This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için dikkate değer bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, farklı bakteriyel patojenler tarafından hazırlanan stratejilerin çeşitliliği, bakteriyel virülans faktörleri ve enfeksiyonlar sırasında hedeflenen sinyal yollarının host kimlik ve karakterizasyonu gerçek bir meydan okuma temsil etmektedir. Bu anahtar konak / patojen etkileşimi göbeklerinin büyük ölçekli tanımlama için yeni yaklaşımların geliştirilmesi için çağrıda bulunmaktadır. yenilikçi, yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama tekniklerinin son gelişme hücre içi bakteriyel patojenler 15 çalışmaya adapte edilebilir paha biçilmez bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı tahliller kombine bir tarama yaklaşımların geliştirilmesi için bir model olarak zoonotik bakteriyel patojen Coxiella burnetii&#39;ye kullandık. Importantly, bu tarama yöntemi, işgal çoğaltmak ve enfekte hücreler içinde devam için bu bakterinin tarafından geliştirilen stratejilerin küresel bakış sağlayan, Coxiella içi döngüsünün birden adımların eşzamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Burada tarif edilen yaklaşım, bakteriyel patojenlerin çalışma uygulanmış iki iyi bilinen tekniklerle, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı deneylerde, dayanmaktadır. Yüksek verimli / yüksek içerik ekranlarında bağlamında bu tekniklerin birleştiren bize olayların çok yüksek sayıda (bakteriyel mutasyon başına tipik 15.000 enfekte olan hücreleri görüntülü ve analiz edilir) analiz ederek bakteriyel mutasyon sayısının yüksek etkilerini değerlendirmek için izin verir. Bu tür, doğası gereği, yüksek değişkenliğe tabidir konak hücreleri ve hücre içi çoğaltma, bakteriyel işgali gibi olaylar önemli bir istatistiksel analiz sağlar. Bu ep dışındaki bu hücre hatları dikkat etmek önemlidirithelial tarama bu tür için kullanılabilir. Konakçı hücre organelleri tespit etmek daha kolay Ancak, düz ve büyük epitel hücreleri görüntü analizi için uygun olan. Otomatik mikroskoplar çoğunluğu otomatik plakaların sayıda işleyebilir, çünkü aynı anda elenebilir mutantların sayısı neredeyse hiçbir sınırı vardır. Patojenin bağlı olarak, kullanıcı teneke ayrıcalık, bir Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanımı. görüntü elde etme zamanı çoğunlukla kuyu başına ve görüş alanı başına elde edilen kanalların sayısı edinilen alanların sayısı, mikroskop kameranın duyarlılığına bağlıdır. Kullanıcı tarama protokolü optimize etmek için bu faktörleri nasıl ayarlanacağı karar verebilirsiniz. Bir örnek olarak, bu noktada 5.1 de belirtilen koşullar kullanılarak, bir 96-çukurlu plaka / saat görüntülenmiş. Görüntü analizi büyük ölçüde kullanılan makine (veya makinelerin küme) bağlıdır. Biz 12 çekirdekli (2 x 3.06 GHz 6 Çekirdekli), 48 GB RAM iş istasyonu kullanın. Bu makine approxi gerektiriryaklaşık 40 dakika bir plaka elde edilen görüntüleri analiz etmek. Bu analizleri uygularken, gelişmekte olan yeni resim kadar (veya mevcut optimizasyonu) numune çok sayıda manipülasyon ve işlenmesini sağlamak için protokolleri olduğunda önemli bir yönü dikkate alınacak. Tipik bir örnek bize hızla yükseltmek ve izin tek primer koloni PCR yaklaşımı, gelişimi çok küçük örneklerden, her transpozonun ekleme siteyi içeren dizisi Coxiella DNA fragmanları. Bizim deneyime dayalı, yüksek kalitede polimeraz özenle seçilmiş ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için test edilmelidir. Bu yaklaşımın tek sınırlama, vakaların çoğunda, işlenmiş örneklerin yaklaşık% 30&#39;u yararlanılamaz değil, gözlem PCR veya sıralama adımlar nedeniyle ya gizleyebilirsiniz. Bununla birlikte, yeni Coxiella transpozon mutantların izolasyonu, bir oran-sınırlayıcı aşama olmadığını dikkate alınarak, bu repre etmezönemli bir sorun gönderdi. Benzer şekilde, mutant stokların bakteri konsantrasyonunu ölçmek için güvenilir bir tahlil gelişimi bu yaklaşım için anahtar olmuştur. Süspansiyon içinde toplamak için Coxiella eğilimi nedeniyle, optik yoğunluk okumaları kullanılmasıydı Coxiella kültürler ve sadece mevcut alternatif konsantrasyonunu kantitatif PCR (qPCR) hesaplamak için geçerli değildir. Burada, bir floresan etiketli DNA interkalasyon maddesinin kullanımının önemli ölçüde bakteri kantitatif hızlandırdı. Bu yaklaşım, aynı zamanda kullanılan patojene bağlı olarak birkaç hücre içi fluoresan işaretleri ekspres eden stabil hücre çizgilerinin kullanımının avantajını sunar. Bir başka önemli yönü, fenol kırmızısı içermeyen hücre kültür ortamının kullanılmasıdır. Biz bu pH indikatör otomatik floresan okuyucu kaydedilen sinyali doyurur kırmızı ve yeşil spektrum kapsayan doğal bir floresan sahip olduğu görülmektedir. TBurada sunulan strateji rastgele transpozon mutajenezi dayanır. Ilgi mutantlar için, Güney leke ve transpozon ekleme sitenin PCR amplifikasyonlar kullanarak benzersiz transpozisyonlar doğrulama (ve klonalite) tavsiye ederim. Protokol bölümünde açıklanan ekipman yanı sıra, burada sunulan tarama yaklaşımı kullanılarak ilgilenen ekipler, veri toplama, veri depolama için bir sunucu ve hızlı görüntü analizi için bir iş istasyonu için bir ilişkisel veritabanı set up büyük bir avantaj alacak. Önemli bir şekilde, burada, diğer hücre içi bakteriyel patojenlerin çalışma için uygundur tarif edilen yöntem, bir rastgele mutagenez yöntemi patojenin mevcut mesafede, hücre çizgileri patojen ile enfekte olabilir ve bu bir enfeksiyon sırasında, belirli bir fenotip göstermektedir.

gelişmekte olan, endemik bakteri Coxiella burnetii Q ateş, şiddetli sağlık ve ekonomik etkisi 1 ile zayıflatıcı grip benzeri zoonoz büyük salgınlar sorumludur. Coxiella ana rezervuar iç ve çiftlik hayvanları, ve ABD&#39;de süt sığırı% 90&#39;dan fazla C taşıdıkları tahmin ediliyor 2 burnetii. İnsanlar kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla bulaşmış yanlışlıkla ana vardır. İnsan Q humması tezahür ya% 65 1,3 ulaşan mortalite oranı ile ölümcül komplikasyonların olabileceğini akut veya kronik hastalığı gibi. 1 bir enfeksiyon dozu ile - 10 organizmalar, Coxiella bilinen en bulaşıcı patojen ve potansiyel bir biyo silah 4 olarak araştırılmıştır. Hollanda (2007 - 2010) Q ateşi son patlayıcı salgını vakası yılda fazla 2,000 182 tırmanan ile, bu patojenin ciddi virulans bir örnek olarak duruyor5. Coxiella enfeksiyonlarının dikkate değer bir verimi büyük olasılıkla konakçı hücreler için eşsiz uyum ile birlikte çevresel strese karşı direnci ile ilişkilidir. Gerçekten de, Coxiella çok sert koşullar (kuruma, sıcaklık, vs.) önemli ölçüde dirençli olan metabolik olarak aktif olmayan küçük hücreli varyantları (SCV) şeklinde bir ortamda bulunmaktadır. Fagositik olmayan hücreleri istila Coxiella yapışması / istila OmpA 7 ve henüz tanımlanmamış reseptörün aracılık ederken SCVs kadar 3 integrinler 6 β α V ile fagositik hücreler tarafından alınır. Alımı takiben, Coxiella Rab5 ve EEA1 8 erken endozomal belirteçleri için pozitif dar vakuollerin, yaşıyor. Bakteriler Dot / Icm tip 4 salgı sistemini (T4SS) 9 metabolik olarak aktif büyük hücreli çeşitleri (LCVs) dönüştürme ve aktive ederek endozomal asitlenme cevapLegionella pneumophila 10&#39;dakine yüksek ölçüde homolog. Nokta / ICM efektör salgılanması Coxiella bakteri gelişirler ve aktif apoptozis 11 enfekte hücreleri korumak aktif lızozomal enzimleri ihtiva eden büyük bir LAMP1 pozitif asidik bir bölme oluşturmak için izin verir. Bu nedenle, Coxiella hücre içi döngüsü bakteriyel efektörlerinin 12 Nokta / Icm-aracılı translokasyonu ile kontrol edilir, ancak konakçı hücre istilası, bakteriyel replikasyonu ve enfeksiyonunun yayılması yer mikrobiyal faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Ev sahibi hücre içinde 1) içselleştirme, 2) hücre içi çoğaltma, 3) hücreden hucreye yayılma: transposon mutagenez ve floresans-esaslı tahliller birleştirerek, Coxiella enfeksiyonlarının ana adımları yer bakteriyel faktörlerinin eş zamanlı olarak tanımlanması için tarafsız yaklaşımlar geliştirmektedir ve 4) sebat. Bugüne kadar, 1000 m üzerinde ekranlıCoxiella patogenezi 7 düzenleyen konak-patojen etkileşimleri içine görülmemiş anlayışlar bize sağlanan 500 Coxiella kodlama dizilerinde utations. Dikkat çekici bir şekilde, bu yaklaşım Coxiella hücre biyolojisi özellikleri paylaşan diğer hücre içi patojen çalışmaya uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, without phenol red</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; transformation</td></tr><tr><td>Trackmates screw top tubes with caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded screwcap</td></tr><tr><td>96-well microplate with black walls and bottom</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; mutants infections</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>For single primer colony PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antibody</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence automated microscope Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion ve bakteriyel patojenlerin konakçı hücrelerin kolonizasyonunun bozmak ve temel bir konak işlevlerini manipüle virülans faktörü olarak tanımlanan prokaryotik proteinleri, çok sayıda, aktivitesine bağlıdır. Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için bu nedenle son derece önemlidir. Bu yaklaşım, ancak bakteriyel virülans belirleyicileri tarafsız, otomatik tanımlama ve karakterizasyonu için yeni yüksek verimli tahlillerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, transpozon mutagenezi ile GFP etiketli mutant kütüphanesi oluşturulması için bir yöntem tarif ve yüksek içerik tarama gelişimi çok sayıda transpozon ilişkili fenotip eşzamanlı belirlenmesi için yaklaşımlar. Bizim çalışma modeli se ile ilişkili hücre içi bakteri patojen Coxiella burnetii, zoonoz Q ateşi etiyolojik ajandırvere bir sonucu sağlık ve ekonomik yük ile salgınlar. Bu patojenin zorunlu hücre içi doğası, son zamanlara kadar, ciddi Coxiella yüksek verimlilik / yüksek içeriği yaklaşımların uygulanması için ideal bir model haline ana patojen etkileşimlerinde karıştığına bakteriyel faktörlerin tanımlanmasını engellemiştir.

Transposon mutantların izolasyonu üzerine, tek primer koloni PCR her mutant için transpozon yerleştirme siteyi belirlemek için sağlam, yüksek verim yöntemidir. Bu yaklaşım, tipik bir iç içe PCR protokolü türeyen, ancak burada tek bir primer tavlama sıcaklığı (Şekil 1A) sıkılığına bağlı olarak, şablon DNA spesifik ve / veya non-spesifik olarak melezleşir. Tipik bir PCR ürünleri özgü çoğu birden fazla DNA fragmanları (Şekil 1B) oluşur. Sağ transpozon ITR yukan ve büyütme primeri tarafından tanınan sekansının alt baş tavlanan farklı dizileme primeri kullanımı dizileme aşama (Şekil 1C) BY için spesifisite sağlamaktadır. Dizi analizi için otomatik bir yazılım transpozon eklemeler (Şekil 1C) tam yeri sağlayan bir Coxiella genomuna edilen sekansları hizalanır. Tüm transposon eklemeleri sonra ann olabilirCoxiella genomu (Şekil 1D) üzerine otated. Her Coxiella mutantı izole edilmiş ve depolama ya da ayıklama öncesinde ACCM-2 ortamı içinde aksenik biçimde yükseltilir. 2 16 nokta / ICM Coxiella genleri (Şekil 2A), 38 transpozon mutantlarının bir örneğini göstermektedir, Şekil. Coxiella mutantlarının uygulanabilirliğini değerlendirmek için, aksenik büyüme eğrileri 1.5 (Figurie 2B) &#39;de tarif edilen bakteri konsantrasyonu tahlili Aşılama sonrası 7 gün bakteri kültürleri numune alma ve uygulanması ile elde edilir. Amplifiye mutantlar daha sonra, 7 gün için üçlü 96-yuvalı plakalar içinde, epitel hücreleri ile inkübe edilir. Üretilen tüm Coxiella mutantlar GFP etiketli hücre içi büyüme eğrileri de, her 24 saatte, her GFP floresans yoğunluğunu ölçülmesi ve zamanın bir fonksiyonu (Şekil 2C) olarak ölçülen değerlerin konulması sureti ile elde edilir edilir. Intracellular büyüme eğrileri Coxiella genomunda her transpozon ekleme ile ilişkili fenotipleri kantitatif analiz sağlar. Aynı transposon mutantlar hakkında nitel bilgiler eklemek için, otomatik görüntü toplama ve analiz için seçti. Yedi gün plakalar 4 açıklanmıştır ve bu CellProfiler (geniş Enstitüsü, 5. Otomatik görüntü analizi yazılımı tarif edildiği gibi otomatik bir, Epifloresans mikroskop kullanılarak analiz edildiği immünofloresans için işleme, sabittir, enfeksiyondan <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> alınan kanal işlem) bağımsız ve segmentler karşılaştırmalı analizi (Şekil 3) için nesneleri tespit. Bu konak hücre çekirdekleri, hücre konturları, lizozomlar ve Coxiella koloniler (Şekil 3 üst paneller) tanımlanması ve morfolojik karakterizasyonu sağlar. Hücreler ve lizozomlar ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi identificati sağlarve (pozitif LAMP1, Şekil 3 sol alt panel vardır) Coxiella ihtiva-eden vakuollerin özgü morfolojik analizi. Konak hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi kimlik ve enfekte olmuş hücrelerin spesifik morfolojik analizi (Şekil 3 orta alt panel) izin verir. Son olarak, 4 kanal illüstrasyon ve kalite kontrol amaçlı (Şekil 3 sağ alt panel) için birleştirilir. Otomatik görüntü analizinden elde edilen veriler &quot;çok fenotipik dağılım araziler&quot; elde etmek için birbirlerine karşı çizilebilir. Bir örnek olarak, Coxiella kolonilerinin Şekil 4A (um 2) ortalama alan olarak Coxiella (çoğaltma fenotip) ve / veya hücre içi çoğaltma etkileyen mutasyonları tespit etmek için, hücre (Şekil 4A), ortalama koloni sayısı karşı çizilir Ev sahibi hücreleri istila bakterilerin kapasitesi (internakatmanlara ayrılmasına fenotip). İstatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. Mutantlar 3 ana kümelerde gözlendi: Coxiella bir kusurlu hücre içi büyüme sonuçlandı mutasyonlar arsa (Şekil 4A, pembe ve kırmızı noktalar) en sol kısmında gruplandırıldı; hücrelerde Coxiella içselleştirilmesi etkilenen mutasyonlar arsa alt kısmında gruplandırıldı (Şekil 4A, açık ve koyu mavi nokta) ve son olarak, arsa sağ çoğu bölgede yeşil noktalar (anlamlı olmayan fenotipleri sonuçlanan mutasyonlar karşılık Z-skoru&gt; -2). Önemli olarak, çoğaltma için başarısız ama yine de konakçı hücreleri istila mümkün olan mutantlar, hücre çekirdekleri (Şekil 4C, ikinci panel) barındırmak için bitişik tek bakteri ya da küçük koloniler, enfeksiyon 7 gün sonra tespit edilir. Bu nedenle, Coxiella boyutu &quot;ColoNies &quot;önemli ölçüde etkilenecek, ama enfekte olmuş hücrelerin sayısı WT Coxiella ile enfekte olan hücreler ile karşılaştırıldığında farklı olmayacaktır. Aksine, konak hücreleri işgal etmek Coxiella kapasitesini etkileyen mutasyonlar koloni / hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Bu sayısı önemli ölçüde 1 &#39;in altında olduğu zaman, bu ortalama, enfekte olmuş hücrelerin toplam sayısında bir azalma olduğunu işaret etmektedir. Seçenek olarak ise, Coxiella kolonileri (um 2) ortalama alan Coxiella (sitotoksik fenotip) sitotoksiteye kazandıran mutasyonlar tespit etmek enfeksiyonu (Şekil 4B) hayatta konakçı hücreler, sayısına karşı çizilmiştir edilebilir. Yukarıdaki gibi, istatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. En mutasyonlar önemli ölçüde konak içinde bakteriyel çoğalma olursa olsun, hücre yaşamını etkilemedi ekranlıhücreleri (Şekil 3B yeşil noktalar). 37 mutasyon hafif etkilenen konak hücre sağkalım (Şekil 3B, açık kırmızı noktalar) ve 7 mutasyonlar hücre sağkalım (Şekil 3B, koyu kırmızı noktalar) barındırmak için özellikle zararlı idi. Deneysel ihtiyaçlarına göre, otomatik bir görüntü analizi prosedürü ile elde edilen ek parametreler, diğer grafikleri elde etmek için kullanılabilir olduğunu not edin. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. Sıralama ve Coxiella transpozon mutantlar açıklama (a) Tek primeri koloni PCR transpozon ekleme bölgesi içeren DNA fragmanlarının büyütülmesi için kullanılmıştır. Bir yükseltme primeri (Amp), tavlama sıcaklığının sıkılık bağlı olarak spesifik ve spesifik olmayan primer olarak hem de kullanılır. (B) tek primer koloni PCR tipik sonucudur. Her Reactiilgili transpozon ekleme yeri içeren bazıları değişken boyutta fragmanlar, bir dizi üretir; bazıları rastgele yan ürünlerin düşük sıkılık PCR döngüsünün olarak güçlendirilir. (C), transpozon sekansına hibridize olan bir dizileme primeri (Sekans no) kullanımı ilgi parçalarının sekanslanmasını sağlar. (D) Sıra analiz yazılımı bakteri genomu üzerinde transposon eklemeleri otomatik şerhi verir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2:. Aksenik ve Coxiella transpozon mutantlar hücre içi büyüme (A) Pilot ekranında, biz 16 çekirdekli g 38 transposon mutantlar sıralı, izole ve ekranlı varCoxiella nokta / icm salgısı sistemi enes (kırmızı gösterilir). Her bir transpozon mutantının yaşayabilirliği belirlemek üzere (B), her biri bir büyüme aksenik kültür ortamı içinde izole bir floresan DNA interkalasyon temin edici madde etiketli kullanılarak 8 gün boyunca izlenir. (C) Her bir mutant daha sonra epitel hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transpozon bir GFP kaset sahip olarak, hücre içi bakteri üremesi bir mikroplaka okuyucu kullanarak, Coxiella çoğaltma ile ilişkili GFP floresan varyasyonları takip ederek enfeksiyon üzerinde 7 gün izlenir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3: Coxiella enfeksiyonlarının Otomatik görüntü analizi Bir ​​otomatik.çiftleşmiş epifluorışıma mikroskop görüntü üç kopya 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 21 pozisyonları kullanılır. Görüntü analiz yazılımı segmentleri ölçümü ve analizi için her edinilen kanallarda nesneleri. Tüm durumlarda, görüntü sınır temas nesneler hariçtir. (A), Hoechst kanalı (yeşil çember), konakçı hücre çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. (B) Bu Cy3 kanalında konak hücre konturları tanımlamak için tohum olarak kullanılmaktadır (çekirdeklerin pozisyonu mavi çember, hücre konturları yeşil vardır). (C) Cy5 kanalı LAMP1 pozitif bölmeler tanımlamak için kullanılır (yeşil daire); Sadece (kırmızı) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. (D), GFP kanalı (yeşil çember) Coxiella kolonilerini teşhis etmek için kullanılır. (E) LAMP1 pozitif bölmeleri ile Coxiella kolonileri ilişkilendirilmesi Coxiella belirlenmesini sağlar </em&gt; Ihtiva-eden vakuoller (CCVS); Sadece (yeşil) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. Hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi (F) enfekte olmuş hücrelerin (yalancı) belirlenmesini sağlar. 4 floresan kanal edilen (G) resim (Coxiella koloniler (yeşil), konakçı hücre çekirdekleri (mavi), konakçı hücre, plazma membranı (gri), LAMP1 pozitif bölmeleri (kırmızı) karşılık gelen) birleştirilir ve gösterim ve kalite için kullanılan Kontrol. Ölçek 10 mikron barlar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4: ev sahibi yer Coxiella faktörlerin büyük ölçekli tanımlama / patojen etkileşimiyonları (A). Coxiella kolonilerin (um 2) hücre başına koloni nispi sayısı karşı çizilen ortalama alan, ilgi konusu çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri tespit etmek. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe ve açık mavi noktalar -2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru sırasıyla çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri temsil etmektedir. Kırmızı ve koyu mavi noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile fenotipleri temsil etmektedir. Coxiella kolonileri (B) (mikron 2) ortalama alan transpozon eklemeleri kaynaklanan sitotoksik etkisini tahmin etmek için enfeksiyon 7 gün hayatta hücreleri (enfekte ve enfekte olmayan) toplam sayısı karşısında çizilmiştir. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe noktalar sitotoksik ph temsil-2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru enotypes. Kırmızı noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile sitotoksik fenotipleri temsil etmektedir. Oklar C (C) karşılık gelen küçük harf ile gösterilen mutantlar çoğaltma, içselleştirme ve sitotoksik fenotipleri Temsilcisi görüntüleri gösterir. Her durumda, konakçı hücre çekirdekleri kırmızı olan Coxiella koloniler yeşil içindedir. Ölçek, 50 mikron barlar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Görüntüleme.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder. 

Video: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Tıp

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biyokimya

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler