شكرا المؤلفين موظفي الصرف والتصوير الأساسية، من صميم علم الوراثة الجزيئي (قسم طب وجراحة العيون والعلوم البصرية) والفأر علم الوراثة الأساسية في جامعة واشنطن في سانت لويس مدرسة الطب. معتمدة على الكتاب من قبل برنامج المنح الصغيرة من مركز ماكدونيل لالخلوية والجزيئية بيولوجيا الأعصاب، مركز الأمل للاضطرابات العصبية، والمعهد الوطني للعيون (# R01EY022632 إلى DH)، مركز المعهد الوطني للعيون الأساسية غرانت (# P30EY002687) و منحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى إلى قسم العيون والعلوم البصرية.

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة واشنطن في سانت لويس. 1. ماوس تربية والتنميط الجيني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تولد تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران مع تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران لانتاج تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19،20. ملاحظة: في حين أن ما تبقى من هذا البروتوكول تركز على استخدام خط تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الماوس لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية في المخيخ، يمكن اتباع إجراء مماثل مع أي تيراغرام (لجنة المساواة العرقية) الماوس الأخرى ( الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التنميط الجيني لتحديد الجراء إيواء كل من EGFP والجينات المحورة لجنة المساواة العرقية كما هو موضح سابقا (19). </li></ol> 2. إعداد مواد للتشريح والأنسجة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 مل من السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني (30 ز السكروز / 100 مل من 1X PBS) وتخزينها في -20 ° C. يوم الأنسجة حarvesting، ذوبان الجليد وتحميل ~ 30-35 مل من محلول السكروز إلى حقنة 35 مل لperfusions transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 40 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني (10 مل 16٪ امتصاص العرق و 30 مل PBS). تحميل ~ 30-35 مل من 4٪ PFA إلى حقنة 35 مل لperfusions transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 10 سم نسيج لوحة الثقافة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لتشريح الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كوكتيل الكيتامين / زيلازين تتكون من 16 ملغ / مل الكيتامين و 3 ملغ / مل زيلازين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول من الايثانول 70٪ للتشريح. </li></ol> 3. تشريح والأنسجة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 1 مل، وضخ 500 ميكرولتر من كوكتيل الكيتامين / زيلازين لكل 25 غرام من وزن الجسم وانتظر ~ 15 دقيقة. بدلا من ذلك، استخدام أسلوب التخدير أخرى وافق مؤسسيا الذي يتناسب مع النظام البيولوجي للاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التخدير، قرصة بلطف مخلب الخلفي لتأكيد عدم استجابة الألم، ويعلقون كل الكفوف على صينية الستايروفوم مع الجانب الظهري للالماوس لأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش البطن مع الايثانول 70٪ وإجراء شق من أسفل البطن إلى أعلى القفص الصدري للوصول إلى القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب وإدراج حقنة تحتوي على محلول السكروز 30٪ إلى البطين الأيسر من القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي حل بمعدل ~ 2-5 مل لكل دقيقة. عندما تكون فارغة، وإزالة حقنة وتكرار مع 4٪ PFA حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بفصل الماوس من علبة الستايروفوم وقطع رأس للوصول إلى الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد حول الرأس من الحيوان باستخدام ملقط ومقص. كزة حفرة في الجزء الخلفي من الجمجمة مع إبرة وإزالة بعناية الجمجمة مع مقص وملقط تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الدماغ يمكن الوصول إليها بشكل واضح، واستخدام ملقط لإزالة المخيخ ووضعه في برنامج تلفزيوني. شطر المخيخ في المستوى السهمي مع مشرط ونقل إلى حل السكروز 30٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: لالإعداديةهي أقسام البارافين، إصلاح المخيخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 4٪ PFA قبل تضمين الأنسجة وباجتزاء. </li></ol> 4. معالجة الأنسجة وباجتزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطين من الثلج الجاف وغاز البوتان 2-الميثيل. السماح لدرجة حرارة الحمام لكي تتوازن لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء cryomold مع أكتوبر المجمع ووضع نصف من المخيخ شطر في القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح وزوج من ملقط موقف المخيخ بحيث سطح شطر (بالقرب من خط الوسط من المخيخ) هو مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل cryomold إلى الطين الجليد الجاف لمدة 5 دقائق حتى شكلت مجمع أكتوبر مصفوفة صلبة بيضاء حول عينة الأنسجة. ملاحظة: يمكن الآن أن يتم تخزين العينات المجمدة في -20 ° C إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية مسبقا المعاملة الشرائح بولي يسين لجمع أقسام الأنسجة وإعداد ناظم البرد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من أجل جمع 15 ميكرون أقسام قيراللجوء إلى الحرب. لجمع المقاطع، اتصل بعناية القسم أكتوبر مع الجانب بولي يسين المغلفة للشريحة. للحفاظ على التوجه للقسم، لا تدوير الشريحة خلال هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية حتى الشروع في تلطيخ والتصوير. </li></ol> 5. تلطيخ والتصوير من أقسام المخيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية قبل تلطيخ الأنسجة: ~ 50 مل من برنامج تلفزيوني ~ 5-10 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني ~ 10-20 مل من 0.5٪ تريتون X-100، و 10٪ المصل حمار في برنامج تلفزيوني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام المخيخ ذوبان الجليد. الأهم من ذلك، تقليل تعرضهم إلى أي مصدر ضوء مستمر ومكثف لمنع يتلاشى من EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمانع القلم مسعور، رسم مستطيل حول أقسام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح الأجزاء مع 4٪ PFA لمدة 5 دقائق. استخدام ما يكفي من السوائل لتغطية المنطقة بأكملها حددتها حاجز مسعور (عادة ~ 500 ميكرولتر). باستخدام فراغ أو ماصة، وإعادةنقل تثبيتي يجري الحذر بشكل خاص على عدم تعكير صفو أقسام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ماصة، وتطبيق بلطف PBS على الشريحة دون إزعاج أقسام الأنسجة. بعد 5 دقائق استخدام الفراغ أو ماصة لإزالة بعناية السائل. كرر PBS شطف ما مجموعه ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، وتطبيق بعناية التخفيف المناسبة من الأجسام المضادة الأولية (3 ميكرولتر Calbindin و / أو Nesprin2 الأجسام المضادة في 900 ميكرولتر من الحل) 0.5٪ تريتون X-100، و 10٪ مصل حمار في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ملاحظة: سوف EGFP-KASH2 تكون مرئية بواسطة المجهر مضان مباشر على الأبواب المجمدة، وأنه ليس من الضروري استخدام أجسام مضادة لمكافحة EGFP. ومع ذلك، إذا تم إعداد أقسام البارافين، تصوير EGFP-KASH2 يتطلب مناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة وشطف مع PBS ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1: 1000 التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 0.5٪ تريتون X-100،10٪ مصل حمار في برنامج تلفزيوني وتخزينها في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف PBS شطف النهائي وتطبيق التخفيف الضد الثانوية لمدة ساعة واحدة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية، وشطف وغسل القسم ثلاث مرات. إذا لزم الأمر، وتطبيق وصمة عار النووية، مثل دابي (~ 300nM)، أثناء تطبيق برنامج تلفزيوني الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما إزالة حل PBS من جميع أنحاء الأنسجة ومكان ~ 5-7 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام على قسم الأنسجة. وضع ساترة الزجاج على رأس قسم الأنسجة وتوضع جانبا ل~ 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات مناسبة لتصور EGFP وأي موجات أخرى مناسبة لالأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في الخطوات 5.8 / 5.9. في شرائح للدماغ، واستخدام الهدف 20X لعرض الحافات النووية EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins:+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression?+Nature+reviews.">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li><li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+lamins:+their+structure,+assembly,+and+interactions.">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li><li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton.">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li><li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein.">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li><li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton.">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li><li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei.">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li><li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration.">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li><li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enaptin,+a+giant+actin-binding+protein,+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton.">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li><li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization.">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+outer+nuclear+membrane+protein,+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin.">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li><li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells.">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+protein+Syne-2/Nesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1/2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development.">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation.">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage.">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li><li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness.">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1/2+and+Syne/Nesprin-1/2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice.">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo.">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I.">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li><li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوة الأكثر أهمية للدراسة بنجاح دور المجمعات ينك في الجسم الحي باستخدام (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج تيراغرام هو تحديد خط الماوس لجنة المساواة العرقية مناسب (ق). في الواقع، إن لجنة المساواة العرقية تنشط في غيرها من أنواع الخلايا المشاركة في مسارات مشابهة، يمكن أن تعقد تفسير النتائج. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المجاورة، كما هو موضح هنا في طبقات الخلية الجزيئية والحبيبية في المخيخ (الشكل 2B). وبالمثل، لتعظيم أي الظواهر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من المهم التعرف على سلالة لجنة المساواة العرقية مع نطاق واسع التعبير لجنة المساواة العرقية عبر نوع من الخلايا في المصالح. ومن المهم أيضا أن يجري توصيف متعمق لنمط التعبير عن مكونات ينك المعقدة خلال تطوير نظام الفائدة. في الواقع، عيب واحد من (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج الفأر تيراغرام هو أنه لا يقدم أي معلومات على النحو الذي تشارك البروتينات الشمس أو المتغيرات Nesprins في النظام البيولوجي شنظر التانجو. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق إجراء توصيف دقيق على المستويين نص والبروتين. في الواقع، لقد تم إجراء مثل هذه الدراسات في عدة مناسبات مما أدى إلى نتائج هامة حول دور مكونات معقدة لينك محددة خلال تطوير الجهاز العصبي المركزي والتوازن 21،22. وأخيرا، في حين يركز هذا البروتوكول على استخدام أنسجة الجهاز العصبي المركزي ثابتة، تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران يمكن أن تستخدم لعزل الخلايا والثقافة الابتدائي إلى دراسة تأثير تعطيل المجمعات ينك في المختبر. باستخدام هذا المخطط، فمن الممكن لعزل وتنقية الثقافات الأولية من الخلايا EGFP-KASH2 الإيجابية لتطبيقات مثل الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري. هذا يتجاوز الكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة أو إنتاج lentiviral اللازمة لأنظمة الثقافة الأولية، مثل الخلايا العصبية. وباختصار، فإن تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران تفتح آفاقا جديدة ومثيرة لدراسة المرحction المجمعات ينك في الجسم الحي أثناء العمليات التنموية الثدييات الجنينية وبعدها في طائفة واسعة من الأنسجة وأنواع الخلايا لمعالجة المسائل بيولوجيا الخلية الأساسية.

المغلف النووي (NE) يفصل جبلة النواة عن السيتوبلازم. وهي تتألف من الغشاء النووي الداخلي والخارجي (الحركة الوطنية العراقية وONM، على التوالي) التي تربط في المسام النووية. ويسمى التجويف الذي رسمه كل من الأغشية مساحة محيط بالنواة (المحيطي). وONM هو امتداد الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (ER)، والحركة الوطنية العراقية تتمسك الصفيحة النووية، كانت شبكة من النووي نوع-V خيوط المتوسطة ممثلة A- و B-نوع lamins 1،2. LInkers من Nucleoskeleton والهيكل الخلوي (لينك) المجمعات هي المجالس الجزيئات التي تمتد المغلف النووي بأكمله للاتصال جسديا داخل نواة لخيوط هيكل الخلية والمحركات الجزيئية (الشكل 1A). وهي تتألف من التفاعلات بين الزخارف الحفاظ تطويريا التي تميز عائلتين من البروتينات الغشاء لا يتجزأ من NE: الشمس (Sad1 / Unc84) البروتينات وNesprins (النووية مغلف SPectRINS). في الثدييات، Sun1 وSun2 عالبريد البروتينات عبر الغشاء من الحركة الوطنية العراقية الذي المنطقة النواة إلى الهيولى N-محطة يتفاعل مباشرة مع A- و B-نوع lamins 3-5. على الجانب الآخر من الحركة الوطنية العراقية، في الجهاز العصبي المحيطي، والبروتينات الشمس تؤوي إمتداد التطوري-حفظها من ~ الأحماض الأمينية 150 C-محطة تدعى المجال أشعة الشمس. المجالات SUN تتفاعل مباشرة مع كاش التطوري-المحفوظة (Klarsicht / حزب المؤتمر الوطني الافريقي-1، المتزامنة التماثل) المجال، توقيع الجزيئي للNesprins. تتكون المجالات كاش من امتداد ~ 30 الأحماض الأمينية-C المحطة أن يبرز في الجهاز العصبي المحيطي تليها مجال الغشاء 6. لا يقل عن أربعة جينات Nesprin مميزة (Nesprin1-4) ترميز كاش المحتوية على البروتينات التي توطين في NE 7. المناطق حشوية من Nesprins، التي تختلف أحجام من ~ 50kDa (Nesprin4) إلى مذهل 1000 كيلو دالتون (Nesprin1 العملاقة)، ​​تحتوي على إسبكترن متعددة يكرر وكذلك الزخارف محددة تمكن تفاعلها مع مكونات هيكل الخلية مثل الأكتين، plectin والمحركات الجزيئية 8- 13. &lt;ص الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; دراسات في الفقاريات واللافقاريات أظهرت أن لامين / الأحد / Nesprin / المحركات الجزيئية تشكل &quot;محور&quot; الحفظ تطويريا السيطرة على الهجرة النووية ومرسى. وقد وصفت عدة طرق المغادرة (KO) نماذج الماوس من مكونات ينك معقدة وكان أساسيا في توفير إطار لفهم أدوار الشمس وNesprin البروتينات في NE خلال تطوير الثدييات 9،14،15. ولكن هذه النماذج الحالية عدة عيوب كبيرة، أبرزها: 1) صعوبة في تفسير الظواهر المقرر أن الخلية الآثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي، 2) صعوبة في التمييز المساهمات phenotypical من كاش المحتوية مقابل كاش أقل Nesprin إيسفورمس 16، 3) التكرار وظيفية من الشمس وNesprin البروتينات في NE في العديد من أنواع الخلايا يتطلب مخططات تربية معقدة لتعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الفئران 17 و 4) من الفتك فترة ما حول الولادة من الفئران التي تعاني من نقص للكاش المجال على حد سواءNesprins1 و2 يحول دون تحليل الظواهر الكبار 18. يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر رواية تهدف إلى تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الجسم الحي، في زنزانة بطريقة ذاتية الحكم وينظم تنمويا، وبالتالي تجاوز كثير من السلبيات المذكورة أعلاه. يعتمد هذا لجنة المساواة العرقية / القائم السلمون المدخن نموذج الفأر على مفهومين هامين: 1) المجال كاش من أي بروتين Nesprin معروفة كافية لاستهداف EGFP إلى NE في أنظمة زراعة الخلايا و2) مجالات SUN تتفاعل باباحه مع مجالات كاش، وبالتالي overexpression من وأي مجال كاش تشبع جميع المجالات SUN الداخلية ووقف نشاط المجمعات ينك بطريقة المهيمنة سلبية 17 (الشكل 1B). يصف هذا البروتوكول حصاد الأنسجة وخطوات المعالجة المستخدمة للتأكد من تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الخلايا العصبية للدماغ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>M1000W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuEdge Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin Antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EGFP Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nesprin2 Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Previously described in Ref. 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O3551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

يوضح هذا البروتوكول فائدة (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج الفأر تيراغرام لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية للدماغ باستخدام تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران. في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ذرية، يتم استئصاله وLacZ / V5 إطار القراءة المفتوحة في P6 قبل recombinase لجنة المساواة العرقية مما يؤدي إلى التعبير عن EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى خلايا العصبية (الشكل 2A). كما هو متوقع، والتي تستهدف EGFP-KASH2 إلى الغلاف النووي كما يدل على ذلك نمط تشبه حافة EGFP الايجابي الملحوظ حول النواة (الشكل 2B). لتعظيم أي النمط الظاهري الفسيولوجية، من المهم للتأكد من أن أعرب EGFP-KASH2 في معظم الخلايا المستهدفة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP-KASH2 التي يشترك الملون مع الأجسام المضادة علامة خلية محددة. في هذا المثال، تم الكشف عن EGFP-KASH2 التعبير في أكثر من 70٪ من الخلايا العصبية Calbindin إيجابية (الشكل 2B). في هذه كونديستعقد، ونحن لم نلاحظ أي الظواهر النسيجية أو سلوكية كبيرة في تيراغرام من العمر 10 شهرا (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) الفئران 20. فمن المهم التأكد من أن أي النمط الظاهري المورفولوجية أو السلوكي لا يعود الى التعبير خارج الرحم من EGFP-KASH2 في نوع من الخلايا / الأنسجة غير مقصودة. لهذا الشأن، لم يكن لوحظ EGFP-KASH2 في طبقة الخلايا الحبيبية أو طبقة الجزيئية من تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) مخيخات (الشكل 2B). وأخيرا، من المهم جدا للتأكد من مدى ينك اضطراب معقد في الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام عالية الجودة أضداد Nesprin التأكيد على نزوحهم من NE الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. كما هو مبين في الشكل (3)، والنازحين الذاتية Nesprin2 من الغلاف النووي للخلايا العصبية التي تعبر عن EGFP-KASH2 (الشكل 3 اللوحة العلوية، الأسهم الصفراء) في حين أن الخلايا العصبية التي لا تعبر عن EGFP-KASH2 ريتافي Nesprin2 الذاتية في الغلاف النووي (الشكل 3 لوحة العلوي، السهم الأبيض). كما هو متوقع، تتزاحم السيطرة، والتي لا تعبر عن لجنة المساواة العرقية-recombinase، عرض Nesprin2 في الغلاف النووي للخلية العصبية كله السكان (الشكل 3 السهام البيضاء أسفل). وقد أكدت العديد من التقارير الآن التعبير عن EGFP-KASH2، يرافقه تشريد Nesprins الذاتية، في أنسجة إضافية وأنواع الخلايا مثل ألياف العضلات الهيكلية ومبصرات مخروط 19،21. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> الشكل 1. المجمعات ينك ربط النواة إلى الهيكل الخلوي وعطلت من قبل overexpression من EGFP-KASH2. (A) تصوير المجمعات ينك التي تربط المناطق الداخلية من النواة إلى الهيكل الخلوي حشوية. لاحظ أن المجالات SUN تتفاعل مع باباحه المجالات كاشمن كل Nesprins (Nesprins 1-4). (B) overexpression من EGFP-KASH2 يزيح Nesprins الذاتية من الغلاف النووي لER، بطريقة السلبي السائد، وبالتالي فصل النواة من الهيكل الخلوي حشوية المحيطة بها. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> الشكل 2. overexpression من EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا العصبية للدماغ. (A) تربية تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) لتيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) النتائج الفئران في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) ذرية وهو ما يعبر عنه في لجنة المساواة العرقية recombinase تحديدا في الخلايا العصبية للدماغ. على التعبير (P6)، لجنة المساواة العرقية recombinase translocates داخل النواة حيث المكوس وLacZ ORF ويؤدي EGFP-KASH2 التعبير. (B) تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) الفئران التعبير على وجه التحديد EGFP-KASH2 في الخلايا العصبية للدماغ identifالعبوات الناسفة مع Calbindin (الملونة باللون الأحمر). لاحظ أن كل من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ وinterneurons طبقة الجزيئية سلبية لEGFP-KASH2 التعبير. الاختصارات: وزارة العمل: طبقة الجزيئية، PCL: طبقة الخلايا العصبية وGCL: طبقة الخلايا الحبيبية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> الشكل 3. تعطيل المجمعات ينك الذاتية في الخلايا العصبية للدماغ. واحد متحد البؤر الطائرة التعبير تبين من EGFP-KASH2 أن يزيح الذاتية Nesprin2 (الملونة باللون الأحمر) من الغلاف النووي للخلايا العصبية (الأسهم الصفراء العليا). لاحظ أن الخلايا العصبية التي تفتقر إلى EGFP-KASH2 التعبير الحفاظ Nesprin2 الذاتية في محيطهما النووي (أبيض رأس السهم). في تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) تتزاحم السيطرة، لوحظ عدم وجود إشارة EGFP والكشف عن Nesprin2 في الغلاف النووي من جميع Purki يوضح هذا البروتوكول فائدةتيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) نموذج الفأر لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية للدماغ باستخدام تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران. في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ذرية، يتم استئصاله وLacZ / V5 إطار القراءة المفتوحة في P6 قبل recombinase لجنة المساواة العرقية مما يؤدي إلى التعبير عن EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى خلايا العصبية (الشكل 2A). كما هو متوقع، والتي تستهدف EGFP-KASH2 إلى الغلاف النووي كما يدل على ذلك نمط تشبه حافة EGFP الايجابي الملحوظ حول النواة (الشكل 2B). لتعظيم أي النمط الظاهري الفسيولوجية، من المهم للتأكد من أن أعرب EGFP-KASH2 في معظم الخلايا المستهدفة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP-KASH2 التي يشترك الملون مع الأجسام المضادة علامة خلية محددة. في هذا المثال، تم الكشف عن EGFP-KASH2 التعبير في أكثر من 70٪ من الخلايا العصبية Calbindin إيجابية (الشكل 2B). في هذه الظروف، ونحن لم نلاحظ أي النسيجية كبيرة أو behavioraالظواهر لتر في القديم أشهر 10 تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) الفئران 20. فمن المهم التأكد من أن أي النمط الظاهري المورفولوجية أو السلوكي لا يعود الى التعبير خارج الرحم من EGFP-KASH2 في نوع من الخلايا / الأنسجة غير مقصودة. لهذا الشأن، لم يكن لوحظ EGFP-KASH2 في طبقة الخلايا الحبيبية أو طبقة الجزيئية من تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) مخيخات (الشكل 2B). وأخيرا، من المهم جدا للتأكد من مدى ينك اضطراب معقد في الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام عالية الجودة أضداد Nesprin التأكيد على نزوحهم من NE الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. كما هو مبين في الشكل (3)، والنازحين الذاتية Nesprin2 من الغلاف النووي للخلايا العصبية التي تعبر عن EGFP-KASH2 (الشكل 3 اللوحة العلوية، الأسهم الصفراء) في حين أن الخلايا العصبية التي لا تعبر عن EGFP-KASH2 الاحتفاظ الذاتية Nesprin2 في الغلاف النووي (الشكل 3 </sترونج&gt; اللوحة العلوية، السهم الأبيض). كما هو متوقع، تتزاحم السيطرة، والتي لا تعبر عن لجنة المساواة العرقية-recombinase، عرض Nesprin2 في الغلاف النووي للخلية العصبية كله السكان (الشكل 3 السهام البيضاء أسفل). وقد أكدت العديد من التقارير الآن التعبير عن EGFP-KASH2، يرافقه تشريد Nesprins الذاتية، في أنسجة إضافية وأنواع الخلايا مثل ألياف العضلات الهيكلية ومبصرات مخروط 19،21. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> الشكل 1. المجمعات ينك ربط النواة إلى الهيكل الخلوي وعطلت من قبل overexpression من EGFP-KASH2. (A) تصوير المجمعات ينك التي تربط المناطق الداخلية من النواة إلى الهيكل الخلوي حشوية. لاحظ أن المجالات SUN تتفاعل مع باباحه المجالات كاش من جميع Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overexpression سو EGFP-KASH2 يزيح Nesprins الذاتية من الغلاف النووي لER، بطريقة السلبي السائد، وبالتالي فصل النواة من الهيكل الخلوي حشوية المحيطة بها. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> الشكل 2. overexpression من EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا العصبية للدماغ. (A) تربية تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) لتيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) النتائج الفئران في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) ذرية وهو ما يعبر عنه في لجنة المساواة العرقية recombinase تحديدا في الخلايا العصبية للدماغ. على التعبير (P6)، لجنة المساواة العرقية recombinase translocates داخل النواة حيث المكوس وLacZ ORF ويؤدي EGFP-KASH2 التعبير. (B) تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) الفئران التعبير على وجه التحديد EGFP-KASH2 في الخلايا العصبية للدماغ التي تم تحديدها مع Calbindin (الملونة باللون الأحمر). لاحظ أن كل من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ وinterneurons طبقة الجزيئية سلبية لEGFP-KASH2 التعبير. الاختصارات: وزارة العمل: طبقة الجزيئية، PCL: طبقة الخلايا العصبية وGCL: طبقة الخلايا الحبيبية <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> الشكل 3. تعطيل المجمعات ينك الذاتية في الخلايا العصبية للدماغ. واحد متحد البؤر الطائرة التعبير تبين من EGFP-KASH2 أن يزيح الذاتية Nesprin2 (الملونة باللون الأحمر) من الغلاف النووي للخلايا العصبية (الأسهم الصفراء العليا). لاحظ أن الخلايا العصبية التي تفتقر إلى EGFP-KASH2 التعبير الحفاظ على الذاتية Nesprin2 في محيطهما النووي (مثقال ذرةالبريد السهم أعلى). في تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) تتزاحم السيطرة، لوحظ عدم وجود إشارة EGFP والكشف عن Nesprin2 في الغلاف النووي لجميع الخلايا العصبية (السهام البيضاء أسفل). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53318/53318fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner at JoVE.com

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Video: Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

مقايسة المستندة إلى الخلوي تدفق التعرف على المركبات التي تعطل ملزمة للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي تشيموكيني يجند 12 لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

نموذج الفأر من انسداد الأمعاء الجزئي

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

نموذج الماوس من عدم استقرار العمود الفقري القطني

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...