Name: come to the light side: in vivo monitoring of pseudomonas aeruginosa biofilm infections in chronic wounds in a diabetic hairless murine model
Uploaded: 2017-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model at JoVE.com

Yazarlar Amerikan Diyabet Derneği bu eser (Grant # #7-13-BS-180), Devlet Üniversitesi Araştırma teknoloji Michigan Destek Merkezi eğitim ve görüntüleme sistemi vivo içinde erişim sağlamak için destek için teşekkür etmek istiyorum ve Michigan Eyalet Üniversitesi araştırmacı histopatoloji histopatolojik inceleme için fare biyopsileri işlemek için laboratuvarı.

hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Michigan State University tarafından onaylanmış.
 1. hazırlık tıkayıcı sosları ve silikon çubukları <ol><li>şeffaf tıkayıcı soyunma kesmek yapmak için yaklaşık 1 cm x 1 cm makasla kareler.</li>
	<li>Kes 10 mm daire bir 10 mm biyopsi yumruk. 5 mm biyopsi Merkezi'yle 0,5 mm kalın silikon sayfadaki yumruk 10 mm çemberin ortasında ve sıkıca forma bir delik oluşturmak için basın bir &#34; poğaça &#34;-alçıya kullanılacak disk gibi.</li></ol>
 2. deneysel hayvan <ol><li>kullanımı (22-26 g) 8 hafta eski erkek SKH-1 fare--dan bir ticari doğurmak. Fareler yiyecek ve su için 21 ° C ve 12 h koyu döngüsü ücretsiz erişim ile standart koşullar unutmayın.</li>
	<li>Diyabet ikna etmek için fare intraperitonially bir 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand % 25 ile enjekte glikoz (başına 250 µl / fare) üzerinde 5 gün üst üste.
	<ol><li>Tarafından 100 mm sitrik asit, pH 4.5 5 µL 65 µg sulandrarak STZ, STZ çözüm olun.</li>
		<li>Her fare fare vücut ağırlığı 1 kg başına 65 mg STZ son bir kitle için enjekte ses düzeyini ayarlamak. Denetim fare 100 mM sitrik asit çözüm pH 4.5 ile aynı günlerde enjekte.</li>
	</ol></li> <li>Kan şekeri Şeker Ölçüm ile 14 gün sonra son STZ enjeksiyon izleyerek hiperglisemi onaylayın. Diyabetik farelerin polyuria olabilir ve bu yüzden onların yatak ıslaklık ortadan kaldırmak için daha sık değiştirilmesi gerekebilir ve onların ağırlık haftada 3 kez izlenmelidir.</li>
</ol> 3. Biyofilmler <ol><li>biyofilm hazırlık <ol><li>yara aşılamak için Grow koloni biyofilmler 8. İki gün önce ameliyat başlangıç kollarındaki bir gecede kültür P. aeruginosa Xen tryptic soya suyu (TSB) 41 37 ° C'de inkübe ve 200 devir / dakikada sallayarak ve UV maruz polikarbonat membran filtreleri 0.2 µm gözenek boyutu ile sterilize biyolojik Emanet başlıklı yan başına 15 dakika ışık.</li>
		<li>Bir gün ameliyat öncesi santrifüj kapasitesi 20.000 x g 2 min için de gecede kültür ve yıkama Dulbelcco ile 3 kez 1 mL &#39; s fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) tarafından yukarı ve aşağı pipetting.</li>
		<li>Seyreltik DPBS süspansiyon için bir Absorbans 0,05 600 nm.</li>
		<li>Pipet 10 µL seyreltilmiş kültür tryptic soya agar (TSA) tabağa dinlenme her membran üzerinde. Kurumaya bırakmak sonra taze TSA tabakaları bana her 24 h aktarma biyofilmler büyümeye 72 h için 35 ° C'de membranlar kuluçkaya</li>
	</ol></li> <li>Standart eğri <ol><li>deneme başlamadan önce bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri olun.</li>
		<li>Biyofilmler 3,1 açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Görsel olarak homojen bir çözüm üretilir kadar biyofilm DPBS ve vortexing ile karıştırarak 1/24 için ½ değişen biyofilmler seri dilutions olun. Pipet 200µL bir siyah 96-şey plaka ve resim görüntüleme sistemi içinde vivo ile seyreltilmiş çözüm.</li>
		<li>Plaka dilutions TSA levha üzerine yayıldı ve 35 ° c 24 h için kuluçkaya</li>
		<li>Birimleri (CFU) oluşturan colony tabakalarına kadar sayıp bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri oluşturmak.</li>
	</ol></li></ol> 4. Ameliyat yarası <ol><li>1 L/dak Debi genel anestezi (ketoasidoz ölüm önlemek için) % 95 oxygen/5% CO 2 ' isoflurane kullanarak teşvik ve % 1-3 isoflurane kullanarak anestezi korumak. Hayvanlar üzerinde ısı paspaslar ameliyat sırasında korumak.</li>
	<li>Fare derin pedal refleksleri cımbız ile ayak pinching tarafından bastırılır ve yüzükoyun sígara fareyi getirin olun.</li>
	<li>Ağrı yönetimi için alt Kutanöz enjeksiyon (30 μl) üzerinden Meloksikam (0.2 mg/kg) yönetmek.</li>
	<li>% 10 povidone-iyot üç kez arka ve bir isopropanol paneli deri silin.</li>
	<li>Dairesel model fare bir tarafta yara için anahat için bir steril 4 mm biyopsi yumruk kullanın &#39; s orta hat omuzlar düzeyinde. Desen ile kalıcı bir kalem anahat.</li>
	<li>Panniculus carnosus de dahil olmak üzere subkutan doku ile uzanan bir tam-kalınlık yara oluşturmak ve doku dairesel parça tüketim için anahat ve Iris makas ortasında deri kaldırmak için tırtıklı forseps kullanın.</li>
	<li>Tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı tutkal fareler kaplamasına uygulamak ve hafif basınç uygulayarak silikon tahta getirin. Şeffaf bir tıkayıcı soyunma yarayla kapsar. Ameliyattan sonra tek tek hayvanlar kafese.</li>
</ol> 5. Ameliyat sonrası yönetim <ol><li>Meloksikam (0.2 mg/kg) günde bir kez alt Kutanöz enjeksiyon yoluyla önümüzdeki 2 gün için ameliyat sonrası ağrı yönetmek.</li>
	<li>Monitör hayvanlar günlük ağrı ve kilo kaybı belirtileri için. Diyabetik hayvan lüzum insülin iğneleri ne zaman % 15 veya daha fazla vücut ağırlığının kaybettiler.</li>
</ol> 6. Biyofilm Inoculum hazırlanması ve enfeksiyon <ol><li>fareler 48 h ameliyattan sonra aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi aşılamak.</li>
	<li>Kazımak 72 h biyofilmler steril bir spatula kullanarak membranlar üzerinden bir microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 1:2 DPBS'sulandırmak. Kısa bir süre yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix.</li>
	Toplam CFU hesaplamak için TSA plakalar üzerine <li>yayılan plaka inoculum. Sayıları doğru olduğundan emin olmak için bir dizi iki 1 dk vortexing adım adım bir 2 dk sonication 40 kHz ultrasonik bir süpürge ara biyofilm inoculum daha fazla kır.</li>
	<li>Yara ve silikon sabitleyecek ve başvuru için bir cetvel kullanarak ekli fotoğraf makinesi ile mikroskop yarayla bir test almak soyunma kaplama kaldırmak.</li>
	<li>200 µL pipet ipuçları ipuçları kesmek ve biyofilm inoculum her yaranın üzerine 10 µL pipet.</li>
	<li>Görüntüleme sistemi otomatik ayarlarla vivo içinde kullanarak görüntü fare: Pozlama süresi 5-300 s, orta binning, 1 f/stop ve açık filtre ve görüş alanı C ile (12.9 cm x 12,9 cm).</li>
	<li>Kapak yara ile taze soyunma.</li>
</ol> 7. Yara ölçüm ve görüntüleme <ol><li>hayvanlar günlük 9 klinik belirtileri değerlendirmek.</li>
	<li>Yiyecek, su ve kafesleri gerektiği gibi değiştirin.</li>
	Her gün pansuman <li>onay bütünlüğünü. Soyunma olmadığı durumlarda, sadece bioluminescence yara tıkanıklığı nedeniyle ölçülebilir. Gün 8, sosları kaldırılır ve yara kapatma izin ölçüm yerine değil.</li>
	<li>Her gün hayvanlar tartmak.</li>
	<li>Tüm gün için fareler tek tek bir tecrit odasında yeri görüntü görüntüleme sistemi günlük veya arka plan seviyenin ışıldama değerleri düşmek kadar her gün içinde vivo kullanarak bir HEPA filtre ile donatılmıştır.</li>
	<li>Gün 8 sonra genel anestezi teşvik ve filmler bir mikroskop ile yara yara iyileşene kadar her gün başvuru için bir cetvel kullanarak ekli kamerayla çekebilir.</li>
</ol> 8. Histolojik analizi <ol><li>2 l/min CO 2 bir ötenazi bir akışı ile fareler odası ışıldama arka plan düzeyin altına düşer ve yaralar tamamen iyile_melerinin sonra Euthanize. Ölüm ötenazi ikinci bir yöntem olarak servikal çıkığı tarafından onaylayın.</li>
	<li>Geniş, tam eksizyon çevresinde ve yara alan (yaklaşık 1 cm çapında) altındaki oluşturmak ve histolojik analizler için %4 paraformaldehyde dokusunda korumak için Iris makas kullanın.</li>
	<li>Diğer analiz: sitokin algılama <ol><li>toplamak kan retro-orbitally kılcal cam tüp kullanarak anestezi altında hayvanlardan ve EDTA tedavi tüpler için transfer.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 4 ° C'de 20 dk için 2.000 devirde kan ve plazma sitokin hafiye için kımıldama.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>James, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+chronic+wounds.">Biofilms in chronic wounds.</a> Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).</li><li>Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+care+costs+of+diabetic+peripheral+neuropathy+in+the+US.">The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US.</a> Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).</li><li>Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+system+for+quality+improvement+in+ambulatory+care:+assessing+the+quality+of+diabetes+care.">A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care.</a> Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).</li><li>Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+diabetic+foot:+The+economic+case+for+the+limb+salvage+team.">The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team.</a> J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Rocchetta, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+noninvasive,+real-time+imaging+technology+using+bioluminescent+Escherichia+coli+in+the+neutropenic+mouse+thigh+model+of+infection.">Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+direct+method+for+monitoring+antibiotics+in+a+mouse+model+of+bacterial+biofilm+infection.">Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).</li><li>Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antibiotic+penetration+limitation+in+Klebsiella+pneumoniae+biofilm+resistance+to+ampicillin+and+ciprofloxacin.">Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints.">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265 (2013).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge+-+a+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase-mediated+inside-out+signaling+in+HaCaT+human+keratinocytes+and+SKH-1+mouse+skin.">Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin.</a> Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).</li><li>Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UVB+exposure+enhanced+benzanthrone-induced+inflammatory+responses+in+SKH-1+mouse+skin+by+activating+the+expression+of+COX-2+and+iNOS+through+MAP+kinases/NF-&#312;B/AP-1+signalling+pathways.">UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-&#312;B/AP-1 signalling pathways.</a> Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada bir tekrarlanabilir, çevrilebilir ve esnek model oluşturmak için pek çok avantajı vardır biyofilmler diyabetik kronik yaralarda çalışma için yeni bir fare modeli açıklar.
İlk yenilik tüysüz fareler kullanmaktır. Diğer fare modelleri10,11şifa diyabetik kronik yara incelemek için geliştirilmiştir, ama tüm ağda veya saç kırpma ile birlikte ilgili işlemler tarafından kürk kaldırılmasını gerektiren saçlı fare kullanımı dayanıyordu depilatory kremler. Bu adım sadece zaman alıcı ve karmaşık ancak potansiyel olarak yara yerleştirildiği alan hayvanlarda deri kişi yaralandı. Alında saç çizgisi fareler karsinojenezis çalışmalar12,13bir dizi kullanmış iken, bu fareler biyofilm sebat kronik yaralarda değerlendirmek için kullanılmamış. Başka bir ortak sorun çözüldü uzun süreli çalışmalarda özellikle tüysüz hayvan kullanımı tarafından değerlendirilmesi yara iyileşmesi tehlikeye ve bandaj bozabilir yara bölgesinde saç yeniden büyüme var.
SKH-1 hayvanlar da STZ kaynaklı için mükellef kanıtladı tip ı diyabet ve C57BL/6J fare ile karşılaştırıldığında, insülin ile gereksiz dozaj yapma deney süresince istatistiksel olarak anlamlı düşük kilo kaybı vardı. Tedavi insülin ile potansiyel Watters ve ark. tarafından açıklanan diyabetik hayvanlar insülin tedavi ile enfekte bakteriyel sayıları artış (2014)14 kanıtlandığı enfeksiyon sonucu etkileyebilir gibi özellikle ilginç bir özelliktir P. aeruginosa biyofilmler hiç insülin meslektaşları ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, bizim modelinde, mortalite oranları tüysüz kohort hayvanlar potansiyel olarak daha esnek enfeksiyon ile ilgili olduğunu gösteren bir ciddi azalma vardı.
Bu modelin ikinci bir özelliği planktonik yetişkin hücreler aksine yaralar bulaştırmak için ölçülen önceden biçimlendirilmiş biyofilm inoculum Bulamaç uygulamadır. Yaraya bir zaten metabolik olarak karmaşık ve yapılandırılmış bakteriyel topluluk sunarak bakteri hücreleri bağışıklık sistemi kaçmasına edebiliyoruz ve lezyonlar hemen biyofilmler etkilerini belirlenebilir.
Bu yeni yara modelin üçüncü avantajı mikrobiyal zorlanma görüntüleme sistemi dağınık şekilde yerelleştirilmesine ve bakteri ölçmek için bir vivo içinde ile ölçülebilir bioluminescence üretebilen kullanmaktır. Bu zaman içinde biyofilm evrimin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. P. aeruginosa Xen 41 zorlanma P. luminescences luxCDABE operon ultra-hassas kamera tarafından yakalanan ışıldama bünye emisyon sonuçlanan bakteriyel kromozom üzerinde tek bir sabit kopyasını sahip olur. görüntüleme sistemi. Bu gerçek zamanlı, non-invaziv, in situ özellik ateli ve kapak yerinde iken biyofilm bioluminescence tarafından ölçme sağlar. Biyofilm izlemek için belirli zaman noktalarda hayvanlar kurban gerek yok olduğu bu özellik büyük ölçüde hayvan çalışma, gerekli sayısını azaltır. Ancak, biyofilm ve irin varlığı ölçüm yara iyileşmesi tıkandı. Bu çalışmada, yara iyileşmesi, görselleştirme izin vermek için soyunma gün 8 kaldırıldı, ama bu parametre ele alınmaktadır sorular bağlı olarak değiştirilmiş olabilir.
Son olarak, görüntüleme sistemi bioluminescence kadar tespit yeteneğine sahip olduğu gibi 2.5 cm derinlik, yeni önerilen model çözüm veya jeller formunda antimikrobiyal tedaviler test için mükellef veya tıkayıcı pansuman için dahil. Bir gerçek zamanlı enfeksiyon izleme modeli farklı dozaj konsantrasyonları ve süreleri bir statik noktalardan tahlil karşı etkisini ölçmek çok daha fazla esneklik sağlar. Bu model doğrulama biyofilmler kronik yaralarda ortadan kaldırmak için potansiyel yeni tedavilerin katkıda bulunabilir.

Biyofilmler kronik yaralar1zavallı çözümlenmesi için bir faktör olarak vurgulanmış polimer maddelerin bir matris gömülü mikroorganizmaların karmaşık toplulukları bulunmaktadır. Bu son derece organize, kalıcı mikrobiyal nüfus özellikle bacaklarda ve değiştirilmiş çevresel duyusal mekanizmalar zayıf kan dolaşımı undetected lezyonlar2' ye nereye Diyabetik hastalar için önemli bir çalışmadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde bu diyabetik hastaların % 15 hayatları boyunca en az bir ülser gelişecektir tahmin edilmektedir. Bu tedavi3,4, 28 milyar dolar civarında bir ekonomik harcama immensurable duygusal ve sosyal yükünü saymıyorum çevirir. Mikrobiyal topluluklar yara yatak ve şifa olaylarda bu biyofilmler etkisi kalıcı olması izin faktörleri anlamak daha iyi bakımı etkilenen hastalar için sürücü ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi itmek için zorunludur. Bu nedenle, bakteriyel konak etkileşimleri keşfetmek için tekrarlanabilir ve çevrilebilir vivo içinde modeller kurulması her şeyden önemlidir.
Fare modelleri başarıyla biyofilmler kronik yaralarda etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu modeller ancak, sık sık saçlı tür kullanmak ve bakteriyel hücrelerin onları zaman alıcı ve pahalı hale kurban hayvanlardan çıkarılan doku için plaka sayar tarafından biyofilm izni değerlendirmek.
Bitiş noktası örnekleme enfeksiyon değerlendirilmesinde hayvanların bir biophotonic alternatif ilk Contag ve arktarafından önerilmiş. (1995) 5 , kim ışıldama antibiyotik tedavisi etkinliği ölçmek için yapısal kollarındaki Salmonella typhimurium sayfasından yakalamak için bir yöntem geliştirdi. Bioluminescence verilirken bakteri yararlanarak diğer çalışmalar izledi. Örneğin, Rochetta ve ark. (2001) 6 doğrulanmış yoğun bir şarj kuplajlı cihaz kullanarak ışıldama ölçerek Escherichia coli uyluk enfeksiyonlar farelerde çalışmaya bir enfeksiyon modeli ve daha sonra Kadurugamuwa ve ark. (2003) 7 farelerde bir kateter yara modelinde çeşitli antibiyotiklerin etkinliğini araştırmak için Staphylococcus aureus mühendislik bir tür özelliklerini yayan foton kullandı.
Burada karakterize yöntemini diyabet tüysüz farelerde ikna etmek, üretmek ve P. aeruginosa, önceden biçimlendirilmiş kollarındaki biyofilmler yaralarıyla aşılamak ve biophotonic enfeksiyon kontrolü yapmak için basit bir protokol sunar görüntüleme sistemi bir vivo içinde kullanma. O teklif etmek yolu tarif etmek, hızlı, in situ, biyofilmler kronik yaralarda değerlendirmek için non-invaziv ve nicel süreç ve yara iyileşme mikroskobik görüntüleme gibi aralıklı kan toplama için buna ek olarak, ek analiz için sağlar sitokin ölçümleri ve Histoloji terminal dokusu toplamalarında.

<table><tbody><tr><td>Opsite</td><td>Smith &amp;amp; Nephew</td><td>Model 66000041</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4&quot; x 11yards</td></tr><tr><td>SKH-1 mice &lt;strong&gt;Crl:SKH1-Hr&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;hr&lt;/sup&gt;</td><td>Charles River Breeding Laboratories</td><td>SKH1</td><td>Hairless mice, 8 weeks old</td></tr><tr><td>Streptozotocin (STZ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0130-1G</td><td>Streptozocin powder, 1g</td></tr><tr><td>AccuChek glucometer</td><td>Accu-Chek Roche</td><td>Art No. 05046025001</td><td>ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa Xen 41</td><td>Perkin Elmer</td><td>119229</td><td>Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa</td></tr><tr><td>Polycarbonate membrane filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9199</td><td>Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 &amp;mu;m pore size</td></tr><tr><td>Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22091</td><td>Culture agar</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>49755</td><td>Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection</td></tr><tr><td>10% povidone-iodine (Betadine)</td><td>Purdue Products LP</td><td>301879-OA</td><td>Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61899AK</td><td>Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS</td></tr><tr><td>Capillary glass tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td>Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td></tr><tr><td>Silicone to make splints</td><td>Invitrogen Life Technologies Corp</td><td>P-18178</td><td>Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td>Culture broth</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>In vivo imaging system</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Isolation chamber</td><td>Perkin Elmer</td><td>123997</td><td>XIC-3 animal isolation chamber</td></tr><tr><td>HEPA filter</td><td>Teleflex</td><td>28022</td><td>Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022</td></tr><tr><td>Biopsy punches</td><td>VWR International Inc</td><td>21909-142</td><td>Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.</td></tr><tr><td>Biopsy punches</td><td>VWR International Inc</td><td>21909-140</td><td>Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>J.T.Baker</td><td>1916-01</td><td>Dextrose, Anhydrous, Powder</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td>Citric Acid</td></tr><tr><td>Mastisol</td><td>Eloquest Healthcare</td><td>HRI 0496-0523-48</td><td>Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48</td></tr><tr><td>Corning 96-well black plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td>96-well clear bottom black polysterene microplates</td></tr><tr><td>25 gauge 5/8 inch needle</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Regular bevel needle</td></tr><tr><td>Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>N/A</td><td>Ultrasonic Cleaner</td></tr></tbody></table>

come to the light side: in vivo monitoring of pseudomonas aeruginosa biofilm infections in chronic wounds in a diabetic hairless murine model

Bakteri varlığı olarak yapılandırılmış biyofilmler özellikle diyabetik hastalarda kronik yaralarda yara iyileşmesi ve çözünürlük önlemek düşünülmektedir. Kronik fare yaralar modelleri mikroorganizmalar ile ana bilgisayar arasındaki temel etkileşimleri anlamak için kullanılmaktadır. Bugüne kadar geliştirilen modelleri tüylü hayvanlar kullanımı ve uygun bakteri tespiti için yara dokusunun terminal koleksiyonu güveniyor. Bu modellerde önemli anlayış kazanmıştır, bu deneysel bir işlem çok sayıda hayvan gerektirir ve örnekleme zaman alıcıdır. Kronik yaralarda biyofilm ilerlemeyi değerlendirmek için birçok en iyi yenilik içermektedir roman bir fare modeli geliştirdik: bir) tüysüz fareler, epilasyon; ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanır b) önceden biçimlendirilmiş biyofilmler sunan sebat hemen değerlendirilmesi ve bu toplulukların ana bilgisayar üzerindeki etkisini yaralar için geçerlidir; c) biyofilm ilerleme Pseudomonas aeruginosaböylece hayvan çalışma gerekli sayısını azaltarak enfeksiyon gerçek zamanlı izleme sağlayan, bir genetik kollarındaki suşu tarafından ışık üretim miktarının tarafından izler. Bu modelde, tek bir tam-derinlik yara STZ-indüklenen diyabetik tüysüz fareler arkasında üretilen ve P. aeruginosa kollarındaki yük Xen 41 biyofilmler ile aşılanmış. Yaraları hafif çıktı günlük görüntüleme sistemi, in vivo ve in situ hızlı biyofilm görselleştirme ve yerelleştirme biyofilm bakteri içinde yaralar için izin bir vivo kaydedilir. Diğer mikroorganizmaların genetik türler ve çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere, çalışma için kullanılan ve test anti-biyofilm stratejileri antimikrobiyal tıkayıcı sosları da dahil olmak üzere özel değeri olabilir roman bu yöntem esnektir.

Bu yeni modeli geliştirirken, biz geçmişte kullanmış C57BL/6J fareler üzerinde tüysüz SKH-1 kullanarak pek çok avantajı gözlenen. Hayvanlar STZ enjeksiyonlar için normalde tabi yavaş yavaş kilo kaybı diyabet başlangıcı ile deneyim; Ancak, yarada deneyler şifa daha önce laboratuarlarımızda Dunn ve arktarafından sunulan modeli üreten tarafından yürütülen. (2012) 9 -C57BL/6J, şiddetli kilo kaybı kullanımı (şekil 1) gözlenmiştir. Buna ek olarak, ne zaman istimal bu yara istatistiksel olarak anlamlı bir alt kilo kaybı gözlenen SKH-1 fareler ile modeli (P &#60; 0.0001, Mann-Whitney U testi). Ayrıca, ölüm yok iken % 40 ölüm oranı önceki deneyler (Şekil 2) farelerde C57BL/6J bulaştırmak için gözlendi P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile enfekte diyabetik SKH-1 fareler kohort oluştu.
Burada sunulan modeline başka bir avantajı saç kaldırma adımı C57BL/6J fareler için zorunlu için deneysel bir işlem SKH-1 fareler için gereksiz olmasıdır. Her ne kadar bizim önceki deneylerde saçlı fareler ile özel dikkat cilt tahriş en aza indirmek için verildi, bazı hasar kaçınılmaz olarak (şekil 3) oluştu. Özellikle, ancak, tüysüz fareler bu modelde kullanan en büyük avantajı saç yeniden büyüme çalışmalar şifa uzun vadeli yarada gözlenen problemini ortadan kaldırılması olduğunu. Bizim deneyim C57BL/6J fareler ile saç yeniden büyüme hayvan hayvan çeşitli ama çalışmalar uzun vadeli doğası göz önüne alındığında, her zaman oluştu ve yara alan ölçümleri ile müdahale ya da çıkık yara Atel ve/veya karşılamak için kullanılan soslarda enfekte yaralar, potansiyel olarak yara (şekil 4) kurutma sonucu.
Diyabet onaylandıktan sonra SKH-1 yara iyileşme modelinde cerrahi kolayca hayvan sırtında yara dairesel bir tam kalınlıkta oluşturmak için çalıştırılabilir. Silikon ateli yerinde tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı tarafından tutulur ve tıkayıcı soyunma yeni oluşturulan yara Oda (şekil 5) üzerinden doğrudan temas önler.
P. aeruginosa Xen 41 kollarındaki biyofilmler polikarbonat membranlar (şekil 6) yetiştirilen kolayca ve aseptik'dır yaralar için hazırlanacak bir şırınga aktarılır ve inoculated fareler her gün için izlenir klinik belirtisi enfeksiyon (Şekil 7). Bu model için biz iki ayrı aşamada hayata. İlk aşamada biyofilm aşı sonra şeffaf bir tıkayıcı sos ile kaplı bir tahta yara çevriliydi. Bu yara tıkandı irin birikimi olur. Biyofilm içeren yaralar günlük görüntüleme sistemi enfeksiyon geliştirme izlemek ve biyofilm evrim (şekil 8 ve Şekil 9) değerlendirmek için in vivo ile görüntüsü. Toplam akı (p/s) kaydedilen bioluminescence, standart eğri (şekil 10) kullanarak bakteri yoğunluğu ile ilişkili olabilir.
Gün 8, tahta ve soyunma görselleştirme yara iyileşme sağlamak için çıkarıldı. Bioluminescence daha sonra yara çevreleyen irin kaybı nedeniyle düşer; Ancak, bakteri Histoloji tarafından belirlenen yara ile ilişkili kaldı. Bu yaklaşım yara iyileşmesi ölçmek için soyunma kaldırma çalışmaları (REFs) şifa diğer kronik yaralarda kullanıldığında vardır. İlerleme şifa yara bir mikroskop (Şekil 11) bağlı bir kamera ile Filmler alarak belirlenebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig1.jpg"> 
Şekil 1: karşılaştırmalı yüzde kilo kaybı SKH-1 ve C57BL/6J diyabetik farelerin. Gün sıfır ağırlık-e doğru son (5inci) gününde STZ enjeksiyon karşılık gelir. n = 10 fareler SKH-1 ve n için C57BL/6J için 12 fare =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig2.jpg"> 
Şekil 2: yüzde sağkalım oranları P. aeruginosa Xen 41 biyofilm uygulama (gün 1) sonra diyabetik farelerin SKH-1 ve C57BL/6J. n = 5 fareler SKH-1 ve n için C57BL/6J için 10 fare =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig3.jpg"> 
Şekil 3: Deri kesikler gelecekte sonra tıraş ve depilatory krem C57BL/6J fareler üzerinde kullanarak alan yaralı. (A): gün yordam; (B): 4 gün sonra yordamı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig4.jpg"> 
Şekil 4: (A) C57BL/6J fare ile kısmen kaldırıldı yara alçıya. (B) kaldırma ateli, tam olarak yeniden gelişmiş saç tarafından çevrili bir iyileşmiş yara saptandı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig5.jpg"> 
Şekil 5: SKH-1 fareler yaralama için cerrahi müdahale. (A)sınır biyopsi yumruk ile; (B) anahat sınır; (C) tamamlandı yaralama; (D) uygulama tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı; (E) yapıştırma ateli; (F) yara tıkayıcı sos ile kaplı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig6.jpg"> 
Şekil 6: biyofilm inoculum hazırlanması. Pseudomonas aeruginosa Xen polikarbonat membranlar üzerinde yetiştirilen 41 (A) 72 h koloni biyofilmler; Bir syrin kullanarak biyofilm ölçümü (B)Ge. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig7.jpg"> 
Şekil 7: SKH-1 diyabetik fare 6 gün sonra yara ile P. aeruginosa Xen 41 biyofilm aşılandı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig8.jpg"> 
Şekil 8: Diyabetik SKH-1 farelerde zamanla bioluminescence evrim izleyerek biyofilm enfeksiyon kontrolü. Biyofilm uygulamasının(a)gün; (B) 5 gün mesaj-biyofilm; (C) 8 gün sonrası-biyofilm; (D) 12 gün sonrası-biyofilm; (E) 16 gün sonrası-biyofilm; (F) 20 gün sonrası-biyofilm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig9.jpg"> 
Şekil 9: Toplam akı yaraları SKH-1 diyabetik farelerde deney süresince P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile enfekte. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig10.jpg"> 
Şekil 10: CFU bioluminescence CFU başına standart bir eğri üretilen P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile yara kullanarak başına tahmini. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55991/55991fig11.jpg"> 
Şekil 11: test zaman çizelgesi yaraların enfekte P. aeruginosa Xen ile diyabetik SKH-1 Mouse şifa ilerleme gösterilen 41 biyofilmler. Biyofilm enfeksiyon sonra gün her resmin sol alt köşesinde gösterilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55991/55991fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model at JoVE.com

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

come-to-light-side-vivo-monitoring-pseudomonas-aeruginosa-biofilm

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

13.1K Görüntüleme.  Michigan State University. Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Video: Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Yara Şifa murin Modeli

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Tıp

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ~6.5M people and cost ~$40B/year in the US alone. Although a significant effort has been invested in understanding how chronic wounds develop in humans, fundamental questions remain unanswered. Recently, we developed a novel mouse model for diabetic chronic wounds that have many characteristics of human chronic wounds. Using db/db-/- mice, we can generate chronic wounds by inducing high levels of oxidative stress (OS) in the wound tissue immediately after wounding, using a one-time treatment with inhibitors specific to the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. These wounds have high levels of OS, develop biofilm naturally, become fully chronic within 20 days after treatment and can remain open more for more than 60 days. This novel model has many features of diabetic chronic wounds in humans and therefore can contribute significantly to advancing fundamental understanding of how wounds become chronic. This is a major breakthrough because chronic wounds in humans cause significant pain and distress to patients and result in amputation if unresolved. Moreover, these wounds are very expensive and time-consuming to treat, and lead to significant loss of personal income to patients. Advancements in this field of study through the use of our chronic wound model can significantly improve health care for millions who suffer under this debilitating condition. In this protocol, we describe in great detail the procedure to cause acute wounds to become chronic, which has not been done before.

Chronic wounds are developed from acute wounds on a diabetic mouse model by inducing high levels of oxidative stress after a full-thickness cutaneous wound. The wound is treated with inhibitors for catalase and glutathione peroxidase, resulting in impaired healing and biofilm development by bacteria present in the skin microbiome.

Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring otitis media, and many more. Microbial cells within these infections are protected by an extracellular polymeric substance (EPS), which can prevent antibiotics and host immune cells from clearing the infection. To overcome this obstacle, investigators have begun developing dispersal agents as potential therapeutics. These agents target various components within the biofilm EPS, weakening the structure, and initiating dispersal of the bacteria, which can theoretically improve antibiotic potency and immune clearance. To determine the efficacy of dispersal agents for wound infections, we have developed protocols that measure biofilm dispersal both ex vivo and in vivo. We use a mouse surgical excision model that has been well-described to create biofilm-associated chronic wound infections. To monitor dispersal in vivo, we infect the wounds with bacterial strains that express luciferase. Once mature infections have established, we irrigate the wounds with a solution containing enzymes that degrade components of the biofilm EPS. We then monitor the location and intensity of the luminescent signal in the wound and filtering organs to provide information about the level of dispersal achieved. For ex vivo analysis of biofilm dispersal, infected wound tissue is submerged in biofilm-degrading enzyme solution, after which the bacterial load remaining in the tissue, versus the bacterial load in solution, is assessed. Both protocols have strengths and weaknesses and can be optimized to help accurately determine the efficacy of dispersal treatments.

Here, we describe ex vivo and in vivo methods for assessing bacterial dispersal from a wound infection in mice. This protocol can be utilized to test the efficacy of topical antimicrobial and anti-biofilm therapies, or to assess the dispersal capacity of different bacterial strains or species.

Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Biyofilm ile Enfekte Yanık Yarası Çalışmaları için Uzun Vadeli Bir Domuz Modeli Geliştirme

Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the involvement of the host immune system. Iterative changes in the host and pathogen during the formation of such clinically relevant biofilm can only occur in vivo. The swine wound model is recognized for its advantages as a powerful pre-clinical model. There are several reported approaches for studying wound biofilms. In vitro and ex vivo systems are deficient in terms of the host immune response. Short-term in vivo studies involve acute responses and, thus, do not allow for biofilm maturation, as is known to occur clinically. The first long-term swine wound biofilm study was reported in 2014. The study recognized that biofilm-infected wounds may close as determined by planimetry, but the skin barrier function of the affected site may fail to be restored. Later, this observation was validated clinically. The concept of functional wound closure was thus born. Wounds closed but deficient in skin barrier function may be viewed as invisible wounds. In this work, we seek to report the methodological details necessary to reproduce the long-term swine model of biofilm-infected severe burn injury, which is clinically relevant and has translational value. This protocol provides detailed guidance on establishing an 8 week wound biofilm infection using P. aeruginosa (PA01). Eight full-thickness burn wounds were created symmetrically on the dorsum of domestic white pigs, which were inoculated with (PA01) at day 3 post-burn; subsequently, noninvasive assessments of the wound healing were conducted at different time points using laser speckle imaging (LSI), high-resolution ultrasound (HUSD), and transepidermal water loss (TEWL). The inoculated burn wounds were covered with a four-layer dressing. Biofilms, as established and confirmed structurally by SEM at day 7 post-inoculation, compromised the functional wound closure. Such an adverse outcome is subject to reversal in response to appropriate interventions.

Yazar Spotlight: Yara Biyofilm Oluşumunda Konak-Mikrop Etkileşimlerinin İncelenmesi 

Chronic wounds that are resistant to antibiotics are a major threat to the healthcare system. Biofilm infections are stubborn and hostile and can cause deficient functional wound closure. We report a clinically relevant swine model of biofilm-infected full-thickness chronic wounds. This model is powerful for mechanistic studies as well as for testing interventions.

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the ...

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Yara Şifa murin Modeli

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü

Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli