The authors do not have any acknowledgements.

Açıklanan tüm prosedürler yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onayı dahil olmak üzere, omurgalı hayvanlar, kullanımına yönelik kurallar ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır. Kesme Aletleri ve Kültür Medya 1. Hazırlık <ol><li> Ön-yıkama, bütün araçların% 3 hidrojen peroksit ve 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de daha sonra otoklav ile diseksiyon kullanılmak üzere. Bir kaputu vakum emme ile 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre kullanılarak antibiyotik ve antimikotik çözüm ile edilebilen BGJb ortamı Filtre. </li></ol> Kültür Ekipman 2. Hazırlık <ol><li> % 70 alkol ile sprey, küçük üçgenler halinde damak organları destekleyecek polikarbonat membran filtreler kesin ve kurumaya bırakın. Organ kültürü plakası üzerinde temiz ve steril eşkenar üçgen şekilli tel ızgara (20 mm) koyarak Merkez-Well Organ Kültür Dish (60x15 mm) hazırlayın. Sonra B 1 ml kuyu doldurunGJB medya kültür ortamı. NOT: Ortam damak batış olmadan ızgara seviyesine ulaşmak için yeterli olmalıdır. Deneye .Depending ızgara üstündeki zar filtreler, parlak aşağı tarafı, (grid başına 3-4 membranlar) koyun, tedavi (proteinler, antikorlar veya inhibitörleri) ortama eklenebilir </li></ol> 3. Fare Embriyo Toplama ve Kültür Hazırlık <ol><li> Vahşi tip fare embriyoları elde etmek için, kullanım 13.5 gebe CD-1 fare genetik arka plan gerginlik zaman aşımına. % 70 etanol ile diseksiyon alanı temizleyin. Not: Farelerin diğer suşları kullanılabilir. Nedeniyle büyük çöp sayısının CD-1 fareleri tercih ederim. </li><li> Onaylı protokolleri kullanarak ölüm sigorta servikal dislokasyon tarafından takip% 5 İsofluranın ile E13.5 DPC (gün çiftleşme sonrası) hamile fareler Euthanize. </li><li> Araçlara karın saç sopa önlemek için ventral karın yüzeyi üzerinde% 70 etanol püskürtün. Sonra ventral karın boşluğuna açılırkeskin künt bir işletim makas ve mikro-diseksiyon forseps bir kullanarak rahim bulun. Forseps kullanarak, tüm rahim kaldırın ve rahim vücutta kesilerek ve hafif bir işletim makas ile rahim boynuzları ucunda gövdesinden ayırın. </li><li> (Bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı için protokol kılavuzuna göre) buz üzerinde temiz bir kağıt havlu üzerine rahim yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için başka bir temiz kağıt havluyla örtün rahim. Önce daha fazla kullanmak% 70 etanol sprey kullanarak aletleri sterilize edin. Uterus ve embriyolar, buz üzerinde laboratuara nakledilebilir. </li><li> Açık laminer akış kaputu, dikkatlice keskin künt bir işletim makas ve mikro diseksiyon forseps kullanarak yumurta kesesinde küçük bir açıklık yapmak. Açılış geniş yapın ve ardından yavaşça yolk kesesi embriyo exteriorize itin. </li><li> Soğutulmuş fosfat tamponlu salin 1X (PBS), pH 7.4 içeren bir Petri kabı hemen embriyolar aktarın. Doğru sahne, ex sağlamak içinvücut, kafa büyüklüğü ve uzuv morfolojisi için bir mikroskop altında embriyo amin. Not: Doğru gelişim aşamasında olmayan embriyolar deney için kullanılmamaktadır. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> Şekil 2. Ekstremite Bud Morfoloji. Ön ve arka bacaklarda basamak arasında dokuma girinti derecesi için kontrol edilir. E13.5, tüm haneli kondensasyonları rakamlar arasında dokuma ve distal çentikler çok farklı görünen ile belirgindir. Arka basamaklı yarım gün arkasında 12 Üst sıra:. Ön ayakları, alt sıra: arka bacak. 4. damak Diseksiyon <ol><li> Mikroskop altında PBS ile bir petri çanağı bir seferde bir embriyo yerleştirin. Kullanımı küçük kesme makası ve cımbız embriyo gövdesinden başını ayırın. </li><li> Dikkatle forseps ile göz seviyesinden fare kafatası tutarak (kaçınarakmaksiller işlemi) dudak çizgisinin her iki tarafında iki kesiler yapmak. Ardından mandibula ve dilini çıkarın. Göz hizasında bir kesim yaparak maksiller süreç bölgeyi izole edin ve beyin, gözler, burun septum ve bitişiğindeki dokuyu. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> Şekil 3. Damak doku damak raflar yüksek olan 13.5 embriyolar, toplanan ancak temas sergiledi. Damak raflar statik modeli 72 st için hava ortam maddesi ara kısmında bulunan bir filtrede bir organ kültür içine yerleştirildi. (A) Düzey E13.5 embriyo üzerinde diseksiyon. (B) Mavi yıldız Diseksiyon sırasında forseps ile doku tutmak için sınır alanları. Bir yamuk filtre zarı üzerine yerleştirilir disseke damak raflar (C) Görünüm. kültür çanak (D) Side view yerleştirildikten sonra Diseke damak ve kültür ortamı eklenmesi. <ol start="3"><li> Posterior anterior gelen yönlendirmek ona yardım bağlı primer damak tutarak, damak ağız tarafı yukarı yerleştirin ve burun septum ve çevresindeki doku kaldırmak. Bir kaşık spatula kullanın ve çok dikkatli bir şekilde kültür yemekleri ızgaraları Hazırlanan filtreler (burun tarafı aşağı) damak raflar aktarın. NOT: Doğru hava medya arayüzü sağlamak için medyanın sesini ayarlayın. </li><li> Stereo mikroskop altında birincil damak incelemek ve birbirine yakın damak raflara yerleştirmek için cımbız kullanın. Onlar temas edecek şekilde yerleştirilir değilse damak raflar kaynaştırmak olmaz. Damak ön kısmı bulunan üçgen membran filtre kesin. Yamuk şekli damak ön kısmını lokalize yardımcı olacaktır. </li><li> Kültür damak raflar tek tek veya iki veya edilebilen BGJb kültür ortamı kullanarak aynı organ kültür çanak üç ile. </li></ol> 5. Kültürleme Fare damak Raflar <ol><li> Tissu inkübe72 saat boyunca nemlendirilmiş bir gaz karışımı (% 5 CO2 ve% 95 hava), 37 ° C &#39;de es ve ortam her 24 saatte değiştirin. </li></ol> Histolojik Analizi 6. Damak İşleme <ol><li> / N 4 ° &#39;de% 4 formaldehit / fosfat tamponlu tuz O ile kültür içinde 72 saat sonra damak saptamak &#160; Daha sonra, yumuşak bir transfer pipeti ile PBS ile kültürü çanağı içinde doku yıkayın. Kasetleri gömme laboratuvar mendil ve yerde bir parça damakları sarın. NOT: Laboratuvar mendil içinde damak Ambalaj dehidrasyon sürecinde kendi kaybını önlemek. </li><li> 70,% 80,% takip eden ve düzenli parafine gömme prosedürü takiben 1 saat boyunca% 100 etanol yıkamadan kadar doku kurutmak. Gömmek için, tepsiyi bakan damak ön kısmını yerleştirin. </li><li> Posterior anterior koronal yönde Seri 6 mikron bölümleri kesin. Tam bir bölüm, damak 350-450 SECTI verecektirons. Hematoksilen ve eozin (H &amp; E). 10 Skor daha önce tarif Mean Fusion skoru kullanılarak her 20 inci bölümü (MFS) Ölçek (Tablo 1) bölümleri Leke. 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

Bu makalede protokolü embriyonik gün 13,5 olarak embriyolardan damak raflar kesme için bir yöntem sağlar. Fare embriyosu Palatal raflar 37 ° C &#39;de 95% O 2,% 5 CO2 atmosferi içinde serumsuz kültür ortamı içinde kültürlenmiştir. Başarılı damak diseksiyonu kültürünün tamamlanmasına ötenazi farelerin embriyonik zaman işlem sırasında her adımda birçok faktöre kritik bağlıdır. Damak füzyon etkileyen en önemli faktörlerden biri, organ kültürü başlatmak için harcanan zaman olduğu; Embriyolar embriyonik gün 13.5 ikincil damak raflar yatay olarak olması gerekir, ama (Şekil 1) kaynaştırmak için başlamadım. İşlem sırasında bir başka kritik nokta yumurta sarısının embriyoların dışına alınmasıdır. Bu adım, yüz yapılarına zarar görmesini önlemek için büyük dikkat gerektirir. Embriyo kesesi çıkarıldıktan sonra, kafa kaldırılırbir petri kabına yerleştirilir gövde ve her iki taraftan fiber optik aydınlatma ile, bir stereomikroskop ile görülebilmesini. Mandibula ve dil damak açığa çıkarılır. Beyin ve artık doku göz hizasına kaldırılır. Bu noktada raflarda etrafında epitel tabakası dikkate almak önemlidir. Bu hücrelerin bütünlüğünü korumak için çok dikkatli bir şekilde doku işlemek için gereklidir. Epitel hücreleri MES yapışması ve oluşumu sorumludur. Her disseke damak nazal septum herhangi kıkırdak temizlemek için aşağı ağız tarafı açıktır. Bu doku damak ön tarafında ve beyaz ve daha yoğun görünür. Istenmeyen dokuların serbest Palatal raflar bir kültür kabı taşındı ve filtre zarı üzerine yerleştirilir. Rafların pozisyon stereo mikroskop altında tekrar kontrol edilir. Onlar damak füzyon tutunmayı ve daha izin itti gerekir.

Orofasial yarıklar en baskın kraniofasyal doğum kusurları vardır. Ayrıca, göz olası tüm kraniofasial kusurları alarak, bu yenidoğanların 2 en sık görülen ikinci doğum anomalisi bulunmaktadır. Yarık damak, yaklaşık 1 Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde (ABD) her yıl her 700 doğumda meydana, yarık damak insidansı yarık ayda damak veya gün başına 3 yarıkların 15 çocuklu doğan 475 çocuk eşittir. Çocuklar yaklaşık% 1, her yıl sergilediğini dünyada kraniyofasiyal dismorfoloji çeşit doğdu. Damak ve dudak yarıkları, bu anomali olan hastalarda yaşam boyu etkileri olan bir çok pahalı ve karmaşık prosedür gerekiyor. Oral yarıklı her hasta için tahmini maliyeti yaklaşık 100.000 $ 4&#39;tür. Dudak ve damak bir hastanın tedavisi, kraniofasial cerrahlar, kulak burun boğaz, genetikçiler, anestezist de dahil olmak üzere doktorların bir ekip gerektirirkonuşma-dil patologlar, beslenme, ortodontist, prostodontist, psikologlar, beyin cerrahları ve göz doktoru. Palatogenesis, ikincil damak başlangıçta dikey büyümeye ve dil sırtında üzerinde damak raf yüksekliği geçmesi eşleştirilmiş çıkıntılar olarak ortaya çıkar. Yükseklik ardından, eşleştirilmiş damak raflar (insanlarda, farelerde E14.5 -E15 ve haftanın 9) orta hat doğru büyür. Raf ucu kapakları medial kenar epiteli (MEE) orta hat epitel dikişi oluşturan yapışır. Bu mezenkimal izdiham izin vermek için mezenkimal geçiş ve / veya apoptoza epitelyal izlemektedir. Karşıt MEE yapışması olan değişiklik yarık damak neden temel bir olaydır. Ancak, sadece birkaç çalışma damak raflar 5 başlangıç ​​yapışma araştırdık. Osteoblast içine mezenkimal hücrelerin farklılaşması ile sert damak formları. Clef üretebilir damak anormal gelişimt veya dudak katılımı olmadan damakları. Damak organ kültürü teknikleri, son 30 yılda 6,7 boyunca birçok laboratuvarlar için yaygın olarak kullanılır olmuştu. Bu protokolde ayrıntıları damak diseksiyon ve statik organ kültürü bir yöntem açıklanmaktadır. Hareketsiz bir organ kültürü avantajı damak raflar kaynaştırmak olanak sağlamasıdır. Bu teknik pek çok füzyon ve sinyalizasyon deneyler 8,9 bizim laboratuvarda başarıyla kullanılmıştır. Tekniğin kapsamı geniş ve statik organ kültürü sistemi eksojen kimyasal maddelere yanıtların değerlendirilmesi de dahil olmak üzere, gerekli olduğunda kullanılabilir Ancak, farklı yollar ve spesifik proteinlerin düzenleyici büyüme faktörlerinin etkileri. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Şekil 1. Fare Palatogenesis. Fareler damağın Gelişim aşamaları. (BF) Tarama eletemsili gelişim zamanlarda ikincil damak cTRON mikrograflan (SEM). Kırmızı oklar: damak yapışma ve füzyon ilk bölümünü gösterir. Sarı oklar: füzyon sonra kaybolur birincil ve ikincil damak arasındaki boşluğa gelin (PLoS biri izni ile Kaufman 11 yeniden basıldı).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Yarık dudak ve damak, tüm doğum kusurları en yaygın arasındadır. Orta hat epitel dikiş oluşturmak yapışır epitel ile örtülü mezenkimal raflardan ikincil damak formları (MES). Teoriler MES hücreler kaynaşmış damak 1 yaparak, mezenkimal geçiş (EMT), apoptoz ve göç bir epitel izleyin öneririz. MES tam parçalanma mezenkimal hücreler çevredeki damak izdiham son temel aşamasıdır. Bu damak organ kültürü için bir yöntem sağlamaktır. In vitro protokol geliştirilen füzyon sırasında biyolojik ve moleküler proseslerin çalışma sağlar. Bu tekniğin uygulamalar harici kimyasal ajanlara değerlendirilmesi tepkiler, düzenleyici ve büyüme faktörleri ve spesifik proteinlerin etkileri de dahil olmak üzere, çok sayıda bulunmaktadır. Palatal organ kültür in vivo çalışmalar ile mümkün değildir farklı gelişim safhalarında manipülasyon da dahil olmak üzere bir dizi avantaj vardır.

Tekniği experiments.The Aşağıdaki çalışma farklı uygulanabilir damak füzyon üzerinde in vitro nikotin teratojenik etkisini test etmek için tasarlanmıştır. Farelerin iki suş Bu deney için kullanılmıştır, CD1 ve C57.Palatal dokusu nikotin hemisülfatın 0.06 6 mM konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Bu damak füzyon desen ve zamanlama iki farklı suşları farklı olduğu görülmüştür. CD1 fareleri, kontrol grubundan damak raflar zamana bağlı bir şekilde füzyon devam etmiştir. Bununla birlikte, özellikle de 6 mM nikotin konsantrasyonu (Şekil 4A) ile muamele edilen grup, nikotin geciktirilmiş füzyon. CD1 fare damak Histoloji bölümleri kontrol örneklerinde 72 saat sonra, toplam füzyon gösterdi. Nikotin alt dozlarda damak raflar bağlı ancak epitelyal hücreler kültür içinde 3 gün sonra kalır. Nikotinin yüksek dozlarda kuluçkaya damak raflar inkübasyon 72 saat sonra temas etmedi. (Şekil 4B) süreyle, nikotin 0,6 mM konsantrasyonunda kuluçkalanmıştır numuneler ile karşılaştırıldığında 48 saat süre ile inkübe edildi, ancak C57 farelerinde palatinal rafları 6 mM konsantrasyonunda daha yüksek puan saptandı. C57 fareler damak Histoloji bölümleri tedavi gruplarında sürekli epitel dikiş orta hatta devam ettiğini göstermiştir. Fusion 72 saatte kontrol grubunda sadece gözlendi. Bu farelerin her iki tür damak bu füzyon nikotin yüksek dozlarda etkili olmuştur görülmektedir. Ancak, C57 den damak nikotine daha mantıklı idi. Sonuç olarak, sonuçlar farelerin genetik arka damak dokularda nikotin yanıtları etkilediğini göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53063/53063fig4.jpg" /> <strong&gt; Şekil 4. İki 24 nikotin mevcudiyetinde kültürlenmiş fare damak soyları, 48 ya da 72 saat. Fare soyları, farklı derecelerde nikotin verdi. Nikotin yüksek doz (6 mM) maruz Tüm damak kaynaştırmak başarısız ve 24 saat sonra, damak hiçbiri kapalı olduğunu, düşük ortalama füzyon skoru (MFS) çıkan sonuçlardan vardı ve MFS (damak raflar dokunmadan değil) 1 arasında değişmektedir Tüm gruplarda 3 (kısmi füzyon) için. 48 saat tarafından kontrol damak birçok kısmen (3 üzerinde puan) kaynaştığını ve 72. saatte, CD1 damak tamamen (5 puan) erimiş, ancak C57 denetimleri tamamen (3.67) sigortalı değildi. (Maria Serrano ve Dr Kathy Svoboda gelen Yayınlanmamış veriler). <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gol </td><td> Kriterler </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hiçbir yapışma olmayan füzyon. </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Bazı belirgin yapışma olmayan füzyon. </td></tr><tr><td> 3 </td><td>Bazı MEE katmanları dağılması ve net kısmi mezenkimal izdiham ile yapışma. </td></tr><tr><td> 4 </td><td> MEE hücreleri veya dikiş kalan bazı izleri ile komple füzyon. </td></tr><tr><td> 5 </td><td> MEE hücreleri veya dikiş görünür hiçbir kanıt ile komple füzyon. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Ortalama Fusion Skoru (MFS) ölçeği (Kang ve Svoboda, 2002). Anterior her damak için puanlarını hesaplamak (bölümler 1-150), orta (150-300 bölümler) ve posterior (bölümler 300-450). 8

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Damak gelişimi çalışmalar yarık damak, muazzam bir sağlık yük getirmektedir ve şekil bozukluğuna kalıcı bırakabilirsiniz doğum defekti insidansının motive etmektedir. Biz burada damak gelişimi ve füzyon içinde yer alan farklı sinyal yollarını incelemek için kullanılabilecek kültür damak raflarına bir tekniği göstermek.

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

method-of-studying-palatal-fusion-using-static-organ-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K Görüntüleme.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  Damak gelişimi çalışmalar yarık damak, muazzam bir sağlık yük getirmektedir ve şekil bozukluğuna kalıcı bırakabilirsiniz doğum defekti insidansının motive etmektedir. Biz burada damak gelişimi ve füzyon içinde yer alan farklı sinyal yollarını incelemek için kullanılabilecek kültür damak raflarına bir tekniği göstermek. 

Video: Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...