The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

Hayvan deneylerinde bölgesel etik kurul bölgesel araştırma araştırma kılavuzlarında ulusal ve uluslararası hayvan bakımı ve kullanımı ile uygun olarak bu yöntemi onayladı. 1. Numune Toplama <ol><li> Örnek depolama <ol><li> Bozulmasını önlemek için dondurucu saklama kadar 20 ° C veya buz üzerinde - en depolamak hemen tüm örnekleri toplamak ve. Bronko-alveol lavaj (BAL) performansını artırmak için buz üzerinde, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) yerleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahlık <ol><li> Bir otoklav kullanarak tüm cerrahi ekipman sterilize edin. NOT: Eğer mümkünse, bu çapraz bulaşmayı önlemek için karın ve göğüs adımlar için araçların iki farklı ayarlar kullanılması tavsiye edilir. Gerekli diseksiyon ekipmanları Şekil 4A ayrıntılı olarak </li></ol></li></ol> 2. Fareler, Bakteriyel ve Maya Türler <ol><li> Yeniden hayvanların yerel kullanım uygun Ev farelerinedeniyle biyogüvenlik düzeyi 2 mikro organizmaların kullanımına bir biyogüvenlik düzeyi 2 konut tesisi, gıda ve suyla birlikte, kafes başına 5 fare aşmadan havalandırılan bir rafa arama komitesi kuralları: P. aeruginosa ve C. albicans arasından seçilir. </li><li> 40% gliserol ortamında -80 ° C sıcaklıkta bakteriyel suşlar tutun. <ol><li> 10 ul aşılama döngü kullanarak steril Luria-Bertani suyu 3 ml içeren kültür tüpüne donmuş stoktan doğrudan bakteri ekleyin. Orbital çalkalama (400 rpm) 37 ° C&#39;de uygulanmasından önce gün O / N bırakın. </li><li> Santrifüj Hasat bakteri 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de. </li><li> Uygun bir kapalı biyolojik tehlikeli atık bertaraf içine süpernatant aspire. Kültür tüpünün dibinde beyaz yapışık pelet gözlemleyin. </li><li> Yıkayın ve 5 ml PBS ile pelet askıya. </li><li> Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar. </li><li> 1 ml PBS ile yeniden süspanse edin topak haline bakterive kısa vorteksleme. </li><li> Optik yoğunluk ölçer kullanılarak 600 nm&#39;de optik dansitometresi kullanılarak aşı yoğunluğunun belirlenmesi. 0.9 bir yoğunlukta PAO1 10 9 CFU / ml sine tekabül eder, buna bağlı olarak seyreltilir. NOT: Bu sonuç, kalibre edilmiş bir aşı ardışık seyreltiler yoğunluğunu belirlemek her kullanılan bir suş için elde edilmelidir. </li><li> Seri logaritmik seyreltme inokülumu doğrulayın ve bromokrezol mor ağar (BCP) plakaları ve O / N kültürü üzerine her seyreltme 100 ul plaka. Her fareye, ml başına 1 x 10 8 8 x 10 ila 2 CFU (fare başına 5 x 10 6 7 x10 1 CFU) içeren çözeltinin intranazal 50 ul uygulayın. </li></ol></li><li> Kullanım C. Bir referans suş olarak albicans SC5314. -80 ° C&#39;de 40% gliserol ortamında suşu koruyun. <ol><li> Bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve daha fazla saymak kolaylaştırmak için% 0.015 amikasin ile Maya-Pepton-Dekstroz suyu Supplement. </li><li> &amp; 10 ile mayayı ekleyin# 181; 37 ° C &#39;de amikasin O / N ile takviye hazırlanmıştır YPD-suyu içine l aşılama döngü. </li><li> 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile hasat maya. </li><li> Uygun bir bioharzard atık bertarafı içine süpernatantı. Beyaz yapışık pelet kültür tüpünün dibinde dikkat edilmelidir. </li><li> Yıkama PBS ve kısa vorteks 5 ml kullanılarak topak haline bakteri askıya alma ve. </li><li> Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar. </li><li> PBS ve kısa karıştırın 1 ml kullanılarak pelletini. </li><li> 40x büyütme standart bir mikroskop kullanılarak bir Mallassez hematositometre üzerinde sayılarak inokulum boyutunu belirler. Not: (maya sayısı x 10 5) / (Mallassez hematositometre ile sayılmıştır ızgara dikdörtgenler sayısı): Konsantrasyon (CFU / ml) aşağıdaki formül kullanılarak elde edilir. </li><li> Bu çözüm içeren onaylamak için 10 -5 ve 10 -6 seri logaritmik seyreltme ile doğrulayın 2 x 10 6 CFU / ml. </li><li> YPD agar plakaları üzerinde Plaka% 0.015 amikasin ile desteklenmiş. </li></ol></li></ol> C. 3. Airways Kolonizasyon albicans Not: çevreye uyum sonra, farelere günde iki kez tartılmıştır. <ol><li> Davlumbaz altında, 4 cm x 4 cm gazlı bez (açık-drop tekniği) 14 üzerine Sevofluran mevduat 500 ul. <ol><li> Hemen yaklaşık 750 ml indüksiyon odasının zemininde gazlı bez yerleştirin. Hemen hayvan ve gazlı bez arasında doğrudan temasını önlemek için gazlı bez üzerinde bir örgü kaldırdı bir platform yerleştirin. </li><li> Hava geçirmez Kapağı kapatın ve odasında Sevofluran yayılmasına imkan 1 dk 2 bekleyin. </li><li> Platformu ve yakın kapak mesh kafes fare aktarın. Korunmuş spontan solunum Işık anestezi 30 ila 45 sn sağlanmalıdır. </li><li> Fare f çıkarılabilir bu noktada refleksi kaybı gözlemleyerek hipotoni için izlemekutu ve telkin rom. </li></ol></li><li> İntranazal instilasyon (eğitimli bir operatör 10 saniye içinde) yapılabilir. <ol><li> Dik tutulan Sırtında (Şekil 4B) sokuldu tek elli fareyi tutun. </li><li> Işaret parmağı kullanarak, baş desteklemek ve çeneyi tutmak için başparmak kullanın balgam (Şekil 4C) önlemek için kapalı. </li><li> Aşama 2.3.8 de tarif edildiği gibi, hazırlanan C sağlamak albicans çözüm hacmini telkin bir 50 ul için ml başına 2 x10 6 CFU içermektedir. NOT: İkinci kritik nokta aşılanan birimdir. Daha düşük 50 ul yetersiz kolonizasyon veya havayolu homojen olmayan damlatma neden olabilir bir hacim, daha geniş bir hacim boğulma / boğulma ve ölüme neden olabilir. </li><li> Burun delikleri için pipet yaklaşarak içi nazal fareyi aşılamak. </li><li> Burun deliklerinde çözeltisi içeren bir kabarcık oluşturan bir 50 ul damla Pipet daha sonra spontaneousl tarafından teneffüsy nefes fare. </li><li> Bir kurtarma alanında yerleştirin Fare (örneğin, bir havai ısıtma lambası ile büyük, iyi havalandırılmış çıplak kafes). Fareler tam uyanış kadar izlenmesi gerekir. O sternum yatma ve doğrulma refleksi sürdürmek için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Bu noktada, bir fare normal muhafaza kafesine geri döndürülebilir. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa -kaynaklı Akut Akciğer Enfeksiyonu NOT: Fareler dört Aşağıdaki günlerde tartılır. Normalde, fareler C. sırasında kilo albicans aracılı havayolu kolonizasyonu (Şekil 2A). <ol><li> P ihtiva eden bir süspansiyon hazırlayın aeruginosa O / N büyüme (bölüm 2.2) sonra instilasyonunun gün. </li><li> (Bölüm 3.1) yukarıda tarif edildiği gibi kısa bir süre anestezi sevofluran inhale kullanılarak. NOT: Akut akciğer enfeksiyonu gerçekleştirmek için, önerilen bakteriyel yükü önerilenTablo 1. </li><li> Post-instillation kurtarma özel dikkat (bölüm 3.2) yukarıda tarif edildiği gibi fareyi aşılamak. </li></ol> Akciğer Hasarı Endeksi 5. ölçün <ol><li> FITC-işaretli albümin ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. Hayvan ötenazi önce bu çözelti 2 saat enjekte edilir. <ol><li> Uygun ekipman ile albümin-FITC 0.2 mg tartılır. </li><li> 1 ml PBS içinde 0.2 mg ekleyin. Kısaca vorteks. Derhal kullanılmadığı takdirde, ortam ışığına maruz kalmasını önlemek için folyo çözüm yerleştirin. </li><li> Her bir fare FITC-işaretli albumin çözeltisi intraperitoneal olarak 200 ul enjekte edilir. </li></ol></li><li> Ötenazi <ol><li> Geçen ağırlık verileri için fareler tartılır. </li><li> % 5.47 pentobarbital 300 ul: pentobarbitalin letal doz aşımı bir intra-peritonal enjeksiyon kullanılarak araştırma komitesi kurallarda hayvanlarda lokal kullanımı ile uygun olarak, tek fare öldürülür. </li><li> Kafesinden fareyi çıkarın ve l alıroperatör tarafından Ethal enjeksiyon. </li><li> Enjeksiyonu takiben, herhangi bir diğer hayvanlardan gizli bir kafes, tek başına fare aktarmak. Hareketin yokluğunda kadar fareyi gözlemleyin. Onay ölüm hareketi, özellikle de solunum hareketi, nabız eksikliği olmaması gereğidir. </li><li> Bu nedenle anestezik ne analjezikler olmadan, ölü hayvanlar üzerinde numunelerin cerrahi koleksiyon gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahi numune toplama: Göğüs aşama. NOT: steril koşullar oluşturmak için, her cerrahi biyo-güvenlik seviyesi 2 ortamında, steril ekipmanı ile ifa edilir. <ol><li> Cilde etanol uygulayın. Makasla orta karın için sternum orta hat cilt kesisi yapın. Her iki tarafta göğüs kafesi boyunca orta hat insizyon itibaren. Göğüs kafesi görselleştirmek için toraks iki tarafında cilt geri katlayın. </li><li> Sırayla clavicles yukarı doğru gidiyor her iki tarafta göğüs kafesi dikey bir kesi yapın kıç ile tüm göğüs ön duvarı dayamak için muktedirum kalp ve akciğerler (Şekil 5A, 5B) mükemmel görselleştirme sağlıyor. </li><li> Interventriküler arter yanındaki kalbi delinmesiyle ön heparined şırınga kullanarak kan toplayın. Plazmanın en az 100 ul elde etmek için 500 ul en az çekin. Buz üzerinde kan örneğini yerleştirin. </li><li> Trakea (Şekil 5B ve 5C) görselleştirmek için bir orta hat servikal insizyon gerçekleştirin. Dikkatle trakea etrafında fasya teşrih. Trakea (Şekil 5C ve 5D) arkasında bir dikiş yerleştirin. Ardından dikiş doğru lavajı sağlamak için cannulating iğnenin etrafına kapalı olacaktır. </li><li> 20-G modifiye gavaj iğne (Şekil 5D ve 4A) ile trakea boşaltın. Önceden yerleştirilen sütür ile kanüle trakea etrafında bir cerrahi düğüm. </li><li> Bronkoalveolar lavajlar (BAL) gerçekleştirmek için, yavaşça ve kademeli olarak enjekte ve akciğer / &#39;içine buz gibi soğuk PBS 500 ul çizin. I üzerinde örnek yerleştirince hücresel lizis önlemek için. </li><li> Adımı yineleyin 5.3.6, 3 kez 2 ml santrifüj tüpüne (Şekil 5E) içine 1500 ul BAL sıvısı ve havuz lavaj örneklerinin toplam elde etmek. </li><li> Göğüs akciğerleri çıkarın. 80 ° C - 1,5 ml santrifüj tüpüne (boyut, bir akciğer ya da lob yarısına karşılık gelmelidir) ve en hızlı bir şekilde saklamak akciğer segmenti yerleştirin. </li><li> Bakteriyel yük tespit ve buz üzerine yerleştirin PBS içeren bir önceden tartılmış hemoliz tüpü bir akciğer segmentleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahi numune toplama: Karın aşama. <ol><li> Karnın sol tarafında başka bir kesi yapın. Periton yoluyla dalak gözlemleyin. </li><li> Dalak çıkarın ve buz üzerinde ikinci bir hemoliz 1 ml PBS içeren tüp ve yerine koyun. </li></ol></li><li> Akciğer hasarı indeksi Not: Alveoler kapiler membran geçirgenliği ölçülerek değerlendirilir FITC etiketli albumin sızıntısını vasküler bölmeden alveoler-interstitial bölmesi. <ol><li> Santrifüj kan örneği ve 1500 x g&#39;de 10 dakika boyunca BAL sıvısı. Yeni santrifüj tüplerine süpernatantlar toplayın. Peletler işe plazma veya BAL hucrelere karşılık gelır ve buz üzerine yerleştirilir. </li><li> 96 çukurlu bir saydam plaka (300 | il kuyu) her bir kan yüzer (plazma, sarı) veya BAL süpernatanın 100 ul ekle. Hemen kullanılmadığı takdirde plaka üzerinde bir folyo koyun. </li><li> Floresan plazmada düzeyleri ve floresan mikroplaka okuyucu (; emisyon, 520 nm uyarma, 487 nm) kullanılarak BAL süpernatantlar ölçün. </li><li> Floresan oranı hesaplayarak akciğer hasarı indeksi belirleyin [(BAL süpernatanı / kan süpernatant) x 100]. </li></ol></li><li> Bronkoalveoler lavaj (BAL) diferansiyel hücre sayımı. Not: Adım 5.5.1 BAL sıvısının santrifüj elde edilen hücre pelletini kullanın. <ol><li> Gerekirse, kırmızı hücre lisis tampon kullanın. Cel ihtiva eden bir santrifüj tüpüne kırmızı hücre lisis tampon 500 ul eklel pelet. Kısaca vorteks ve buz üzerinde 10 dakika bekletin. Kırmızı-hücre parçalama durdurmak için 500 ul PBS ekleyin. </li><li> 1,500 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile hasat hücreleri. Süpernatantı ve steril PBS 1 ml hücre pelet askıya. Hücreleri Count bir Hemasitometre kullanarak. Bir Mallassez hematositometre üzerinde hücreleri numaralandırmak. Bir Sitospin bir slayt hücreleri konsantre. </li><li> Hücre tanımlama ve sayımı (makrofajlar, lenfositler, nötrofiller) izin renklenme kiti kullanılarak leke hücreleri. </li></ol></li><li> Akciğer bakteriyel yükü ve bakteriyel yayma Not: Akciğer bakteriyel yükün ve bakteriyel yayma, akciğer ve dalak değerlendirmek için, sırasıyla toplanmış ve PBS (aşama 5.3.9) 1 ml ihtiva eden önceden tartılmış hemoliz tüpleri içine depolanmıştır. <ol><li> 1 ml PBS ve akciğer veya dalak birini içeren hemoliz tüpleri tartılır. Akciğer homojenatları ve dalak homojenatları elde etmek için bir doku homojenleştirici ile örnekleri homojenize. </li><li> Doku homo 100 ul yatırınSeri seyreltiler logaritmik elde etmek için steril PBS 900 ul ihtiva eden santrifüj tüplerine genates. </li><li> P. BCP-agar ya da üzerinde son iki uygun seyreltilmiş örnekleri (10 -3 ve 10 -2) Plakalı aeruginosa veya C için agar YPD-amikasin-desteklenmiş albicans akciğer ve dalak yükü tayini. </li><li> 37 ° C&#39;de plakaları O / N inkübe edin. Ertesi gün, plakalar üzerinde koloniler numaralandırmak. </li><li> Ana akciğer ağırlığı sonucu akciğer gramı başına CFU elde edildi. Akciğer örneklem büyüklükleri sonuçları akciğer gram başına CFU olarak ifade edilmelidir, aynı değildir. Dizin için formül şöyledir: [CFU] x [hemoliz tüpü ağırlığı ve akciğer] - [hemoliz tüpü ağırlığı]. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis.">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li><li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection.">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li><li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+lung.">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li><li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Candida+interactions:+an+ecological+role+for+virulence+factors.">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li><li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans:+do+they+really+need+to+stick+together.">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+intestinal+immunity:+same+ballpark,+different+players;+different+rules,+same+score.">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li><li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+repertoire,+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse.">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li><li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator-Induced+Lung+Injury.">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li><li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat.">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li><li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li><li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model.">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li><li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals.">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li><li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1,+an+opportunistic+pathogen.">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li><li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li><li>Faure, E., Mear, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome.">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hayvan modelleri, özellikle memeliler, bağışıklık alanlarında-konak etkileşimin karmaşık mekanizmalar aydınlatmak için yararlıdır. Tabii ki, sadece gerekli olmalıdır hayvan modellerinden elde bilgiye ihtiyaç; aksi halde, hayvanların kullanımı in vitro modelleri ile değiştirilmelidir. Bu hayvan modeli patojen arasındaki etkileşim çok bileşenli bir konakçı tepkisi tarafından aracılık edildiği için, sadece bir hayvan modeli ile temin edilebilir fikir göstermektedir. Bu konak-patojen etkileşimi incelemek için kullanılan fareler olgun ve değiştirilmemiş bağışıklık tepkisi ile 6 ila 10 hafta yaşlı genç yetişkinler bulunmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi odaklanarak zaman C57BL6 / J arka plan fareler tercih edilir. Cinsiyet ve immün yanıtın hormonal döngüsü (özellikle östrojen) bir etkisini önlemek için, erkekler bu nedenle en iyi seçimdir. Istatistiksel öneme elde edilmesi için, grupların deney sonunda, en az 5 bireyler, ancak tüm hayvan experimen tarafından önerilen olmalıdıryon kılavuzları kullanılan hayvan sayısı katı bir en aza indirilmesi ve rafine edilmesi gerekir. Araştırma tesisi hayvanları sağlayan üreticiden Taşıma farelerde stresi neden olur. Sonucu bizim gibi takip eden deneyler değiştirebilir enflamatuar sitokinlerin artan salgısıdır. Ayrıca, yeni bir çevre ve yeni &quot;kafes arkadaşları&quot; strese katkıda bulunur. Sonuç olarak, fareler, yeni konut ortamında çalışma öncesinde en az yedi gün süreyle ortama alıştırıldı gerekir. Bu konut ortamı standart yiyecek ve su ad-lib, bir gündüz / gece döngüsü ve uygun istikrarlı nem ve sıcaklık sağlayan, kontrol edilmelidir. Hem akciğer kolonizasyon ve akciğer enfeksiyonu modelleri uygulama ve maharet gerektirir. Damlatma içi burundan veya, intra-trakeal gerçekleştirilebilir. İkincisi daha zordur ve bağlı anoksik kardiyak arrest riski yüksek eğitimlerle daha uzmanlık gerektirir. Gerçekten de, PRocedure başarıyla az 15 saniye ve bu nedenle gerekli derin anestezi fare entübe gerektirir. Uygulama yolu, daha az riskli gerektiren hafif anestezi erişilebilir ve bu nedenle daha tekrarlanabilir olduğu burun içi damlatma bizim seçim yapmak kolaydır. Boutoille diğ önce FITC etiketli albümin 16 kullanılarak alveoler-kapiller bariyer geçirgenliğinin ölçümünde yoluyla akut akciğer hasarı modeli, akciğer hasarı, özellikle değerlendirme tarif. Deney başına farelerin sayısını azaltmak için, bu yöntem adapte bronkoalveoler lavaj (BAL) ile birleştirilmiştir. Boutoille ve arkadaşları çalışmalarında, akciğer homojenatı süpernatanlarında FITC etiketli albumin floresans ve kan süpernatanları 17 arası karşılaştırma kullanılır. Tam olarak bu karşılaştırmayı yapmak için, hemoglobin düzeyi ve hematokrit düzeyleri de gereklidir. Bu yöntem, allo uyarlanmıştırhomojenizasyon ve akciğer hasarının değerlendirilmesi ve lavaj ve konak yanıtının çalışmaya diğer bir akciğeri ithaf ile konak yanıtının eşzamanlı analiz w. Gerçekten de, BAL sıvısındaki sitokin seviyeleri, protein salgılanması ve hücre işe değerlendirmek için de kullanılabilir. Bizim adaptasyon hayvan deneyleri rehberlerinde önerildiği şekilde knock-out fareler 17 kullanırken, özellikle maliyet ve farelerin gerekli sayısını azaltarak, tek bir hayvan deneyinde daha sonuçlar sağlar. Ayrıca, akciğer bir parçası total RNA ekstraksiyonu ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu veya histolojik analizini gerçekleştirmek için -80 ° C sıcaklıkta tutulur. Bir önceki yöntem ve BAL ile birleştiğinde yeni adapte yöntemin karşılaştırılması karşılaştırılabilir sonuçlar (Şekil 3A) akciğer hasarı endeksi değerlendirmek gösterir. Aynı prosedürler kullanılarak Mear ve arkadaşlarının çalışmasında, analiz akış sitometresi BAL sıvısının santrifüjleme ile elde edilen BAL hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Benzer birnalyses akciğer 12 toplam akciğer hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, FITC etiketli albümini akciğer hasarı incelemede ise, FITC (yeşil floresan protein ile aynı kanal) ile oluşturulan artefaktlardan, eşzamanlı olarak gerçekleştirilemez. Akış sitometri gerekiyorsa, bu nedenle, deneyler buna göre planlanmalıdır. Ötenazi zamanlaması kritik öneme sahiptir. İlk 72 saat boyunca akut akciğer enfeksiyonu modeli, zamana yayılmış bir şekil 3 sunulmuştur. Bu modelde, akciğer harabiyeti ve konak yanıtının doruk (3 Şekil) ila 24 saat arasında 36 oluşur. Böylece, tasarımında 24 saat uç noktası 3 nedenlerden dolayı, okuma çıktısı olarak seçilmiştir: birincisi, ikinci, bağlı son 24 ve 36 saat arasında ve mortaliteye farelerin kaybını önlemek için laboratuarda düzenlemek için kolay, konak yanıtı bu kez noktasında maksimum çünkü. Bizim etkileşim çalışmasında ilk adımı olan hava yolu kolonizasyonu olan &lt;em&gt; C. albicans arasından seçilir. Fare başına 10 5 CFU bir instilasyonunu kullanarak, 4 günlük bir sebat modeli herhangi akciğer hasarı olmadan elde edilir. Aslında, fareler, bu aşamanın süresi boyunca ağırlık kazanmıştır. Enfeksiyona karşı ağırlık kazancı kolonizasyonu doğrultusunda yaralanması olmaksızın yararlı bir göstergedir. Nitekim, artan başlangıç ​​yük (fare başına 6 üzerinde 10 CFU) bağlı akciğer hasarı (Şekil 2C) ve vaka fareler kilo kaybetmiş olan çok astar ötesinde zararlı konak-cevap, (Şekil 2B). Aksine, daha küçük bir başlangıç ​​yükü (fare başına örneğin 10 4 CFU) bir hava yolu kalıcı modeli elde edilememiştir kullanılmıştır. Böylece, Mear ark 12 tarafından tarif konak bağışıklık gözlenen hazırlanmasını elde etmek için, telkin mantar yükünün kalibrasyon başarısı için önemlidir ve kilo eğrisi izleme önemli bir kontroldür. Aynı hassas P. için gereklidir aeruginosa </em&gt; akut enfeksiyon ikna etmek. Yetersiz inokulum akciğer hasarı ve P. yol açmaz aeruginosa hızla uygun bir konak-cevap ile solunum yollarında temizlenir. Aşırı yüksek başlangıç ​​P. kullanma aeruginosa konak savunma kapasitelerini aşan, hatta yük sonuçlanan uygunsuz ve derleterious cevabı indükler gruplar arasındaki tüm farklılıkları silme masif akut yaralanma ve ölüme yol açar. Akut hasara yol için uygun aşı fonksiyonel tip-3 salgılama sistemine (T3SS) ve ekzotoksin U, konakçı hücre sitoplazması içine T3SS tarafından transloke toksin üretiminin varlığına bağlıdır. Bu iki suş spesifik özellikler ilk bakteri yükünün seçiminde dikkate alınması gerekmektedir. Alt ve üst sınırlar örnekleri T3SS-negatif ya da pozitif suş ve suşları ekzotoksin U üreten veya (Tablo 1) ile akut akciğer hasarı neden olarak ilk bakteriyel yükler Bu makalede önerilmektedir. Okuyan zamanT3SS katılımı, streyn O / N büyütüldü ve aşı hazırlanması T3SS optimal aktivitesi elde etmek için önce, yeni LB ortamı 3 saat ile canlandırabilir zorundadır. P. sonra bakteriyel ve fungal yükünün 24 saat belirlenmesi aeruginosa -kaynaklı akciğer enfeksiyonu bu bölümde ele belirli hususlar gerektirir. Gerçekten de gösterildiği gibi, fareler, 24 saat irade akciğerlerde 5 x 10 6 CFU T3SS pozitif soyu, bakteri yükünün ile enfekte olduğunda yaklaşık 1 log (Şekil 3C) düşmüştür. Numunelerin seri seyreltileri, 5-log seyreltme kadar yapılmış ve BCP-agar plakaları üzerine kaplanmıştır gerekir. C ile ilgili akciğerlerde albicans, 72 saatte, fungal yükünün yaklaşık 2 log düşmüştür ve numuneler koloni tanımlanmasını kolaylaştırmak için amikasin ile takviye YPD-agar üzerine kaplanmıştır edilmesi gerekir. Son olarak, bakteriyel yayılması belirlenmesi BCP-agar üzerinde kan numunesinden 100 ul kaplama ile veya dalak h 100 ul kaplama ile değerlendirilebiliraynı ortama omogenates. Iki yöntem zaten karşılaştırıldı ve dalak kültürü daha doğru gibi görünüyor mu bulundu. Nitekim, dalak &quot;filtreler&quot; tam kan ve &quot;konsantre&quot; ve bakterileri korumak olabilir kanı üzerine yayılmış olan bu bir organdır. Böylece, dalak homojenatları kandan daha yüksek duyarlılıkla akut akciğer enfeksiyonu sırasında sistemik bakteriyel yaygınlaştırılmasını yansıtmaktadır. Kan örnekleri çok özel belirli bir zamanda bakteri yayılmasını temsil eden ve gerçekten bir bütün olarak bakteriyel yayılması olgusu yansıtmayabilir. Bu nedenle, dalak Homojenat kültürleri tercih edilir. Akciğer hasarı göstergesi enfeksiyon ve / veya uygun bir ev sahibi tepkisi ve bu bileşenlerin potansiyel terapötik etkisi kaynaklanan akciğer hasarı hassas olarak belirlenmesidir. Ayrıca, bu viv o modeli konak yanıtını incelemek için birkaç farklı örneklerin toplanmasını sağlar. Akciğer RNA çıkartması ve analizi için kullanılabilirgen transkripsiyonu. Akciğer numuneleri ayrıca histolojik gözlemler paraformaldehid (PFA) içerisine yerleştirilebilir. BAL sıvısı gibi enflamatuvar sitokinlerin protein salgılanmasının değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Son olarak, iletişim kuralı, yukarıda ele alındığı gibi akış sitometri analizi için numuneler sağlamak için adapte edilebilir. Son olarak, bu protokol C modelize uyarlanabilir Böyle Staphylococcus aureus 18 veya Enterobacteriae olarak ventilatör ilişkili pnömoni dahil albicans- mikroplar etkileşim. Başka bir adaptasyon bakterileri kullanarak yerine C havayolu kolonizasyonu olabilir albicans bronşektazi gibi kronik iltihaplı akciğer hastalığı bakteriyel etkileşimi modelize için. bağışıklı kompetan farelerde bakteriyel boşluğu kalıcı bir hava yolu kolonizasyonuna izin vermez, çünkü, bu amaçla, bağışıklığı fareler kullanılacak olan. Damlatma için, hayvan tutan elin pozisyonu cri olantical. Zaten önceki bölümde vurgulandığı gibi içi nazal fareyi instilling zaman, operatör o ağız mükemmel çözümün ekspektorasyonuna önlemek için kapalı olduğundan emin olmalısınız. Thumb tüm instilasyon prosedürü (Şekil 4B) sırasında kapalı ağız çene destekler ve korur. Daha sonra, diğer elle pipet kademeli ve yavaşça kabarcık oluşmasmı önlemek üzere hava olmaksızın aşılanan burun deliği (Şekil 4C) ve çözeltinin üzerine bırakılır. Açıkçası, instillation seviye 2-biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. Örneklerin toplanması operatörünün certifed küçük hayvan cerrahi eğitim gerektirir. Her bir adımda, örnek hücre lizizi önlemek ve denatürasyon proteinleri korumak için buz üzerine yerleştirilmelidir. Temel cerrahi aletler (Şekil 4A) gereklidir. Bunlar, kullanımdan önce otoklavlanarak sterilize son verilmelidir. Farklı bir cerrahi alet takımları ABDOMİNAL için kullanılması önerilirl ve akciğer örneklerin çapraz kirlenmenin önlenmesi göğüs cerrahi basamaklar. Cerrahi diseksiyon farklı kritik adımlar (Şekil 5A-5E) sunulmuştur. Fare konumunun çok önemli olduğu; o operatör ve düz kafa karşısındaki geri döndü hayvan düz hareketsiz olmalıdır. Etanol liberal cilt örneklerinde saç yayılmasını ve potansiyel bakteri bulaşmasını önlemek için ilk insizyon öncesi hazırlık için kullanılmalıdır. Cilt iyi kanlanan ve kanama (Şekil 5A) önlemek için dikkatli çekilmelidir. Sonra göğüs kafesi göğüs kafesi sürekli insizyon sırasında kalp ve akciğerlere zarar görmesini önlemek için cımbız pençesinde tutulmalıdır sırasında lateral göğüs kesi takip reclined edilir. Akciğer ve Kalp (Şekil 5B) maruz kalmaktadır. Bulaşmamış akciğer beyazımsı (Şekil 5B) görünür. Servikal bölgenin Diseksiyon trakea ortaya çıkarır ve bir dikiş arabaefully üst trakea (Şekil 5C) arkasına yerleştirilir. Trakea kanülü dikkatle gerçekleştirilmelidir. Büyük boy bir kanül kullanmayın (maksimum boyutu 20 G). İki kıkırdak halkaları arasında membranöz trakea küçük bir ön kesi kanül yerleştirmeyi sağlar. Kanül karinaya (Şekil 5D) Yukarıdaki trakea yoluyla şeffaflık tarafından bakıldığında, dikiş sıkıca kanül (Şekil 5E) etrafında emniyet trakea etrafında bağlıdır. Kanül kadın limanlarına bağlanan 2 şırınga ile bir 3-yollu erkek Luer-lock vanasına bağlanır. Bir şırınga buz gibi soğuk PBS bronkoalveoler lavaj için içerir; Diğer BAL sıvısı geri çekmek için boştur. Bu şırınga gruplar arasında chaged edilmelidir. Sonuç olarak, akut akciğer hasarı modelinde öncesinde astar patojenlerin arasındaki in vivo konak-aracılı etkileşimleri keşfetmek için uygun ve güçlü bir modeldir. Hayvan kullanımıAna sınırlama ve dikkatle in vitro elde bilgilere karşı değerlendirilmelidir.

Hayvan modelleri, özellikle de fare, yoğun patojenlere karşı bağışıklık karşılıklarını keşfetmek için kullanılmıştır. Doğuştan ve edinsel bağışıklık kemirgenler ve insanlarda 7 arasında farklılık göstermekle birlikte, ıslah kolaylığı ve çok sayıda genler için tırnakları geliştirilmesi, bağışıklık tepkilerini 8 incelemek için farelere mükemmel bir model olun. Bağışıklık tepkisi karmaşıktır ve bir patojenin etkileşimi sonucu, yerleşik flora ve çeşitli immün (lenfositler, nötrofiller, makrofajlar) ve non-immün (epitel hücrelerinde, endotel hücreleri) hücre türleri 2. İn vitro çalışmalar, gözlem izin vermez Bu karmaşık etkileşimler ve ağırlıklı olarak benzersiz hücre-patojen etkileşimleri odaklanın. Hayvan modelleri dikkatle kullanılmalıdır ve çok özel ve ilgili sorulara sınırlı olmalıdır iken, fare modelleri in vivo memeli bağışıklık tepkisi içine iyi bir fikir verir ve önemli klinik sorulara 7 bölümlerini hitap edebilir. 6 çok sayıda ilişkilendirme karmaşıktır. Ne bir &quot;normal&quot; bir hava yolu mikrobiyomları teşkil belirlenecek devam ederken, yerleşik topluluklar sık ​​sık polimikrobiyaldir, ve çeşitli ekolojik kaynaklardan. Süpüratif kronik akciğer hastalığı (kistik fibrozis, bronchectasis) olan hastalar ya da mekanik ventilasyon hastalar çevre edinilen mikroorganizmalar 9 ile bağlı solunum yollarının kolonizasyonu belirli bir bitki örtüsü sergilerler. Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans, hem sorun sık sık trakeobronşiyal örneklerinden birlikte izole, 5 patojenler olan ve özellikle yoğun bakım ünitesi (YBÜ) 4, bu hastalarda şiddetli fırsatçı enfeksiyon sorumlu değildir. P. karşı anti-mikrobiyal tedavi YBÜ sonuçlarında akut pnömoni sırasında bu mikroorganizmaların izolasyonu aeruginosa but maya genellikle bu sitede 5&#39;de patojenik olarak kabul edilmez. P. arasındaki In vitro etkileşimleri aeruginosa ve C. albicans yaygın bildirilen ve bu mikroorganizmaların büyümesini ve birbirlerinin yaşam süresini etkiler ancak çalışmalar sonucuna olamayacağını gösterdi olması halinde C. varlığı albicans konak 10 zararlı veya yararlı olduğunu. Fare modelleri P. bu alaka yönelik geliştirilen aeruginosa ve C. in vivo albicans, ancak mikroorganizmalar arasındaki etkileşim önemli nokta değildi. Nitekim, model C katılımını değerlendirmek için kurulmuştur konak immün yanıtın ve sonucun albicans. Roux ve arkadaşları tarafından kurulan bir önceki model zaten C ile ilk kolonizasyon kullanılan albicans P. tarafından uyarılan akut akciğer enfeksiyonu takiben aeruginosa. Onların modeli kullanarak, yazarlar p zararlı rolünü bulunduanterior C. albicans 11 kolonizasyon. Ancak Roux ve arkadaşları C&#39;lik bir yüksek yük kullanılan 3 ardışık gün boyunca 2 x 10 6 CFU / fare ile modelinde albicans arasından seçilir. Biz C&#39;lik bir 4 günlük bir modeli kurulmuş albicans havayolu kolonizasyonu veya bu modelde C akciğer hasarı olmadan en az sebat, az albicans fare (Şekil 2B) 12,13 başına 10 5 CFU tek bir uygulamasından sonra 4 gün öncesine kadar geri alındı. 4 gün sonra, iltihaplı hücre alımı, enflamatuar sitokin üretimini ne de epitel hasarı bir kanıt gözlenmedi. C tepe varlığı, 48 saat, - 24 &#39;de albicans, hücre ve sitokin doğal immün yanıt gözlemlendi bile, akciğer hasarı hiçbir kanıt yoktu. Şaşırtıcı bir şekilde, fareler, böylece C ile kolonize P. instilasyonunu intranazal albicans 48 saat önce aeruginosa P. ile farelere kıyasla enfeksiyonu zayıflatılmış olan yalnız aeruginosa enfeksiyonu. benndeed fareler az akciğer hasarını sergilenen ve bakteriyel yükün 12,13 azalmıştır. Birkaç hipotezler C ile önceden kolonizasyon bu olumlu etkisi açıklayabilir P. albicans aeruginosa akut akciğer enfeksiyonu aracılı. Birincisi, her mikroorganizmaları nisabı-algılama sistemleri, homoserinelactone tabanlı P. karıştığı bir türler arası çapraz konuşma aeruginosa sistemi ve farnesol tabanlı C. albicans sistemi değerlendirildi. İkinci olarak, C. akciğer epitel hücrelerinden patojenin aktarma P. aeruginosa için &quot;tuzak&quot; bir hedef olarak hareket albicans çalışılmıştır. Her iki hipotez (yayınlanmamış veri) geçersiz bulundu. Üçüncü hipotez C. tarafından doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir &quot;priming&quot; o oldu P. karşı geliştirilmiş bir sonraki doğal tepki sorumlu albicans aeruginosa. Bu son hipotez doğrulanmıştır. Nitekim C. albicans kolonizasyon doğal bağışıklık bir prime throu yol açtıGH IL-22, özellikle artan bakteriyel boşlukla sonuçlanan, doğuştan gelen lemfoid hücreleri tarafından salgılanır ve akciğer hasarını 12 azalttı. Sonuç olarak, bir ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin modüle edilmesi ve farklı enflamatuar hücre tipleri kapsayan mikroorganizmalar arasındaki etkileşimde bir rol oynamaktadır. Bu karmaşık etkileşmeler bağışıklık in vitro parçalara edilebilir olsa da, ilk hipotez, sadece in vivo modeller, uygun sağlanabilir. Aşağıdaki protokol, diğerleri mikroorganizmalar adapte edilebilir konukçunun yol açtığı patojen etkileşimi üzerinde in vivo çalışmalara bir örnek sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="729">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevorane, Sevoflurane</td>
			<td style="width:185px;">Abott</td>
			<td style="width:161px;">05458-02</td>
			<td style="width:167px;">250 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence Reader Mithras&#160; LB940</td>
			<td style="width:185px;">Berthold Technologies</td>
			<td style="width:161px;">reference in first column</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromo-cresol purple agar</td>
			<td style="width:185px;">Biomerieux</td>
			<td align="right" style="width:161px;">43021</td>
			<td>x20 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pentobarbital sodique 5,47%</td>
			<td style="width:185px;">CEVA</td>
			<td align="right" style="width:161px;">6742145</td>
			<td>100 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-headed valve&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Distrimed</td>
			<td align="right" style="width:161px;">92831</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile inoculation loop 10 &#181;L</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10175</td>
			<td>x1000 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insuline syringes 1 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">30003</td>
			<td>per 100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 positions Culture tube 8 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">64300</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrospec 10&#160;</td>
			<td style="width:185px;">General Electric life sciences</td>
			<td style="width:161px;">80-2116-30</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemolysis tubes 13 x 75 mm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Gosselin</td>
			<td style="width:161px;">W1773X</td>
			<td>per 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:185px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10010023</td>
			<td>packaged in 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">amikacin 1g</td>
			<td style="width:185px;">Mylan</td>
			<td align="right" style="width:161px;">62516778</td>
			<td>per 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin 10 000 UI in 2 mL</td>
			<td style="width:185px;">Pan pharma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">9128701</td>
			<td>x 10 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RAL 555 coloration kit</td>
			<td style="width:185px;">RAL Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:161px;">361550</td>
			<td>3 flacons of 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">55.526.006</td>
			<td>x&#160; 1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transparent 300 &#181;L 96-well plate</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">82 1581500</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yest-peptone-Dextrose Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">95763</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-albumin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9771</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">L3022</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25-gauge needle</td>
			<td style="width:185px;">Terumo or unisharp</td>
			<td style="width:161px;">A231</td>
			<td>x100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A78300003</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

Konak-patojen etkileşimi incelenmesi mikrobik enfeksiyon sırasında patojenite altında yatan mekanizmaları anlamak için bize sağlar. Ev sahibi prognozu patojenin 1 karşı adapte bağışıklık tepkisinin katılımı bağlıdır. İmmün cevap patojenler ve çeşitli immün ya da non-immun hücre tiplerinin 2 etkileşiminden karmaşık ve sonuçlar olduğunu. In vitro çalışmalar, bu etkileşimlerin karakterize ve hücre-patojen etkileşimleri odaklanmak olamaz. Dahası, özellikle süpüratif kronik akciğer hastalığı olan veya mekanik ventilasyon uygulanan hastalarda hastalarda havayolu 3&#39;te, polimikrobial topluluklar mevcut ve konak-patojen etkileşimi zorlaştırıyor. Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans, hem sorun sık sık trakeobronşiyal örneklerinden izole, 4 patojenler olup, Özellikle yoğun bakım ünitesinde 5, şiddetli enfeksiyonlara ilişkili. Mikrobiyal etkileşimler varin vitro bu patojenlerin arasında bildirilen ancak bu etkileşimlerin klinik etkisi 6 belirsizliğini koruyor mu. C. Albicans ve P. arasındaki etkileşimleri incelemek aeruginosa, C. bir murin modelinde Bir P. tarafından takip albicans hava yolları kolonizasyonu, aeruginosa- aracılı akut akciğer enfeksiyonu yapıldı.

Protokol açıklaması sırasında önce gördüğümüz gibi, deney (: deney çizelgesi Şekil 1) tamamlamak için 5 gün gerekiyor. Bir operatör deney tüm çalışma sırasında İstenen ve 10 fareden maksimum süreçleri işleyebilir. Daha fazla hayvan gerekiyorsa, iki kişi özellikle cerrahi numune toplama için gereklidir. Gerçekten de, tüm numuneler son farelerde FITC etiketli albümin artmış pasif alveolar kapiler sızıntıyı önlemek için 2 saat altında toplanması gerekir. İlk adım C hazırlanmasıdır albicans aşı ve burun içi instillasyon C. havayolu kolonizasyon elde etmek için albicans arasından seçilir. A 4 gün-sebat modeli C 5 x 10 5 CFU burun damlatılması ile elde edilir fare başına albicans (Şekil 2B). Bu 4 gün boyunca fareler l indüklemez 5x10 5 CFU ağırlığı (Şekil 2A) ve damlatma kazançung yaralanma (Şekil 2C). C. rağmen Bu modelde 4 gün, 48 saat sonra yük azalır kadar albicans devam edebilir. Bu nedenle, P. aeruginosa -kaynaklı akut akciğer enfeksiyonu C 48 saatte perfomed edilir albicans kalıcılık. Klinik akciğerin 75% 15 izole olarak P. aeruginosa&#39;nın PAO1 önemli hastalık oluşturma faktörü, tip üç salgılama sistemi (T3SS) ihtiva eden büyük ölçüde, özelliği laboratuar suşudur. Tezler nedenlerle, PAO1 akut akciğer enfeksiyonu hayvan modellerinde ilgili bir suşudur. Akciğer hasarı akciğer hasarı indeksi olarak ifade havayolu içine damar bölmeden protein kaçağı ile ölçülen alveolo-kılcal geçirgenliği ile belirlenir. Inokulum (Şekil 3A) ile akciğer hasarı artar. Burada önceden olmayan yalnız PAO1 ırkının (5x10 6 CFU / fare) (Şekil 3B-3F) ile indüklenen eden modeli akut akciğer hasarı bileşeninin kinetiği raporC. aracılı emişli albicans-. Modelin soyu ve zaman seyrinin başlangıç ​​P. seçimine bağlı olarak aeruginosa inokulum sonraki bölümde ele alınmış ve Tablo 1&#39;de önerilmektedir. Grup başına beş fareleri kullanılmıştır. Akciğer hasarı indeksi (Şekil 3B), akciğer (Şekil 3C), bakteriyel yayılmasını (Şekil 3D), BAL sellüler (Şekil 3E) ve ayırıcı hücre sayısı (Şekil 3F) yansıtıcı dalakta, bakteriyel yükü, bakteriyel yükü her 12 belirlendi hr. Akciğer hasarı 24 saat ve 36 saat sonra enfeksiyon (Şekil 3B) arasındaki maksimum olmuştur. Bakteriyel yük gösterdi 1-log her 24 saat (Şekil 3C) azaltmak ml / CFU. Dalak Homojenat kültürler tarafından değerlendirilen Toplu bakteriyel yaygınlaştırma her gün (Şekil 3D) arttı. Son olarak, enfekte edilmemiş farelerde BAL sellüler esas olarak (% 90) oluşmaktadır birlikte oEnfekte farelerin BAL f alveoler makrofajlar, nötrofiller yaygın alındı ​​ve ayırıcı hücre sayımı% 90 nötrofil ve% 10 makrofajları ve lenfositleri (Şekil 3E, 3F) gösterdi. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig1.jpg" /> Akut Akciğer Yarası Modeli Şekil 1. Timeline C arasında, Host-aracılı Etkileşim Explore albicans ve P. aeruginosa. Bütün prosedürün grafik gösterimi. İlk adım konut tesis farelerin çevreye uyum olduğunu. İkinci adım C&#39;dir albicans havayolu kolonizasyonu aracılı. Son olarak, üçüncü aşama P. aracılık ettiği akut akciğer enfeksiyonu aeruginosa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <pkeep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt;: fo class = &quot;jove_content&quot; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53218/53218fig2.jpg" /> Şekil 2. C. albicans havayolu Kolonizasyon. (A, B) Fare burundan 10 5 CFU C ile telkin edilir albicans (suş SC5314). Fareler C. sırasında kilo albicans aracılı havayolu kolonizasyonu (A). Havayolu kolonizasyon tek başlangıç ​​damlatma ile 3-4 gün uzatılabilir. Bir önceki çalışmada, doğal bağışıklığın astar 24 ve 48 saat arasında gerçekleşir. (n = grup başına 5), ​​hata çubukları ± SD ortalamasını temsil etmektedir. C (C, D) farelerin intranasal olarak damlatılır edilir, 5 x 10 5 ya da 5 x 10 6 CFU albicans arasından seçilir. 24 saat sonra alveol kapiller bariyeri geçirgenliğinin tarafından değerlendirilir akciğer hasarı indeksi (C). Kilo artışı (D) başlangıç ​​ağırlığının yüzdesi olarak (n = grup başına 5) olarak ifade edilmiştir.Hata çubukları ± SD araçları ifade eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53218/53218fig3.jpg" /> Akut Akciğer Hasarı Şekil 3. Model P aeruginosa Bağlı. (A) C57BL / 6J fareleri-nazal olarak içi P. artan yüklere bulaşmış aeruginosa (fare başına 1 x 10 6 7 10 x 5 CFU den) (n = grup başına 5), hata çubukları ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Fareler 24 saat sonra kurban edilmiştir. Akciğer hasarı indeksi bakteriyel yükü ile orantılı artar alveoler-kapiller bariyeri geçirgenliğinin tarafından değerlendirilir. Akciğer hasarı indeksi Karşılaştırılması (bronkoalveoler lavaj üst fazlar kullanılarak akciğer homojenatları süpernatanlarında (siyah çubuklar) ve yeni kombine yöntemi ile gri çubuğu eski yöntem kullanılarak elde edilens) (BF) fareler içi nazal fare başına 5 x10 6 CFU bulaşmış. Fareler akut yaralanma modeli kinetik her 12 ila 48 saat ötenazi. Akciğer hasarı (B), akciğer bakteri yükü (C), dalak bakteri yükü (D), bronkoalveoler lavaj (BAL) selülaritesi (E) ve BAL diferansiyel hücre sayımı (F) de değerlendirilir. (n = 5), grup başına, hata çubukları ± SD araçları temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53218/53218fig4.jpg" /> Şekil 4. Cerrahi Ekipmanları ve Burun damlatma. (A) &#160; Cerrahi ekipmanlar akut yaralanma modeli ve bronkoalveoler lavaj gerçekleştirmek için gerekli. İşte Trakeal kanül (20G) ve iki adet 1 ml&#39;lik şırınga bir Luer-kilit 3-yollu valfe bağlanır. Bir şırınga akciğerlerden dışarı geri bronkoalveoler sıvıyı çekmek için, akciğerlere biri su enjekte etmek. (B, C) &#160; Elinde fare pozisyonu burun içi instilasyon gerçekleştirmek için. Bu fotoğrafta, çene altında başparmak damlatma sırasında kapalı bir ağız sağlamaktadır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53218/53218fig5.jpg" /> Şekil 5. Cerrahi ve Broncho-alveol Lavaj. Göğüs geniş (A) açılır ve göğüs kafesinin kalp (B) yaralanmasını önlemek için yanal açıldı. Kan toplama ardından, servikal bölge trakea (C) maruz disseke edilir. Diş ipi olarak kullanılan birameliyat dikiş ipliği ve nefes borusu (C, D) arkasına geçirilmektedir. Trakea sonra şırınga ve 3-yollu vana üzerine monte (D) kombine 20-G kanül ile kanüle edilir. Trakea sıkıca trakea arkasında yer sütür kullanılarak cerrahi düğüm atarak kanül etrafında güvence altına alınmalıdır. Nihayet PBS 500 ul yavaşça akciğerlerde telkin ve daha sonra BAL yavaşça dışarı çekilir. (E) Sıvı telkin akciğerler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table><tbody><tr><td></td><td> Minimal telkin Yükü </td><td> Maksimum telkin Burden </td></tr><tr><td> T3SS- </td><td> 5 x 10 7 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> T3SS + </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 1 x 10 7 </td></tr><tr><td> T3SS + exoU + </td><td> 5 x 10 <sup&gt; 4 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. S. Akut Akciğer Enfeksiyonu Modellerinde Kullanılan aeruginosa inoküller. Aşı önerilen en uygun burun konsantrasyonları suşları göre akut akciğer hasarı ikna etmek.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.4K Görüntüleme.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Video: Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.