2 בא לידי ביטוי ברוב התאים ממוקדים על ידי חישוב אחוז התאים חיוביים EGFP-KASH2 שישתפו מוכתם עם סמן נוגדן ספציפי בתא. בדוגמא זו, ביטוי EGFP-KASH2 זוהה בלמעלה מ -70% מתאי Calbindin חיוביים פורקינג (איור 2). בקונדי אלהמשא, אנחנו לא רואים שום פנוטיפים היסטולוגית או התנהגות משמעותיות בTg 10 בן חודש עכברים (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20. חשוב להבטיח שכל פנוטיפ מורפולוגיים או התנהגות לא בשל ביטוי חוץ רחמי של EGFP-KASH2 בסוג התא / רקמה לא מכוונת. לכבד את זה, EGFP-KASH2 לא נצפה בשכבת תאי גרגיר או השכבה המולקולרית של Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (איור 2). לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר את מידת ההפרעה מורכבת LINC בתאים להביע EGFP-KASH2. זה יכול להיות מושגים באמצעות נוגדנים נגד Nesprin באיכות גבוהה להדגיש עקירתם מNE של תאים להביע EGFP-KASH2. כפי שניתן לראות באיור 3, Nesprin2 אנדוגני הוא שנעקר ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג &#39;המבטאות EGFP-KASH2 (איור 3 פנל עליון, חצים צהובים) ואילו תאי פורקינג&#39; שלא להביע EGFP-KASH2 RetaבNesprin2 אנדוגני במעטפה הגרעין (איור 3 פנל עליון, חץ לבן). כצפוי, המלטת שליטה, שאינו מבטא Cre-recombinase, להציג Nesprin2 במעטפה הגרעין של אוכלוסיית כל תא פורקינג &#39;(איור 3 חצים לבנים למטה). כמה דיווחים החברה אישרו את הביטוי של EGFP-KASH2, מלווה בתזוזה של Nesprins אנדוגני, ברקמות נוספות וסוגי תאים כגון סיבי שריר שלד וקולטניים אור קונוס 19,21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> איור 1. מתחמי LINC להתחבר הגרעין לשלד התא והם שיבשו על ידי ביטוי יתר של EGFP-KASH2. () תיאור של מתחמי LINC המחבר את הפנים של הגרעין לשלד תא cytoplasmic. שים לב שתחומי SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאשמכל Nesprins (Nesprins 1-4). (ב) יתר של EGFP-KASH2 מחליף Nesprins אנדוגני ממעטפת הגרעין לחדר המיון, באופן שלילי דומיננטי, ובכך לנתק את הגרעין משלד תא cytoplasmic שמסביב. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> גידול ביטוי יתר של איור 2. EGFP-KASH2 ממוקד במיוחד לתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. () של Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לTg (PCP2-Cre) צאצאי תוצאות עכברים בTg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) בי recombinase Cre מתבטא במיוחד בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. על הביטוי (P6), recombinase Cre translocates לגרעין שבו בולה ORF LacZ וגורם ביטוי EGFP-KASH2. (ב) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) עכברים במיוחד להביע EGFP-KASH2 בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן identifמטען עם Calbindin (בצבע אדום). שים לב ששני נוירונים במוח הקטן גרגיר וinterneurons של השכבה המולקולרית הם שליליים לביטוי EGFP-KASH2. קיצורים: MOL: שכבה מולקולרית, PCL: שכבת פורקינג &#39;התא וGCL: שכבת תאי גרגיר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> איור 3. שיבוש של מתחמי LINC אנדוגני בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. ביטוי מראה יחיד מטוס confocal של EGFP-KASH2 שמחליף Nesprin2 אנדוגני (בצבע אדום) ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג&#39; (חיצים צהובים העליונים). שים לב שתאי פורקינג חסרי ביטוי EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפת הגרעין שלהם (למעלה חץ לבן). בהמלטת שליטת Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), אין אות EGFP הוא ציין וNesprin2 מזוהה במעטפה הגרעין של כל Purki פרוטוקול זה ממחיש את התועלת שלTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) מודל עכבר כדי להגביל את הביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את כל פנוטיפ פיסיולוגי, חשוב להבטיח כי EGFP-KASH2 בא לידי ביטוי ברוב התאים ממוקדים על ידי חישוב אחוז התאים חיוביים EGFP-KASH2 שישתפו מוכתם עם סמן נוגדן ספציפי בתא. בדוגמא זו, ביטוי EGFP-KASH2 זוהה בלמעלה מ -70% מתאי Calbindin חיוביים פורקינג (איור 2). בתנאים אלה, אנחנו לא רואים שום היסטולוגית או behaviora משמעותייםפנוטיפים l בעכברי 10 חודשים ישנים Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20. חשוב להבטיח שכל פנוטיפ מורפולוגיים או התנהגות לא בשל ביטוי חוץ רחמי של EGFP-KASH2 בסוג התא / רקמה לא מכוונת. לכבד את זה, EGFP-KASH2 לא נצפה בשכבת תאי גרגיר או השכבה המולקולרית של Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (איור 2). לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר את מידת ההפרעה מורכבת LINC בתאים להביע EGFP-KASH2. זה יכול להיות מושגים באמצעות נוגדנים נגד Nesprin באיכות גבוהה להדגיש עקירתם מNE של תאים להביע EGFP-KASH2. כפי שניתן לראות באיור 3, Nesprin2 אנדוגני הוא שנעקר ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג &#39;המבטאות EGFP-KASH2 (איור 3 פנל עליון, חצים צהובים) ואילו תאי פורקינג&#39; שלא להביע EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפה הגרעין (איור 3 </sטרונג&gt; פנל עליון, חץ לבן). כצפוי, המלטת שליטה, שאינו מבטא Cre-recombinase, להציג Nesprin2 במעטפה הגרעין של אוכלוסיית כל תא פורקינג &#39;(איור 3 חצים לבנים למטה). כמה דיווחים החברה אישרו את הביטוי של EGFP-KASH2, מלווה בתזוזה של Nesprins אנדוגני, ברקמות נוספות וסוגי תאים כגון סיבי שריר שלד וקולטניים אור קונוס 19,21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> איור 1. מתחמי LINC להתחבר הגרעין לשלד התא והם שיבשו על ידי ביטוי יתר של EGFP-KASH2. () תיאור של מתחמי LINC המחבר את הפנים של הגרעין לשלד תא cytoplasmic. שים לב שתחומי SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש מכל Nesprins (Nesprins 1-4). o (ב) ביטוי יתרF-EGFP KASH2 מחליף Nesprins אנדוגני ממעטפת הגרעין לחדר המיון, באופן שלילי דומיננטי, ובכך לנתק את הגרעין משלד תא cytoplasmic שמסביב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> גידול ביטוי יתר של איור 2. EGFP-KASH2 ממוקד במיוחד לתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. () של Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לTg (PCP2-Cre) צאצאי תוצאות עכברים בTg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) בי recombinase Cre מתבטא במיוחד בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. על הביטוי (P6), recombinase Cre translocates לגרעין שבו בולה ORF LacZ וגורם ביטוי EGFP-KASH2. (ב) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) עכברים במיוחד להביע EGFP-KASH2 בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן מזוהים עם Calbindin (בצבע אדום). שים לב ששני נוירונים במוח הקטן גרגיר וinterneurons של השכבה המולקולרית הם שליליים לביטוי EGFP-KASH2. קיצורים: MOL: שכבה מולקולרית, PCL: שכבת פורקינג &#39;התא וGCL:. שכבת תאי גרגיר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> איור 3. שיבוש של מתחמי LINC אנדוגני בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן. ביטוי מראה יחיד מטוס confocal של EGFP-KASH2 שמחליף Nesprin2 אנדוגני (בצבע אדום) ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג&#39; (חיצים צהובים העליונים). שים לב שתאי פורקינג חסרי ביטוי EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפת הגרעין שלהם (כהואדואר חץ עליון). בהמלטת שליטת Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), אין אות EGFP הוא ציין וNesprin2 מזוהה במעטפה הגרעין של כל תאי פורקינג &#39;(חיצים לבנים למטה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner at JoVE.com

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Video: Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Developmental Biology

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Behavior

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetics

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all females are heterozygous for X-linked gene expression. One of the key regulators of XCI is Xist, which is essential for the initiation and maintenance of XCI. Previous studies have identified 13 trans acting X chromosome inactivation factors (XCIFs) using a large-scale, loss-of-function genetic screen. Inhibition of XCIFs, such as ACVR1 and PDPK1, using short-hairpin RNA or small molecule inhibitors, reactivates X chromosome-linked genes in cultured cells. But the feasibility and tolerability of reactivating the inactive X chromosome in vivo remains to be determined. Towards this goal, a Xist&#916;:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp mouse model has been generated with non-random XCI due to deletion of Xist on one X chromosome. Using this model, the extent of inactive X reactivation was quantitated in the mouse brain following treatment with XCIF inhibitors. Recently published results show, for the first time, that pharmacological inhibition of XCIFs reactivates Mecp2 from the inactive X chromosome in cortical neurons of the living mouse brain.

Here, we describe a protocol to generate a viable female murine model with non-random X chromosome inactivation, i.e., the maternally-inherited X chromosome is inactive in 100% of the cells. We also describe a protocol to test feasibility, tolerability, and safety of pharmacological reactivation of the inactive X chromosome in vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunology and Infection

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

מידול סרטן הערמונית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית: טכניקת עריכת גנים מקומית בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי האונה הקדמית של הערמונית בעכבר

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Prostate Cancer

Animal model studies

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

Source: Pang, X., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64059">A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Source: Pang, X., et al. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. ...

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה