İkincil damak görüntüleme ile ilgili ilk görüşmelerde M. Douglas Benson&#39;a teşekkür ediyoruz. Aynı zamanda, konformasyon mikroskopisinde görüntüleme koşullarını ayarlamaya yardımlarından dolayı David Castaneda-Castellanos (Leica) ve Chris Rieken&#39;i (Zeiss) kabul ediyoruz. Imaris yazılımını kullanarak niceliksel görüntü analizi için yararlı öneriler için Lynsey Hamilton&#39;u (Bitplane) takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH / NIDCR R01 DE025887 tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan deneyleri, San Francisco Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;ndeki Kaliforniya Üniversitesi protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Canlı Görüntüleme Ortamının Hazırlanması <ol><li> Sıvı kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / F12&#39;ye% 20 sığır fetüsü serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 200 ug / mL L-askorbik asit, 15 mM HEPES ekleyin. medya. NOT: Canlı görüntüleme ortamı, görüntülemeden hemen önce yapılmıştır. Bu ortam, fenol-kırmızı içerir ve bu da uzun süren canlı görüntüleme kurslarında fototoksisiteye neden olabilir. Fenol-kırmızısı olmayan ortamlar için yer değiştirme, uzun vadeli görüntülemeyi geliştirebilir. </li></ol></li><li> Düşük erime noktalı agaroz çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 350 mg düşük erime noktalı agarozu,% 3.5 stok solüsyonu yapmak için 10 mL otoklavlanmış damıtılmış suda eritin. </li><li> Agaroz çözeltisini iyice karıştırın ve agarozu tamamen çözmek için 70 ° C&#39;de bir su banyosunda inkübe edin. </li><li> Canlı görüntüleme ortamına ilave etmeden önce 37 ° C su banyosu içinde agaroz çözeltisini soğutun. </li><li> Nihai bir konsantrasyon (% 0.6) yapmak için sıvı canlı görüntüleme maddesinin 5 mL&#39;sine 1 mL agaroz stok solüsyonu ekleyin. </li><li> Prematüre katılaşmayı önlemek için ortamı agaroz ile 37 ° C su banyosunda tutun. </li></ol></li></ol> 2. Canlı Görüntüleme için Palat Eksplant Kültürü Hazırlanması <ol><li> Yakın zamanda yapışık E14.5 orta kulak raflarının diseksiyonu NOT: Tecrübelerimize göre, görüntüleme kaynaştırması biraz yapışık palatal raflarla başlamayı gerektirir; Bu yapışma, füzyonun görüntüleme sırasında meydana gelmesini önleyen eksplant hareketlerini önler. <ol><li> E14.5 evre embriyolarını 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde parçalayın ve yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade edenK14-CRE; ROSA26-mTmG flox ) veya (Kırmızı floresan protein) RFP ifade eden ( Lifeact-mRFPruby&#39;den ) pozitif embriyoların, flüoresan lambalarla donatılmış bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak sentezlenmesi. Agaroz olmadan önceden ısıtılmış canlı görüntüleme kültür ortamına doku aktarın. </li><li> Embriyo başını kesin ve iki ince No. 5 forseps kullanarak üst beyin alanını çıkarın ( Şekil A-C ). Embriyo tutmak için bir No.5 forseps kullanın, diğer No.5 ise forma raflarının dışındaki ekstra dokuları kesmek için forseps kullanın. NOT: İnce makas, bir No. 5 forseps yerine embriyo kafasını kesmek için kullanılabilir (ilk adım). Bununla birlikte, iki ince 5 forseps hassas kesim yapmak için daha iyi kontrol sağlayacaktır. </li><li> Şekil 1 D ve 1E&#39;de gösterildiği gibi palatal raflara zarar vermeden çene kemiğini dikkatle çıkarın. Damakların hasar görme olasılığını azaltmak için mandibuların diseksiyonu ile dili tutun, fDilin dikkatli bir şekilde çıkarılmasıyla ollowed. </li><li> Mandibula ve dil çıkarıldıktan sonra, orta damarın ağız tarafını, MES&#39;de güçlü muhabir sinyalini teyit etmek için flüoresanlı bir stereomikroskop ile inceleyin ( Şekil 1 M ). </li><li> Mandibula ve dil çıkardıktan sonra arka bacak ve beyin sapı da dahil olmak üzere arka kısımları ayırın ( Şekil 1 F ). </li><li> Her iki maksilayı yapışık rafta raflarla çıkarın ( Şekil 1 G ). </li><li> Ön üst çene dokusunu kesin ve birincil ve ikincil damağı tutun ( Şekil 1 H ve I ). </li><li> Ekstraktanın burun tarafındaki nazal septumu MES&#39;i açığa çıkarın. NOT: Diseksiyonların sonraki bu aşamaları, iki ikincil palet rafı arasındaki temasları bozmamaya dikkat etmelidir. Nazal septumun çıkarılması,Diğer alanlardan arka plan sinyalini düşürmek ve aynı zamanda dikey doku hareketini azaltarak kararlı görüntülemeye olanak tanır ( Şekil 1 J-L ). </li><li> Palatal rafları parçaladıktan sonra, dokular arasındaki epitel tabakasına herhangi bir hasar gelmediğinden emin olmak için, orta hat bildirici sinyalini tekrar inceleyin. </li></ol></li><li> Canlı görüntüleme ortamı ile kültür çanağında damak eksplantlarının hazırlanması <ol><li> 35 mm cam alt çanağa canlı görüntüleme ortamı koyun. </li><li> Ayna konfokal mikroskop ( Şekil 1 N ) ile görüntüleme için mümkün olduğu kadar cam altına yakın olarak disseke palate raflar oral yan koyun. </li><li> Sıcaklığı düşürerek hızla agaroz katılaşmayı hızlandırmak veya kültür çanağını 4 ° C&#39;ye koymak için kültür çanağının yakınında iletken bir yüzeye kuru buz peletleri yerleştirin. Parafin yerleştirme için kullanılan gibi soğuk bir tabaka da bu işlemde kullanılabilirbir avantajdır. NOT: Kuru buz kullanıldığında, donma ortamını önlemek için agaroz ortam değişimi dikkatle izlenmelidir. </li></ol></li></ol> 3. Palat Explantının Konfokal Zaman Aşımı Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme ve Veri Toplama <ol><li> Agaroz yarı katılaştıktan sonra, 37 ° C inkübasyon odası ile donatılmış ters çevrilmiş konfokal mikroskopta kültür çanağı monte edin. Beyaz ışık konfokal mikroskop ve hücre gözlemci dönen disk konfokal mikroskop kullanın. NOT: CO 2 gazı olmadan 15 mM HEPES içeren değiştirilmiş bir ortam kullandık. </li><li> Ortamın buharlaşmasını önlemek için bir şırınga kullanarak kültür çanağı ile örtü arasında petrol jeli koyun ( Şekil 1 N ). NOT: Gece boyunca (O / N) kültürden sonra kültür çanağı örtüsünün üzerinde yoğunlaşma meydana gelir ancak ortam hacmi değişmez ve petrol jölesinin ortamın buharlaşmasını engellediğini gösterir. </li><li> Düşük büyütme hedefleri (10x) ile ilgi alanını bulun ve zaman atlamalı canlı görüntüleme için daha yüksek büyütme hedefleri (3x dijital zumlu 20x objektif veya Immersol W ile 40x objektif) kullanın. NOT: Kesilen ikincil palet rafları düz değildir. İkincil damak kavisli bir yapıdadır ve bu da tüm MES&#39;i aynı düzlemde görüntülemeyi zorlaştırmaktadır. Düşük büyütme (10x) görüntüleme bütün damak görüntülemesine izin verebilir, ancak 40x hedefler daha derin Z konumlarındaki ayrıntılı hücresel hareketleri incelemek için daha iyi görüntü özünürlüğü sağlayacaktır. Orta damak bölgesindeki eğrilik yüksektir. Ön ve arka damak orta damağa kıyasla nispeten düzdür. En büyük eğrilik bölgelerini önlemek için sık sık sekonder damağın orta önüne doğru görüntü oluştururuz. </li><li> Uygun lazer uyarımını kullanarak (GFP için 488 nm ve RFP için 532/561 nm) ( Şekil 2 ), 16-24 saat boyunca her bir adımda 5 μm&#39;lik çoklu Z yığınlarını tarayın ( Şekil 2 ). NOT: Potansiyel fototoksisiteyi azaltmak için, minimum lazer gücü ve maruz kalma süresi kullanın. Bu, özellikle çok renkli görüntüleme durumunda önemlidir. Membran Domates (mT) için 552 nm lazer gücünün% 22&#39;sini, membrGFP için 495 nm lazer gücünün% 30&#39;unu (mG) ve membrRFP için 561 nm lazer gücünün% 25&#39;ini kullanın. Ortalama pozlama süresi 550 ms idi. </li><li> Hücre izleme ve niceliksel analiz yapmak için görüntü analiz yazılımını kullanın. </li></ol></li></ol> 4. Veri İmaj Analizi NOT: Burada Imaris kullanıldı. Benzer veri analizleri ImageJ veya Volocity yazılım paketleri ile de yapılabilir. <ol><li> Görüntü dizilerinden 3 boyutlu (3B) yüzeyler oluşturma. NOT: Bu bölüm zar GFP sinyaliyle üretilen bir filmden bir yüzey oluşturulmasını sağlar. <ol><li> Düzenle | Görüntü Ayarı&#39;nı gösterin ve sinyal yoğunluğunu membran sinyalinin temizlenebilmesi için histogram sürgüsünü kullanınFilmin uzunluğuna dikkat edin ( Şekil 3A ). </li><li> Görüntü kullanarak doğru ağartılmış sinyali düzeltin İşleme | Zayıflama Düzeltmesi . Filmin uzunluğu boyunca membran sinyalinin net olması için Yoğunluk Ön ve Yoğunluk Geri değerlerini ayarlayın. Bu değerlerin belirlenmesinde bazı deneme yanılma gerekebilir. NOT: Sınırlı Lazer Penetrasyonu nedeniyle Yoğunluk Arka (Derin Z konumu) değeri Yoğunluk Cephesinden (Zemin Z konumu) daha düşük olacaktır. Bu nedenle, bu değerler Z serisindeki sinyal yoğunluğunu normalleştirmek için de değiştirilebilir. Her iki değer de ağartma düzeltmesini sağlamak için ayarlanabilir. Zayıflatma düzeltme de Emisyon zayıflama düzeltmesi 19 olarak adlandırılır. </li><li> Membran sinyalinden bir yüzey oluşturmak için Geçme | Yüzeyler , bir kaynak kanalı ve Eşik türü (Mutlak Yoğunluk) seçin ve Algoritma Ayarları&#39;nın altındakilect Yalnızca bir İlgi Çekici Bölgeyi Bölümlendir Ve Sonunda bütün görüntünün işlenmesi , ardından ileri ok üzerine tıklama; (Varsayılan ayarları kullanın veya Yüzey Alan Ayrıntı Seviyeleri ve Eşik Değerleme yöntemini deneme yanılma ile belirleyin) oluşturulan yüzeyin flüoresans sinyalini yansıtıp yansıtmadığını kontrol edin. Bir İlgi Alanı belirtmek için, X, Y ve Z konumlarını kırparak oluşturulacak bölge ve saatleri seçin. NOT: Seçin Tüm görüntünün süreci sonunda filmler arasında ayarlamalar ve eşikler uygulanacak. </li><li> Yeniden ileri ok düğmesini tıklayarak bir yüzey oluşturun. Filtrelerdeki histogramı zar sinyaline karşılık gelecek şekilde değiştirerek eşiği ayarlayın. </li><li> Yüzey oluşturulduktan sonra yüzey sinyalini görselleştirmek ve yüzey oluşturma işlemini bitirmek için Yüzeyler / Ayarlar&#39;da yüzey seçinArd ok düğmesi ( Şekil 3 B ). </li><li> Yüzeye Git | Düzenleyin ve maskeli bir kanal resmini oluşturmak için Maske Özellikleri tüm Maske tıklayın. </li><li> Tamam&#39;a tıkladıktan sonra Maske Kanalı penceresi otomatik olarak açılır; GFP kanalını seçin, yüzeyin dışındaki vokselleri, maksimum sinyal yoğunluğu değerine ( Düzen | Ekran ayarında bulunur ) ve yüzeyin içindeki vokselleri minimum GFP yoğunluğuna ayarlayın (aynı zamanda Düzenle | Ekran ayarı ), Membran Sinyali maskesini oluşturmak için Maske Ayarları&#39;nda . </li><li> Zar sinyalinin maskesi Hacim görünümünde görüntüleneceği için, Görüntü İşleme | Kontrast Değiştir | Ters çevirme ( Şekil 3 C ). </li></ol></li><li> Ters yüzey görüntülerinden lekeleri algılama. NOT: Bu bölüm, her bir hücrenin merkezininBenzersiz bir nokta ile işaretlenmiş ve zaman ve mekan üzerinde izlenmektedir. <ol><li> Sahneyi Aşmak&#39;ı seçin | Noktalar | Yarat ; Algoritma Ayarlarında, sadece bir İlgi Alanı , Sonunda Görüntünün Süreci ve Zamanla İz Noktalarını Parçalamayı seçin . </li><li> İleri oku tıklayın ve bir İlgi Alanı belirtin; Noktaları izlemek için bölge ve saati seçin; Ileri oku itmeye devam edin, maskelenmiş kanalı bir kaynak kanalı olarak seçin ve noktaların XY çapını belirleyin. </li><li> İleri ok düğmesini tıklattığınızda otomatik olarak bir filtre penceresi açılır; Her hücrenin merkezinde tek noktalar oluşturmak için histogramdaki değerleri değiştirerek nokta tespit eşiğini ayarlayın ( Şekil 3 D ). </li><li> İleri ok düğmesini tekrar tıklattığınızda Algoritma penceresi açılır. Autoregressive hareket izleme modeli 20&#39;yi seçin ve maksimum izleme titreşimini belirtin.Duruş ve maksimum boşluk boyutu ile kısa süre kesintili olan izleri birbirine bağlar. </li><li> İleri ok düğmesini tekrar tıklattığınızda Filters (Filtreler) penceresi açılır, her hücre takip edilecek şekilde histogramı ayarlayarak parça süresi eşiğini ayarlayın. İleri çift ok düğmesini tıklamak spot algılamayı tamamlar. </li><li> Doku kaymasını düzeltmek için Noktalar | Editör&#39;ü izle ve Doğru Drift&#39;i seçin. Bir Algoritma penceresi otomatik olarak açılacaktır; Translasyonel sürüklenmeyi seç , tüm sonucu ekle ve Nesneleri düzelt konumunu seçin . </li></ol></li><li> Kantitatif analiz için vantage grafikleri üretme. NOT: Programın Dağılım Plakası, birden çok nesneyle çok boyutlu (X, Y, Z, Renkli ve Ölçekli) grafikler üretmek için kullanılan bir araçtır. Bu arsalar birçok hücre hareketinin zaman içindeki eğilimlerini izlemek için yararlıdır. <ol><li> Kullanarak hücre izleme verilerinin 2D veya 3D parsellerini yapınVantage-New Vantage plot menüsünü ekleyin ( Şekil 3 E ve 3F ). </li><li> Cilt veya Noktalar seçin ve Oluştur / Kategori ve Arsa Türü&#39;nü seçin </li><li> Farklı Vantage grafikleri oluşturmak için Plot Değerlerini Ayarlayın. </li><li> Enstantane işlevini kullanarak grafikleri dışa aktarın. NOT: İstatistiksel veriler, daha fazla niceliksel analiz için, Plot Numbers Area | Kurtar </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

3D organ eksplant kültürü ile doku morfogenezinin canlı görüntülemesi, sabit doku kesitlerinin konvansiyonel boyama analizinde gösterilemeyen hücresel proseslerle ilgili ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Fare embriyonik sekonder damakta in vitro eksplant kültürü kullanarak, epitelyal yakınsama ve hücre ekstrüzyonu içeren damak füzyonu için yeni bir mekanizma önermek için birkaç ilginç hücre davranışları gözlemledik. Bu tip çalışmalarda karşılaşılan sık görülen bir zorluk, uzun süren bir süre boyunca sürekli lazer uyarımları ile foto-ağartma yöntemidir. Çalışmalarımızda, beyaz ışık konfokal ve dönen diskli bir konfokal mikroskop kullanıldı. Sinyal yoğunluğunun zaman içindeki azalması, görüntüleme yazılımında (LAS-AF) ağartma düzeltmeleri ile düzeltilebilir (Protokol 4.1). Beyazlatma düzeltmesi sınırlı olduğundan, her görüntüleme sisteminde dikkatlice lazer gücünü ve pozlama süresini optimize etmek önemlidir. Ayrıca kontrol ettikDamak füzyonu 3 günlük kültürden sonra canlı görüntüleme ortamında normal olarak gerçekleşir 6 . Canlı görüntülemede ikinci bir yaygın konu doku kaymasıdır. Canlı görüntüleme esnasında tutarlı görüntüler elde etmek için sürüklenmeyi en aza indirmek kritik önem taşır, çünkü odak düzlemindeki değişiklikler zaman içindeki morfogenetik değişiklikleri anlamakta zorluk çekebilir. Termal sürüklenmeyi kontrol etmek, birçok konfokal mikroskopta (Kesin odak, mikroskopta) elde edilebilirken, cam taban ile ilişkili olarak dokunun kayması bu yöntemlerle düzeltilemez. Agarozun kullanımı ve eksplantın cam tabanına yerleştirilmesi bunun en aza indirgenmesine yardımcı olur, ancak yine de sadece nispeten sabit bir konumda tutan filmleri analiz etmek için özen gösterilmelidir. Görüntüleme alanındaki birden çok kontrol noktasını takip edip, sabit kalmalarını, benzer bir eğilimle hareket ettiklerini veya farklı şekilde hareket ettiklerini belirlemek için bu süre belirlenebilir. Bir ölçüde, post-processing fu&#39;yu kullanarakİğneler, canlı görüntülemede bazı doku sürüklenmelerinin düzeltilmesine izin verir (Protokol 4.2). Düşük çözünen agaroz, eksplant dokularını hareketsiz kılmak için canlı görüntüleme ortamında% 0.6 nihai konsantrasyonda kullanılmıştır. Yüksek konsantrasyonlarda agaroz test edildiğinde, muhtemelen mekanik kısıtlamaya bağlı olarak doku morfolojik oluşumunu bozduğu görülmüştür. Bu nedenle, morfogenezi rahatsız etmeden doku sürüklenmesini en aza indirgemek için doğru agaroz yoğunluğunu kullanmak önemlidir. Konfokal görüntüleme derinliğine bağlı olarak, bu yöntem damak füzyonunun çok derin Z planlarını incelemede sınırlar getirir. WHITE LIGHT ve spinning disk konfokal mikroskoplarını kullanarak, görüntü bu sınıra kadar donuk ve solgunlaşmaya başlamış olsa da, 100 μm derinliklerden gelen sinyal başarılı bir şekilde görüntülendi. Dudak füzyonu, oronazal ve anteroposterior eksenlerde ilerleyici bir süreç olduğundan, çoklu pozisyonların görüntülenmesinin, farklı bölümlerinHs damak füzyonu, ancak görüntülemenin derinliğini geliştirmek için gelecekte iki-fotonlu veya hafif levha konfokal mikroskopi kullanılabilir. Deneyimlerimizin çoğunda, damak eksplantlarının ağız tarafı görüntülendi. Damak eksplantının burun tarafının görüntülenmesi zordur, çünkü nazal septum kaynaştırılır veya ikincil damar raflarına çok yakın olur. Burun kısmından fuzyonu görüntüleme girişimlerinde, ekstra burun dokusunun damak damar epitelinden gelen sinyal ile etkileşime girmemesi için çıkarılması da gerekiyordu. Nazal septumun diseksiyonu damak eksplantlarına hasar yarattığından damak eksplantının burun tarafının görüntülenmesi mümkün olsa da, mümkün olmuştur. Reporter fare doku eksplantlarının canlı görüntülemesi embriyonik gelişim sırasında doku morfogenezinin hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir yöntemdir. Konfokal mikroskopi teknikleri ve kantitatif görüntüleme analizi kullanarak, sekonder damak füzyonu gibi temel gelişimsel süreçlerHücresel düzeyde araştırıldı.

Doku füzyonu çoklu organların gelişiminde önemli bir adımdır. Yarık dudak ve damak, spina bifida ve kalp malformasyonları gibi temel insan doğum kusurları, doku füzyonu 1&#39;deki kusurlardan kaynaklanabilir. Fare sekonder damak füzyonu, gelişmede doku füzyonunu kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir 2 , 3 , 4 . Fare, sekonder damak gelişimi E11.5 civarında başlar ve bilateral maksiller süreçlerin her birinde ikinci bir palale rafının büyümesi ile başlar. Palatal rafların başlangıçtaki büyümesi, yaklaşık olarak E14.0 olana kadar dil boyunca dikey olarak gerçekleşir; bu esnada, palatal raflar, dilin üstünde yatay olarak yükselir. Medial yönelimli büyüme, iki palatal rafın uygun epitelleri arasında fiziksel temasa neden olur ve orta hat epiteli oluştururE15.5 adresindeki Al Seam (MES). Müdahale eden MES, mezenkimal konfluansa ve tamamen sağlam erimiş ikinci taliatın gelişmesine E15.5 3 izin verecek şekilde ikincil palatal raflar arasında kaldırılmalıdır. Paylaşılan bir epitelial MES hücre tabakası, iki ayrı palet rafı arasında nasıl oluşturulur ve daha sonra mezenkimal konfluansı sağlamak için alınır damak gelişiminde merkezi bir sorundur. Fare histolojik ve elektron mikroskobu (EM) çalışmaları, eksplant kültürü çalışmaları ve fonksiyonel fare genetiği deneylerine dayanarak, bu süreçte birkaç temel hücre davranışı dahil edilmiştir. Her bir palatal rafın medial kenar epitelyumundan Filopodia benzeri projeksiyonlar ilk temas 5 , 6&#39;yı kolaylaştırır ve bunu takiben bu epitelyal hücrelerin ortak bir tek MES 6 , 7&#39;ye interkalasyonu sağlanır. Ortaya çıkan paylaşılan MES&#39;in kaldırılmasıÜç özel olmayan mekanizma ile devam etmesi önerildi. Histolojik gözlem ve yaşamsal boyalarla eks vivo soy araştırması kullanan erken çalışmalar, MES hücrelerinin epitelial mezenşimal geçiş (EMT) ile ortadan kaldırılabileceğini, ancak son zamanlarda epitelyal hücrelerin genetik soy taklidinin belirsizliği arttırdığını gösterdi ( 8 , 9) Epitel hücrelerinin palatal raf mezenkimine uzun süreli katkısı 10 , 11 , 12 . Önemli sayıda apoptotik hücre ve bazı mutantlarda uygun damak füzyonuna girilemeyen sayıda azalma, apoptozun MES çözünmesinin önemli bir sürücüsü olabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır 2 , 3 . Sonunda, başlangıçta epitelial etiketleme ve progresif zaman noktalarında statik gözlemi içeren çalışmalara dayanan MES hücreleriOronazal ve anteroposterior boyutlarda 11 , 13&#39;e göç etmeleri önerildi, ancak bu tür dinamik hücre davranışları canlı palat dokuda gözlemlenememesi nedeniyle başlangıçta doğrulanmadı. Son zamanlarda, eksplant edilen palet raflarının konfokal canlı görüntülemesi ile flüoresan etiketlemenin fare genetik yöntemlerini birleştiren yeni bir canlı görüntüleme metodolojisi geliştirerek bu davranışları doğrudan gözlemledik. İlk olarak, damak füzyonu sırasında damak epitel hücrelerindeki dinamik hücresel davranışları görselleştirmek için Keratin14-cre fareleri 14 , 15 ile ROSA26- mTmG flox farelerini geçerek bir epitelyal spesifik raportör fare ürettik . Elde edilen embriyoların damak eksplant kültürünün konfokal canlı görüntülemesi, önceden önerilen bazı hücresel davranışları doğruladı ve füzyon işleminde yeni olayları saptadı 6 </&gt; Sup. Epitelyal hücre membranı çıkıntıları ilk hücre-hücre temasından önce gerçekleşmiş ve ardından hücre interkalasyonu ve oronazal hücre yer değiştirmesi ile epitelyal yakınsaklık izlemiştir. Özellikle, aynı zamanda bu hücre ekstrüzyon, epitelyal homeostazında önemli bir rol oynadığı rapor bir yöntem keşfettik, fare ikincil damak füzyon 6, 16 tahrik eden bir ana mekanizma oldu. Bu görüntüleme yöntemi, diğer muhabir hatlarıyla kullanılabilir; Füzyon işlemi sırasında aktin sitoskelet dinamikleri incelemek için , Lifeact-mRFPruby transgenik fareler 17 , 18&#39;i kullandık. Diğer gazeteciler damak füzyonunun diğer özel yönlerini gözlemlemek için de kullanılabilir ve bu yöntem görüntüleme ihtiyaçlarına ve mikroskop kullanılabilirliğine bağlı olarak lazer tarama konfokal mikroskopi veya eğirme disk konfokal mikroskopi için uyarlanabilir. Canlı görüntüleme gittikçe gelişme biyolojisinde temel taş yaklaşımı haline geliyor. PartiCularly, craniofacial morfogenezis karmaşıktır ve insanın yüzünü etkileyen doğum kusurları yaygındır. Bu konfokal canlı görüntüleme yöntemi, insan kraniofasial anormalliklerinin kökenlerinin yanı sıra temel temel gelişim mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

Sağlam sekonder damak oluşturmak için ikinci helezoni rafların kaynaştırılması, memeli gelişiminde kilit bir süreçtir ve bozulması, insanlarda yaygın görülen konjenital bir anomali yarık yarık damganın oluşmasına neden olabilir. İkincil damak füzyonu kapsamlı olarak incelenmiş ve bu süreçte aracılık yapabilen birkaç önerilen hücresel mekanizma ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar çoğunlukla, gelişme sırasındaki aşamalı zaman noktalarında sabit embriyonik dokularda veya statik zaman noktalarında analiz edilen sabit eksplant kültürlerinde gerçekleştirilmiştir. Statik analiz, damak füzyonu gibi dinamik morfogenetik süreçlerin analizi için sınırlıdır ve palatal füzyona ne tür dinamik hücresel davranışlar araştırabilir tam olarak anlaşılamamıştır. Burada fare embriyolarında ex vivo sekonder damak füzyonunun canlı görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Damak füzyonun hücresel davranışlarını incelemek için epitel özgü Keratin14 -cre ROS içinde damak epitel hücreleri etiketlemek için kullanıldıA26-mTmG flox raportör embriyoları. Filamentöz aktini görselleştirmek için, Lifeact-mRFPruby raportör fareleri kullanıldı. İkincil damak füzyonunun canlı görüntülemesi, embriyonik gün (E) 14.5 evre embriyolarının yakın zamanda yapışmış sekonder palal raflarını ve ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop ile görüntülemeyi mümkün kılmak için agaroz içeren ortamda bir cam alt çanakta kültürleyerek diseke ederek gerçekleştirildi. Bu yöntemi kullanarak, ikinci damak füzyonu sırasında çeşitli yeni hücresel davranışlar tespit ettik. Farklı hücre davranışlarının uzayda ve zaman içinde nasıl koordine edildiğine dair bir değerlendirme, bu dinamik morfogenetik süreci anlamamıza büyük ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, mutant fare hatlarına veya ikincil damak füzyonunun nasıl kontrol edildiğini daha iyi anlamak için farmakolojik inhibitörlerle tedavi edilen kültürlere uygulanabilir.

Dudak eksplant kültüründe canlı görüntüleme, damak füzyonuna aracılık eden çok hücresel süreçleri ortaya koymuştur 6 . İki epitel hücresi arasındaki ilk temaslar membran çıkıntıları ile yapılır ( Şekil 2 B-2E ). İki epitelyal katman buluştuğunda, epitelyal yakınsak yoluyla entegre bir tek hücre katmanı MES yapmak için interkalasyonun ardından çok hücreli tabakalı bir MES oluştururlar ( Şekil 2 A-2E ve Şekil 2 K-20 ). Daha derin Z seviyelerindeki epitel hücreleri, ilerleyen bir şekilde, epitelyal yakınsama sürecine katkıda bulunan MES&#39;in oral yanına da kaydırılır ( Şekil 2 K ). Orta damak MES&#39;de posteriordan hücre migrasyonu gözlendi ( Şekil 2 F-2J ). Buna ek olarak, epitelyal hücre ekstresini buldukDudak füzyonu esnasındaki erime olayları, MES&#39;deki epitelyal hücrelerin bu aktif süreçle uzaklaştırılabileceğini düşündürmektedir ( Şekil 2 Q, 2T ). Entegre epitel dikiş, mezenkimal konfluansı elde etmek için sonuçta bozulacaktır ( Şekil 2 S, 2T ). Lifeact-mRFPruby damak, damak füzyonu 6 sırasında dinamik aktin sitoskeletal yeniden düzenlemeler gösterdi. Filamentöz aktin, epitelyal ve mezenkimal alanlar arasındaki sınırda zenginleşerek, anterior-posterior eksen boyunca bir kablo benzeri yapı oluşturdu ( Şekil 2 K-2T) . Akutomiyozin kontraktilitesi epitelyal yakınsaklığı ve MES kırılmasını harekete geçirir, çünkü miyozin aktivitesinin veya aktin polimerizasyonunun kimyasal inhibisyonu bu dinamik işlemleri 6 engelledi. Hin-page = &quot;1&quot;&gt; Yazılım, damak füzyonu sırasında hücresel davranışları izlemek için kullanıldı. Hücre takibi için en iyi yöntem muhabir sinyaline bağlıdır. Bir nükleer muhabir faresi kullanılırsa, program hücresel merkezler 21 olarak floresan sinyallerinin merkezini izleyebilir. Bu nedenle, ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 gibi Nükleer GFP raportör fare, dokuya özgü Cre çizgilerini kullanarak epitel hücrelerini etiketlemek için kullanılabilir; Bu özel nükleer muhabir elimizde, canlı görüntülemede kullanılan uzun süre boyunca hızlı beyazlatma sergiledi. Bu nedenle, çalışmalarımızda epitel hücresi hareketlerini izlemek için membran-GFP raportörünü ( ROSA26-mTmG flox ) kullandık. Bu, ayrı bir hücrenin bir zar sinyaliyle tanımlanması ve izlenmesi için bir yöntem gerektirdi. Bu sorunu çözmek için modifiye bir hücre izleme yöntemi kullandık ( Şekil 3 ve Protokol 4 ). Içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56041/56041fig1.jpg" /> Şekil 1 : Fare sekonder damak diseksiyonunun şematik görünüşü. ( A ) E14.5 fare embriyo yandan görünüşü. Paltal rafları ayırmak için, baş ilk beyaz noktalı çizgi, # 1 boyunca kesildi. ( B, C ) Üst beyin (ikinci beyaz çizginin üstünde # 2) kaldırıldı. ( D, E ) Kesilen kafa Oral görüş. Alt mandibula (# 3) diseke edildi ve dilden (# 4) çıkarıldı. ( F ) 5 numaralı hattın başının arka kısmı kesildi. ( GI ) Hem üst çene (# 6, # 7) hem de üst çene (# 8) ön kısmı çıkarıldı. ( JL ) Nazal septum (# 9) bir K14-cre&#39;den disseka damağının MES&#39;inde ( M ) GFP sinyalleri alındı ; ROSA26 mTmG fare embriyo. ( N ) Canlı görüntüleme ayarı. Ahbabın sözlü yanıYedi eksplant ters çevrilmiş konfokal mikroskop ile görüntülenecek şekilde bakıyordu. MES, beyaz ok uçlarıyla ( FI ) gösterilir. Görüntüleme alanı, L ve M&#39;de beyaz noktalı kutularla gösterilir. Ölçek çubukları A&#39;da 2 cm, BI&#39;de 1 cm, JM&#39;de 500 μm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/56041fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56041/56041fig2.jpg" /> Şekil 2 : Diyatik dışı eksplant kültürlerinin canlı görüntülemesi. ( AE ) K14-cre&#39;den ön orta damakta canlı görüntüleme ; ROSA26 mTmG eksplant (5 μm derinlik). Beyaz ok ucu, bir epitel hücresinden ( FJ ) bir membran çıkıntısı göstermektedir. K14-cre&#39;den orta damak canlı görüntüsü ; ROSA26 mTmG eksplant (5 μm depth). Beyaz oklar önten arka damağa hücre göçlerinin yönünü göstermektedir. ( KO ) Lifeact-mRFPruby eksplanttan anterior damakta canlı görüntüleme (5 μm derinlik). Oral yüzeyde epitel hücre yer değişimi (sarı ok) ve orta hatta kablo benzeri aktin yapıları ile entegre MES oluşturmak için yakınsaklık. ( PT ) Lifeact-mRFPruby eksplanttan anterior damakta canlı görüntüleme (25 μm derinlik). Kırmızı ok hücre ekstrüzyon olayını ( Q, T ) gösterir. Dikişin gelecek kırılma noktaları, S ve T&#39;de iki dikey beyaz okla gösterilir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şekildeki tüm canlı görüntüleme verileri, daha önce 6&#39;da yayınlanan denemelerden elde edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/56041fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Sayfalık = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56041/56041fig3.jpg" /> Şekil 3 : Veri analizi. ( AD ) K14-cre&#39;den gelen membran GFP sinyalleri ile epitel hücrelerini izlemek için ; ROSA26 mTmG damak eksplant ( A ), Bir yüzey zarı GFP sinyalinin hacim oluşturma yoluyla üretildi ( B ). Ters görüntüler, oluşturulan yüzeyi maskeledikten sonra üretildi ( C ). Imaris ( D ) &#39;de bir noktalar tespit fonksiyonu kullanarak hücrelerin merkezleri inverted görüntülerden tanımlandı. ( E ) 3D rekonstrüksiyon, hücrenin hareketlerini birden fazla yönde izlemenize izin verir. A: anterior, P: posterior, N: nazal, O: oral ( F ) 2D analizi, orta damak MES&#39;de anteriordan posterior yönde göç eden hücreleri gösteren bir vantage çizimi oluşturur. Ölçek çubukları AD&#39;de 20 μm, EF&#39;de 10 μm&#39;dir.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Video Şekil 1" src="/files/ftp_upload/56041/56041movie1.jpg" /> Video Şekil 1: K14-cre&#39;nin canlı görüntülemesi ; ROSA26-mTmG flox anterior damak (5 μm derinlik). Görüntüler 16 saat 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) yakalandı, Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu video daha önce referans 6&#39;da yayınlanan bir filmin farklı bir Z konumudur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a> <img alt="Video Şekil 2" src="/files/ftp_upload/56041/56041movie2.jpg" /> Video Şekil 2: K14-cre canlı görüntüleme ; ROSA26-mTmG flox<html> Orta damak (5 μm derinlik). Görüntüler her 15 dakikada bir (15 dakika / çerçeve) 13 saat 30 dakika boyunca yakalanmıştır, Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu video daha önce 6 referanslı yayınlandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/Video_Figure_2.mov" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a> <img alt="Video Şekil 3" src="/files/ftp_upload/56041/56041movie3.jpg" /> Video Şekil 3: Lifeact-mRFPruby anterior damak canlı görüntüleme (5 μm derinlik). Görüntüler 7 saat 50 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu video daha önce 6 referanslı yayınlandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/Video_Figure_3.mov" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a> T &quot;fo: keep-together.within-sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Video Şekil 4" src="/files/ftp_upload/56041/56041movie4.jpg" /> Video Şekil 4: Lifeact-mRFPruby anterior damak canlı görüntüleme (25 μm derinlik). Görüntüler 7 saat 50 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu video daha önce referans 6&#39;da yayınlanan bir filmin farklı bir Z konumudur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56041/Video_Figure_4.mov" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Görüntüleme.  University of California San Francisco.  Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir. 

Video: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...