The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

<ol><li>Casadevall, A., Pirofski, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li>
<li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li>
<li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+research+%3A+J.+Lab.+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li>
<li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Candida+interactions%3A+an+ecological+role+for+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li>
<li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans%3A+do+they+really+need+to+stick+together%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+intestinal+immunity%3A+same+ballpark%2C+different+players%3B+different+rules%2C+same+score%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li>
<li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+repertoire%2C+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Micro.%22%5BJournal%5D)">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li>
<li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-Induced+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
<li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li>
<li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li>
<li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+care%22%5BJournal%5D)">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li>
<li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li>
<li>Faure, E., Mear, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

מודלים של בעלי חיים, במיוחד יונקים, שימושיים להבהיר מנגנונים מורכבים של אינטראקציה מארח הפתוגן בתחומי חסינות. כמובן, את הצורך במידע זמין רק ממודלים של בעלי החיים חייבים להיות חיוני; אחרת, שימוש בבעלי החיים חייב להיות מוחלף על ידי מודלים במבחנה. מודל חיה זה ממחיש את תובנה שיכולה להינתן רק על ידי מודל חיה מאז האינטראקציה בין פתוגנים מתווכת על ידי תגובת מארח מרובה רכיבים. עכברים המשמשים כיום ללמוד אינטראקציה מארח הפתוגן זה הם צעירים בגילים 6 עד 10 שבועות עם תגובה חיסונית בוגרת וללא שינוי. כאשר מתמקדים בתגובה החיסונית המולדת, עכברי רקע C57BL6 / J עדיפים. כדי למנוע השפעה של מין ומחזור הורמונלי (בעיקר אסטרוגן) בתגובה החיסונית, זכרים ולכן הבחירה הטובה ביותר. כדי להשיג מובהקות סטטיסטיות, חייבת להיות לפחות 5 קבוצות אנשים בסופו של הניסוי, אך כפי שהוצעו על ידי כל בעלי החיים experimenהנחיות tation, מספר בעלי החיים המשמשים צריכה להיות מופחתת ומעודן למינימום קפדן. תחבורה ממגדל מתן החיות למתקן המחקר גורמת לחץ בעכברים. התוצאה היא הפרשה מוגברת של ציטוקינים דלקתיים שיכול לשנות ניסויים הבאים כמו שלנו. יתר על כן, סביבה חדשה ו&quot; חבריהם לכלוב &quot;חדשים תורמים ללחץ. כתוצאה מכך, עכברים יש התאקלמו לפחות שבעה ימים לפני ללמוד בסביבת המגורים החדשה שלהם. סביבת דיור זה חייבת להיות מבוקר, אספקת מזון סטנדרטי ומודעות-lib מים, מחזור היום / לילה, ולחות יציבה מתאימה וטמפרטורה. שני קולוניזציה ריאות ודלקת ריאות מודלים דורשים תרגול ומיומנות. החדרה יכולה להתבצע תוך מאנפפת או תוך-tracheally. האחרון הוא קשה יותר ודורש מומחיות רבה יותר באמצעות אימון בשל סיכון גבוה לדום לב anoxic. ואכן, יחסי הציבורocedure דורש לצנתר בהצלחה עכבר בפחות מ -15 שניות והרדמה עמוקה יותר ולכן נדרשה. הבחירה של החדרה תוך-האף שלנו היא קלה יותר לביצוע, משום שהתוואי של ממשל הוא נגיש, הרדמה קלה הדורשת פחות מסוכנת ולכן יותר לשחזור. Boutoille et al כבר תאר המודל שלנו חריף פציעת ריאות, במיוחד ההערכה של פגיעת ריאות באמצעות מדידת חדירות מחסום מכתשי-נימים באמצעות אלבומין FITC שכותרתו 16. כדי לצמצם את מספרם של עכברים בכל ניסוי, שיטה זו הותאמה ויחד עם שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). במחקרים של אל Boutoille et, השתמשנו בהשוואה בין הקרינה של אלבומין FITC שכותרתו בsupernatants homogenate הריאות והדם supernatants 17. כדי לבצע השוואה זו באופן מלא, רמות המוגלובין ורמות ההמטוקריט נדרשים גם. שיטה זו הותאמה להלw הניתוח במקביל לתגובת מארח ידי הקדשת ריאה אחת להומוגניזציה והערכה של פגיעת ריאות ואחרת לשטיפה ומחקר של תגובת מארח. ואכן, נוזל BAL יכול לשמש כדי להעריך רמות ציטוקינים, הפרשת חלבון וגיוס תא. ההסתגלות שלנו מספקת יותר תוצאות מניסוי בבעלי חיים יחיד, הפחתת העלות ואת המספר הדרוש של עכברים, במיוחד בעת שימוש בעכברי נוק-אאוט 17 כפי שהומלץ בהנחיות ניסויים בבעלי חיים. יתר על כן, חלק מהריאה נשמר ב -80 ° C כדי לבצע חילוץ כולל RNA ותגובת שרשרת של פולימראז כמותיים או ניתוח היסטולוגית. השוואה בין השיטה הקודמת והשיטה החדשה המותאמת בשילוב עם BAL מראה תוצאות דומות (איור 3 א) להעריך מדד פציעת ריאות. במחקר של Mear et al, באמצעות אותם ההליכים, cytometer זרימת הניתוח בוצעה על תאי BAL מתקבלים על ידי צנטריפוגה של נוזל BAL. דומהnalyses בוצעו על תאי ריאה כולל מהריאות 12. במקרה זה, להערכת פציעת ריאות עם אלבומין FITC שכותרתו לא ניתן לבצע במקביל, בשל חפצים הנגרמים על ידי FITC (אותו ערוץ מאשר חלבון הקרינה ירוק). לכן, אם נדרש cytometry זרימה, ניסויים חייבים להיות מתוכננים בהתאם. העיתוי של המתת חסד הוא קריטי. במהלך מודל דלקת ריאות החריף על 72 שעות בפעם הראשונות מוצג איור 3. במודל זה, את פסגת פציעת ריאות ותגובת מארח מתרחשת בין 24 ו -36 שעות (איור 3). כך, בעיצוב שלנו נקודת סיום 24 שעות נבחרה כקריאת נתונים ל3 סיבות: ראשית, זה קל לארגן במעבדה, שני, כדי למנוע אובדן של עכברים עקב תמותה בין 24 ו -36 שעות, ולבסוף, בגלל תגובת מארח הייתה מקסימלי בנקודה זו בזמן. הצעד הראשון של מחקר האינטראקציה שלנו הוא ההתיישבות של דרכי הנשימה עם &lt;em&gt; C. אלביקנס. באמצעות החדרה של 10 5 CFU לכל עכבר, מודל התמדה 4 ימים מתקבל ללא כל פגיעת ריאות. למעשה, עכברים עלו במשקל במהלך שלב זה הזמן. עלייה במשקל הוא אינדיקטור שימושי של היעדר פגיעה בקו אחד עם התישבות בניגוד לזיהום. ואכן, עומס מוגבר ראשוני (מעל 10 6 CFU לכל עכבר) פציעת ריאות מושרה (איור 2 ג) ומארח תגובה מזיקה הרבה מעבר תחול, ובמקרה עכברים ירדו במשקל (איור 2 ד). להיפך, באמצעות קטנה טעינה ראשונית (למשל 10 4 CFU לכל עכבר) לא ניתן היה לקבל מודל התמדה בדרכי נשימה. לכן, כדי להשיג תחול הנצפה של חסינות מארח שתוארה על ידי Mear et al 12, הכיול של הנטל פטרייתי החדיר הוא קריטי להצלחה ולמעקב אחר עקומת המשקל הוא שליטה מרכזית. אותו הדיוק נדרש לפ aeruginosa </em&gt; כדי לגרום לזיהום חריף. הבידוד מספיק לא לגרום פגיעת ריאות ופ aeruginosa מנוקה במהירות מדרך הנשימה על ידי מארח-מענה הולם. באמצעות פ הראשוני גבוה מדי aeruginosa עולה יכולות הגנת מארח או אפילו גורם תגובה הולמת וderleterious וכתוצאה מכך העומס מוביל לפגיעה מסיבית חריפה ומוות מוחק את כל ההבדלים בין קבוצות. הבידוד האופטימלי כדי לגרום לפגיעה חריפה תלוי בנוכחות של מערכת פונקציונלית מסוג 3 הפרשה (T3SS) והייצור של exotoxin U, רעלן translocated ידי T3SS לתוך הציטופלסמה התא המארח. שתי תכונות זן ספציפי אלה צריכים להיחשב בבחירת נטל החיידקים הראשוני. נטל חיידקים ראשוני הציע במאמר זה כדוגמאות לגבול עליון ותחתון כדי לגרום לפציעת ריאות חריפה עם T3SS-שלילי או חיובי מתח, וזני ייצור U exotoxin או לא (טבלה 1). כאשר לומדיםמעורבות של T3SS, מתח צריכה להיות גדל O / N וקם לתחייה עם מדיום LB החדש 3 שעות לפני הכנת הבידוד להשיג פעילות אופטימלית של T3SS. קביעת נטל חיידקים ופטריות 24 שעות לאחר פ דלקת ריאות -induced aeruginosa דורשת שיקולים ספציפיים שנדונו בסעיף זה. ואכן, כפי שמוצג, כאשר העכברים נגועים בזן 5 x 10 6 CFU T3SS-חיובי, נטל חיידקים בריאות ב 24 שעות רצון ירד לכ 1 יומן (איור 3 ג). דילולים סידוריים של דגימות חייבים להתבצע עד דילול 5-יומן ומצופים על צלחות BCP-אגר. בנוגע לג אלביקנס בריאות, בשעה 72, פטריית הנטל הוא ירד לכ -2 יומן ודגימות חייבים להיות מצופים בYPD-אגר בתוספת אמיקצין כדי להקל על זיהוי מושבה. לבסוף, נחישות של הפצת חיידקים ניתן להעריך על ידי ציפוי של דגימת דם על BCP-אגר 100 μl או על ידי ציפוי של h טחול 100 μlomogenates באותו המדיום. שתי השיטות היו כבר בהשוואה ונראה תרבות טחול להיות מדויקים יותר. ואכן, הטחול הוא איבר ש&quot; מסננים &quot;כל הדם ועלול&quot; להתרכז &quot;ולחסוך בחיידקים שהופצו על הדם. לפיכך, homogenates הטחול משקפת את הפצת חיידקים המערכתית בדלקת ריאות חריפה עם רגישות גבוהה יותר מדם. דגימות דם מייצגות הפצת חיידקים בזמן נתון מאוד ספציפי וייתכן שלא באמת משקפות את התופעה של הפצת חיידקים כולה. לכן תרבויות homogenate טחול עדיפות. מדד פציעת ריאות הוא הערכה רגישה של פגיעת ריאות כתוצאה מזיהום ו / או תגובת מארח בלתי הולמת ואת ההשפעה של תרופות פוטנציאליות על רכיבים אלה. בנוסף, ביו מודל o זה מאפשר האיסוף של כמה מדגמים שונים כדי ללמוד תגובת מארח. ריאות יכולות לשמש להפקת RNA וניתוחשל שעתוק הגנים. יכולות גם להיות ממוקמות דגימות ריאה לparaformaldehyde (PFA) לתצפיות היסטולוגית נוספות. נוזל BAL יכול לשמש להערכת הפרשת חלבון כגון ציטוקינים דלקתיים. לבסוף, כפי שפורט לעיל בפרוטוקול יכול להיות מותאם כדי לספק דגימות לניתוח cytometry זרימה. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לmodelize ג האינטראקציה חיידקים albicans- מעורבת בדלקת הריאות הקשורים למכונת הנשמה כמו Staphylococcus aureus 18 או Enterobacteriae. הסתגלות נוספת יכולה להיות קולוניזציה של דרכי הנשימה באמצעות חיידקים במקום ג אלביקנס לmodelize אינטראקציה חיידקים במחלת ריאות מוגלתית כרונית כגון bronchiectasis. לשם כך, יש כדי לשמש עכברי מדוכאי חיסון, כי אישור חיידקים בעכברים המוסמכים חיסוניים אינו מאפשר התישבות בדרכי נשימה מתמשכת. להחדרה, העמדה של היד האוחזת בעלי החיים היא CRItical. כפי שכבר הדגיש בסעיף הקודם, כאשר תוך הקניית מאנפפת העכבר, המפעיל חייב להבטיח את הפה, כי הוא מושלם נסגר כדי למנוע יריקה של הפתרון. האגודל תומך לסת ושומר על הפה הסגור במהלך הליך החדרה השלם (איור 4). ואז, ביד השנייה, פיפטה מופקדת על נחיר (איור 4C) ופתרון בהדרגה ובעדינות החדיר בלי אוויר כדי למנוע היווצרות בועה. ברור, החדרה חייבת להתבצע בקבינט 2-רמת בטיחות ביולוגית. איסוף דגימות דורש הכשרה כירורגית קטנה-חיה certifed של המפעיל. בכל שלב, דגימות חייבות להיות ממוקמות על קרח, כדי למנוע תמוגה תא ולשמר חלבונים מdenaturation. מכשירי ניתוח בסיסיים נדרשים (איור 4 א). הם חייבים להיות מעוקרים על ידי מעוקר לפני השימוש. מומלץ ערכות כלי ניתוח שונות לשמש לabdominal וצעדים כירורגית חזה, הימנעות זיהום צולב של דגימות ריאה. השלבים הקריטיים השונים של נתיחה כירורגית מוצגים (5A-5E איור). מיקום של העכבר הוא קריטי; בעלי החיים צריכים להיות משותקים שטוחים על זה בחזרה מול ראש מהמפעיל וישר. אתנול יש להשתמש בנדיבות על הכנה לפני החתך הראשון, כדי למנוע את ההתפשטות של שיער בדגימות וזיהום חיידקים פוטנציאלי מהעור. העור הוא גם כלי דם וחייב להיות חזר בזהירות כדי למנוע (איור 5 א) דימום. אז בית החזה הוא שכב הבא חתך לרוחב חזה שבמהלכו בית החזה יש לשמור כל הזמן באחיזת פינצטה כדי למנוע פגיעה בלב והריאות בחתך. ריאות ולב חשופים (איור 5). ריאה נגוע מופיעה (איור 5) לבנבן. נתיחה של אזור צוואר הרחם חושפת את קנה הנשימה ותפר הוא מכוניתefully ממוקם מאחורי קנה הנשימה העליונה (איור 5 ג). Cannulating קנה הנשימה חייבת להתבצע בזהירות. אין להשתמש בצינורית גדולה (גודל מרבי הוא 20 G). חתך קדמי קטן של קנה הנשימה קְרוּמִי בין שתי טבעות סחוס מאפשר החדרה של הצינורית. כאשר הצינורית הוא נצפה על ידי שקיפות דרך קנה הנשימה מעל קארינה (איור 5D), התפר קשור בחוזקה סביב קנה הנשימה המאבטחת אותו סביב הצינורית (איור 5E). הצינורית מחוברת לשסתום Luer נעילת זכר 3-בדרך עם 2 מזרקים מחוברים לנקבה היציאות. מזרק אחד מכיל קר כקרח PBS לשטיפה ברונכואלוואולרית; האחרים ריק לצייר אחורי נוזל BAL. יש chaged מזרקים אלה בין קבוצות. לסיכום, תחול לפני מודל פציעת ריאות חריף הוא מודל רלוונטי ורב עוצמה כדי לחקור באינטראקציות בתיווך מארח vivo בין פתוגנים. השימוש בבעלי החיים הואמגבלה העיקרית ויש לשקול בזהירות נגד המידע הזמין במבחנה.

<html> מודלים של בעלי חיים, בעיקר עכברים, נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את תגובה חיסונית נגד פתוגנים. למרות חסינות מולדת ונרכשת שונה בין מכרסמים ובני האדם 7, הקלות בגידול והפיתוח של knockouts לגנים רבים, להפוך עכברי מודל מצוין ללמוד תגובות חיסוני 8. התגובה החיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של הפתוגן, (תאי האפיתל, תאי האנדותל) צמחיית תושב חיידקים וכמה (לימפוציטים, נויטרופילים, מקרופאגים) חיסוניים ואינם חסינים סוגים סלולריים 2. במבחנה אינה מאפשרות התבוננות אינטראקציות המורכבות אלה ומתמקדים בעיקר באינטראקציות התא-פתוגן ייחודיים. בעוד מודלים של בעלי חיים יש להשתמש בזהירות ובמוגבלת לשאלות מאוד ספציפיות ורלוונטיות, מודלים עכבר מספקים תובנה טובה לתגובה החיסונית יונק in vivo ויכולים להתייחס לחלקים של שאלות קליניות חשובות 7. &quot;Jove_content&quot;&gt; בדרכי הנשימה, קהילת החיידקים היא מורכבת שיוך מספר גדול של מיקרואורגניזמים שונים 6. בעוד מה שמהווה Microbiome &quot;נורמלי&quot; בדרכי נשימה עדיין לא נקבע, קהילות תושב לעתים קרובות polymicrobial, ומקורן ממקורות אקולוגיים מגוונים. חולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית (סיסטיק פיברוזיס, bronchectasis) או חולי מאוורר מכאני התערוכה צמחייה מסוימת בשל התישבות של דרכי הנשימה על ידי מיקרואורגניזמים לסביבה שנרכשו-9. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 5, לעתים קרובות מבודדת יחד מדגימות tracheobronchial , ואחראי לזיהום אופורטוניסטי חמור בחולים אלה, במיוחד ביחידה לטיפול הנמרצת (ICU) 4. בידוד של מיקרואורגניזמים אלה בדלקת ריאות חריפות בתוצאות טיפול נמרץ בטיפול אנטי-מיקרוביאלי נגד פ aeruginosa בשמרי ut בדרך כלל לא נחשבים פתוגניים באתר זה 5. במבחנה אינטראקציות בין פ aeruginosa וג אלביקנס כבר דווח בהרחבה, והראה כי מיקרואורגניזמים אלה יכולים להשפיע על הצמיחה וההישרדות של אחד את השני, אבל מחקרים לא הצליחו להסיק אם נוכחותם של ג אלביקנס הוא מזיק או מועיל למארח 10. מודלים העכבר פותחו כדי לטפל בזה רלוונטי של פ aeruginosa וג אלביקנס in vivo, אבל האינטראקציה בין מיקרואורגניזמים לא הייתה נקודת המפתח. ואכן, המודל הוקם כדי להעריך את מעורבותו של ג אלביקנס בתגובה מארח חיסוני, ותוצאה. דגם קודם שנקבע על ידי רו et al כבר השתמש התישבות ראשונית עם ג אלביקנס אחרי דלקת ריאות חריפה הנגרמת על ידי פ &#39; aeruginosa. שימוש במודל שלהם, החוקרים מצאו תפקיד מזיק של prior ג אלביקנס קולוניזציה 11. עם זאת רו et al משמש עומס גבוה של ג אלביקנס במודל שלהם עם 2 x 10 6 CFU / עכבר במהלך 3 ימים רצופים. הקמנו מודל 4 ימים של ג קולוניזציה בדרכי הנשימה אלביקנס, או בהתמדה לפחות ללא פגיעת ריאות, במודל זה ג אלביקנס אוחזר עד 4 ימים לאחר החדרה יחידה של 10 5 CFU לכל עכבר (איור 2) 12,13. לאחר 4 ימים, אין עדות לגיוס דלקתי תא, ייצור ציטוקינים דלקתי ולא נזק אפיתל נצפתה. ב24 - 48 שעות, בנוכחות השיא של ג אלביקנס, למרות שתגובה חיסונית מולדת סלולרית וציטוקינים נצפתה, לא היה עדות לפגיעת ריאות. באופן מפתיע, עכברים וכך יישבו עם ג אלביקנס 48 שעות לפני intranasal החדרה של פ aeruginosa שנחלש זיהום בהשוואה לעכברים עם פ זיהום aeruginosa לבד. אניndeed, עכברים הציגו פציעת ריאות פחותה וירידה בניטל חיידקי 12,13. כמה השערות יכולות להסביר השפעה חיובית זו של התישבות מוקדמת עם ג אלביקנס על פ aeruginosa בתיווך דלקת ריאות חריפה. ראשון, שיחה בין-interspecies מעורב כל מיקרואורגניזמים מערכות חישת מניין, פ מבוסס homoserinelactone מערכת aeruginosa וג מבוסס פרנסול מערכת אלביקנס, הוערכה. שנית, ג אלביקנס פועל כמטרה &quot;דמה&quot; לפ aeruginosa הסטת הפתוגן מתאי האפיתל ריאות נחקר. שני ההשערות ביטלו (נתונים שלא פורסמו). ההשערה השלישית הייתה של &quot;תחול&quot; של מערכת החיסון המולדת על ידי ג אלביקנס האחראי לתגובה מולדת הבאה משופרת נגד פ aeruginosa. ההשערה האחרונה זו אושרה. אכן ג קולוניזציה אלביקנס הובילה ליחול חסינות מולדת throuGH IL-22, בעיקר מופרש על ידי תאי הלימפה מולדים, וכתוצאה מכך אישור חיידקים גדל ומופחת פגיעת ריאות 12. לסיכום, המארח הוא שחקן מרכזי ביחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים ויסות התגובה חיסונית המולדת ומעורבים סוגי תאים דלקתיים שונים. בעוד שניתן גזור אינטראקציות חיסוני המורכבות אלה במבחנה ניתן לספק השערות הראשוניות רק על ידי מתאים בדגמי vivo. הפרוטוקול הבא מספק דוגמא למחקר vivo של אינטראקציה הפתוגן בתיווך מארח שעשוי להיות מותאם למייקרו-אורגניזמים אחרים.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader Mithras&amp;nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>reference in first column</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Bromo-cresol purple agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>20x per unit</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>2-headed valve&amp;nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Sterile inoculation loop 10 &amp;micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 conditioning</td></tr><tr><td>Insuline syringes 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>per 100 conditioning</td></tr><tr><td>2 positions Culture tube 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&amp;nbsp;</td><td>General Electric life sciences</td><td>80-2116-30</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Hemolysis tubes 13 x 75 mm&amp;nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>packaged in 500 ml</td></tr><tr><td>amikacin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>per 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin 10,000 UI in 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x per unit</td></tr><tr><td>RAL 555 coloration kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons of 100 mL</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparent 300 &amp;micro;l 96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in powder</td></tr><tr><td>FITC-albumin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in powder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in powder</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Terumo or unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditioning</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>no comment</td></tr></tbody></table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

לימוד אינטראקציה מארח הפתוגן מאפשר לנו להבין את המנגנון הבסיסי של פתוגניות במהלך זיהום חיידקים. הפרוגנוזה של המארח תלוי במעורבות של תגובה חיסונית מותאמת נגד הפתוגן 1. תגובה חיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של פתוגנים וכמה סוגים חיסוניים תאיים או אי-חיסון 2. מחקרים במבחנה לא יכולים לאפיין אינטראקציות אלה ולהתמקד באינטראקציות תא-הפתוגן. יתר על כן, בדרך הנשימה 3, במיוחד בחולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית או בחולי מאוורר מכאני, קהילות polymicrobial נמצאים ולסבך אינטראקציה מארח הפתוגן. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 4, לעתים קרובות מבודדת מדגימות tracheobronchial, ו קשורים לזיהומים חמורים, במיוחד ביחידה לטיפול נמרץ 5. יש אינטראקציות חיידקיםדווח בין פתוגנים אלה במבחנה, אך ההשפעה הקלינית של אינטראקציות אלה נותרה 6 לא ברורים. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין C. אלביקנס ופ aeruginosa, מודל עכברי של ג קולוניזציה אלביקנס דרכי הנשימה, ואחריו פ דלקת ריאות חריפה בתיווך aeruginosa- בוצעה.

כפי שניתן לראות בעבר בתיאור הפרוטוקול, הניסוי צריך 5 ימים כדי להשלים (איור 1: ציר זמן ניסוי). מפעיל אחד שידל במשך כל הריצה של הניסוי ויכול להתמודד עם התהליכים עד למקסימום של 10 עכברים. אם יותר בעלי חיים נדרשים, שני אנשים נדרשים במיוחד עבור אוסף מדגם כירורגית. ואכן כל הדגימות יש לאסוף בתחת 2 שעות, כדי למנוע דליפת מכתשי-נימים פסיביות מוגברת של אלבומין FITC שכותרתו בעכברים שעבר. הצעד הראשון הוא הכנת ג הבידוד אלביקנס והחדרה תוך-האף להשיג קולוניזציה דרכי הנשימה על ידי ג אלביקנס. מודל 4 ימים-התמדה מתקבל על ידי החדרת intranasal של 5 x 10 5 CFU של ג אלביקנס לכל עכבר (איור 2). במהלך 4 ימים אלה, עכברים במשקל (איור 2 א) והחדרה של 5x10 5 CFU לא לגרום lפציעת ung (איור 2 ג). למרות ג אלביקנס יכול להימשך עד 4 ימים במודל זה, עומס יורד לאחר 48 שעות. לכן, פ דלקת הריאות החריפה -induced aeruginosa היא מעודה ב 48 שעות של ג התמדת אלביקנס. PAO1 מתח פ aeruginosa הוא זן מעבדה במידה רבה אפיין מרכיב את גורם אלימות הגדול, המערכת של שלוש הפרשת הסוג (T3SS), כב -75% מריאות קליניות מבודדים 15. מסיבות תזות, PAO1 הוא זן רלוונטי במודלים של בעלי חיים של דלקת ריאות חריפה. פציעת ריאות מוערכת באמצעות alveolo קַפִּילָאר-חדירות שנמדדו על ידי דליפת חלבון מהתא של כלי הדם לתוך דרכי הנשימה מתבטאת במדד פציעת ריאות. עליות ריאות פציעה עם הבידוד (איור 3 א). כאן אנו מדווחים קינטיקה של רכיב פגיעת ריאות החריף של המודל שלנו נגרם על ידי מתח PAO1 (5x10 6 CFU / עכבר) (איור 3 ב-3F) לבד בלי לפניג albicans- תחול בתיווך. בהתאם כמובן מתח והשעה של המודל, הבחירה של פ הראשוני הבידוד aeruginosa נדון בסעיף הבא, והוא הציע בטבלה 1. חמישה עכברים לכל קבוצה היו בשימוש. מדד ריאות פציעה (איור 3), נטל חיידקים בריאה (איור 3 ג), נטל חיידקים בטחול, המשקף הפצת חיידקים (איור 3D), cellularity BAL (איור 3E) וספירת תאי ההפרש (איור 3F) נקבעו כל 12 שעות. פציעת ריאות הייתה מקסימלי בין 24 שעות ו -36 שעות לאחר ההדבקה (איור 3). נטל חיידקים הראה 1-log CFU / ml להקטין כל שעה 24 (איור 3 ג). הפצת חיידקים מצטבר הוערכה על ידי תרבויות homogenate טחול גדלה בכל יום (איור 3D). לבסוף, בעוד cellularity BAL בעכברים נגוע מורכב בעיקר (90%) oמקרופאגים ו מכתשי, בBAL מעכברים נגועים, נויטרופילים גויסו באופן נרחב וספירת תאי ההפרש הראו 90% נויטרופילים ומקרופאגים 10% וימפוציטים (איור 3E, 3F). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig1.jpg" /> ציר זמן של איור 1. חריף ריאות הפגיעה הדגם לחקור אינטראקציה בתיווך בין מארח ג אלביקנס ופ aeruginosa. ייצוג גרפי של ההליך כולו. הצעד הראשון הוא הסתגלות סביבתית של עכברי מתקן הדיור. הצעד השני הוא ג אלביקנס תיווך קולוניזציה בדרכי הנשימה. לבסוף, בשלב השלישי הוא דלקת הריאות החריפה בתיווכו של פ aeruginosa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig2.jpg" /> איור 2. ג אלביקנס דרכי הנשימה התיישבות. (A, B) עכברים החדירו intranasally עם 10 5 CFU ג אלביקנס (SC5314 מתח). עכברים במשקל במהלך ג קולוניזציה תיווך אלביקנס בדרכי הנשימה (). קולוניזציה של דרכי הנשימה יכולה להיות ממושכת ל3-4 ימים עם רק אחד החדרה ראשונית. במחקר קודם, תחול חסינות מולדת מתרחש בין 24 ו -48 שעות. (N = 5 לכל קבוצה), ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. 5 עכברים (C, D) הם החדירו intranasally x 10 5 או 5 x 10 6 CFU של ג אלביקנס. מדד ריאות פציעה (ג) הוערך על ידי חדירות מחסום נימי מכתשי ב 24 שעות. עלייה במשקל (ד &#39;) הביע כאחוז ממשקל ההתחלתי (n = 5 לכל קבוצה).ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig3.jpg" /> איור 3. דגם של ריאות חריפות פגיעה הנגרם על ידי aeruginosa P. () C57Bl / 6J עכברים תוך מאנפף נגועים עם המון גובר של פ aeruginosa (מ -1 x 10 x 6 5 10 7 CFU לכל עכבר) (n = 5 לכל קבוצה), ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. עכברים מורדמים בשעה 24. מדד פציעת ריאות מוערך על ידי חדירות מחסום מכתשי-נימים שמגדילות באופן יחסי עם נטל חיידקים. השוואה של מדד פציעת ריאות שהושגה באמצעות שיטה ישנה עם supernatants ריאות homogenates (פסים שחורים) ושילוב-שיטה חדשה באמצעות supernatants שטיפה ברונכואלוואולרית (בר אפורעכברי ים) (BF) נגועים תוך מאנפף עם 5 x10 6 CFU לכל עכבר. עכברים מורדמים כל 12 עד 48 שעות לקינטיקה מודל פציעה האקוטית. פציעת ריאות (ב &#39;), נטל ריאות חיידקית (C), נטל טחול חיידקים (ד&#39;), cellularity שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) (E) וספירת תאי ההפרש BAL (F) גם העריכו. (N = 5) לכל קבוצה, ברים שגיאה מייצגים אמצעי ± SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig4.jpg" /> איור 4. ציוד כירורגי וintranasal החדרה. () &#160; ציוד כירורגי נדרש לבצע מודל פציעה אקוטי ושטיפה ברונכואלוואולרית. הנה צינורית לקנה נשימה (20המזרקים G) ושני 1 מיליליטר מחוברים לשסתום 3-דרך Luer נעילה. מזרק אחד להזריק מים לריאות, אחד לצייר את נוזל רונכואלוואולרית בחזרה החוצה מהריאות. (B, C) &#160; מיקום של העכבר ביד כדי לבצע את החדרה תוך-האף. בתמונה זו, האגודל מתחת ללסת מבטיח פה סגור במהלך החדרה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig5.jpg" /> איור 5. ניתוח ושטיפת סימפונות מכתשי. החזה נפתח באופן נרחב (), וכלוב צלעות נפתח רוחבי, כדי למנוע פגיעה בלב (B). בעקבות איסוף דם, אזור צוואר הרחם הוא גזור לחשוף את קנה הנשימה (C). חוט דנטלי משמש כתפר ועובר מאחורי קנה הנשימה (C, D). קנה הנשימה אז cannulated עם צינורית G-20 בשילוב (ד) רכובה על המזרק ושסתום 3-דרך. קנה הנשימה צריכה להיות מאובטחת בחוזקה סביב הצינורית על ידי קשירת קשר כירורגית באמצעות התפר במקום מאחורי קנה הנשימה. לבסוף 500 μl של PBS הם החדירו בעדינות את הריאות ולאחר מכן BAL נמשך החוצה בעדינות. ריאות-החדיר נוזלים (E). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> נטל החדיר מינימאלי </td><td> נטל מקסימאלי החדיר </td></tr><tr><td> T3SS- </td><td> 5 x 10 7 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> T3SS + </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 1 x 10 7 </td></tr><tr><td> + + T3SS exoU </td><td> 5 x 10 <sup&gt; 4 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. פ aeruginosa inocula משמש במודלי זיהום חריפים ריאות. ריכוזי intranasal אופטימליים הציעו של inocula לגרום לפציעת ריאות חריפה לפי זנים.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.8K Views.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Video: Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

הקמת מודל עכברי לזיהום הקשור לצנתר קנדידה אלביקנס

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed on the outer surface of the catheter and lead to disseminated infections, which are fatal to patients. There are no effective prevention and treatment management in clinics. Therefore, it is urgent to establish an animal model of CRI for the preclinical screening of new strategies for its prevention and treatment. In this study, a polyethylene catheter, a widely used medical catheter, was inserted into the back of the BALB/c mice after hair removal. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressing enhanced green fluorescent protein was subsequently inoculated on the skin's surface along the catheter. Intense fluorescence was observed on the surface of the catheter under a fluorescent microscope 3 days later. Mature and thick biofilms were found on the surface of the catheter via scanning electron microscopy. These results indicated the adhesion, colonization, and biofilm formation of candida albicans on the surface of the catheter. The hyperplasia of the epidermis and the infiltration of inflammatory cells in the skin specimens indicated the histopathological changes of the CRI-associated skin. To sum up, a mouse CRI model was successfully established. This model is expected to be helpful in the research and development of therapeutic management for candida albicans associated CRI.

מחבר זרקור: שיפור זיהוי קנדידה אלביקנס בזיהומי קטטר באמצעות תיוג חלבון פלואורסצנטי 

We establish a mouse model of C.albicans-associated catheter-related infection (CRI), in which biofilm forms on the catheter, and the interaction between C.albicans and host correlates well with the clinical CRI. This model helps screen therapies for C.albicans biofilm-associated CRI, laying a foundation for clinical transformation.

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

לומד קהילות חיידקים

Summary

Explore More Videos

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד

כרוני לטווח ארוך

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר