This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן הוכיח להיות שיטה יוצאת דופן כדי להבין בזיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. עם זאת, בשל המגוון של אסטרטגיות הרחיבו על ידי חיידקים פתוגנים שונה, זיהוי והאפיון של גורמים ארסי חיידקים ושל מארח מסלולי איתות שממוקדים בזיהומים מייצגים אתגר אמיתי. זה קורא לפיתוח גישות החדשות לזיהוי בקנה מידה גדולה של רכזות אינטראקציה המארח / פתוגן מפתח. הפיתוח האחרון של, תפוקה גבוהה חדשנית וטכניקות הקרנה גבוהות תוכן מייצג משאב יקר שיכול להיות מותאם למחקר של חיידקים פתוגנים תאית 15. הנה, יש לנו בשימוש burnetii Coxiella פתוגן חיידקי zoonotic כמודל לפיתוח גישות הקרנה המשלבות mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת. Importantly, שיטת הקרנה זו מאפשרת ניטור סימולטני של שלבים מרובים של המחזור תאיים Coxiella, מתן סקירה עולמית של האסטרטגיות שפותחו על ידי חיידק זה לפלוש, לשכפל ולהתמיד בתאים נגועים. הגישה המתוארת כאן מבוססת על שתי טכניקות מבוססות היטב, mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוסס, שיושמו בהצלחה למחקר של חיידקים פתוגנים. שילוב טכניקות אלה בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה / גבוה תוכן מאפשר לנו להעריך את ההשפעות של מספר גבוה של מוטציות חיידקים על ידי ניתוח מספר גבוה מאוד של אירועים (בדרך כלל 15,000 תאים נגועים למוטציות חיידקים הם צילמו וניתחו). זה מספק ניתוח סטטיסטי חשוב של אירועים כגון פלישת חיידקים של תאי מארח ושכפול תאיים, שהם, על ידי הטבע, כפופים לשונות גבוהות. חשוב לציין כי שורות תאים אחרות מאשר EPithelial יכול לשמש לסוג זה של הקרנה. עם זאת, תאי האפיתל שטוחים וגדולים הם אופטימליים לניתוח תמונה כאברונים תא המארח הם קלים יותר לזהות. מכיוון שרוב המיקרוסקופים אוטומטיים באופן אוטומטי יכול להתמודד עם מספר רב של צלחות, יש כמעט אין גבול למספר מוטציות שיכולות להיות מוקרן בו זמנית. בהתאם לפתוגן, זכות פחית משתמשים השימוש בepifluorescence או מיקרוסקופ confocal. זמן רכישה של תמונה יהיה בעיקר תלוי ברגישות של המצלמה מיקרוסקופ, על מספר תחומים שנרכשו בכל טוב ובמספר הערוצים שנרכשו לשדה הראייה. המשתמש יכול להחליט כיצד להתאים גורמים אלה כדי לייעל את פרוטוקול ההקרנה. כדוגמא, אנחנו צילמו צלחת / hr 96-גם אחד באמצעות התנאים שצוינו בשלב 5.1. ניתוח תמונה תלוי במידה רבה במחשב (או המקבץ של מכונות) משמש. אנו משתמשים 12 ליבות (2 x 3.06 GHz 6 ליבות), תחנת עבודה RAM 48 GB. מכונה זו דורשת approxiשלו של הדבר 40 דקות כדי לנתח תמונות שנרכשו מצלחת אחת. היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​פיתוח מבחני אלה היא ההגדרה של חדש (או אופטימיזציה של קיימים) פרוטוקולים כדי לאפשר המניפולציה ועיבוד של מספר גדול של דגימות. דוגמא טיפוסית היא הפיתוח של הגישה אחת המושבה פריימר PCR, אשר אפשרה לנו להגביר ומהירות שברי רצף ה- DNA המכילים Coxiella האתר של החדרה של כל transposon, מדוגמאות קטנות מאוד. בהתבסס על הניסיון שלנו, פולימראז באיכות גבוהה צריך להיות שנבחר בקפידה ונבדק על מנת לקבל תוצאות לשחזור. המגבלה היחידה של גישה זו עשויה להסתיר בתצפית ש, ברוב המכריע של המקרים, כ -30% מהדגימות מעובד אינם ניצול, או בשל PCR או צעדי הרצף. עם זאת, בהתחשב בכך שהבידוד של מוטציות transposon Coxiella החדשות הוא לא צעד שער הגבלה, זה לא repreנשלח לנושא מרכזי. באופן דומה, הפיתוח של assay אמין לכמת את ריכוז החיידקים של מניות מוטציה היה מפתח לגישה זו. בשל הנטייה של Coxiella כדי לצבור כאשר בהשעיה, השימוש בקריאת צפיפות אופטית אינו ישימה לחישוב הריכוז של תרבויות Coxiella והחלופה היחידה הקיימת היה PCR כמותית (QPCR). כאן, שימוש סוכן intercalating DNA מתויג fluorescently של האיץ באופן משמעותי את quantitation חיידקים. גישה זו יכולה גם לנצל את השימוש בשורות תאי יציבות להביע סמני ניאון לכמה תאים תאיים בהתאם לפתוגן בשימוש. היבט חשוב נוסף הוא השימוש בתרבית תאי תקשורת נטולת פנול אדום. הבחנו כי יש אינדיקטור pH זה הקרינה טבעית המשתרעת הספקטרום האדום וירוק שמרווה את האות נרשמה על קורא הקרינה האוטומטית. Tהוא האסטרטגיה שהוצגה כאן מסתמכת על mutagenesis transposon האקראי. למוטציות של עניין, אנו ממליצים אימות חילופים וייחודיים (וclonality) באמצעות כתם הדרום וamplifications PCR של אתר הכנסת transposon. מלבד הציוד שתואר בסעיף הפרוטוקול, צוותי המעוניינים להשתמש בגישת ההקרנה שהוצגה כאן, ינצלו גדול בהקמה של מסדי נתונים יחסיים לאיסוף נתונים, שרת לאחסון נתונים ותחנת עבודה לניתוח תמונה מהיר. חשוב לציין, בשיטה שתוארה כאן מתאים למחקר של חיידקים פתוגנים תאיים אחרים הניתנת על שיטת mutagenesis אקראית קיימת לפתוגן, יכולות להיות נגועות שורות תאים על ידי פתוגן וזה אחד מציג פנוטיפ ספציפי בזיהום.

החיידק מתעוררים, אנדמי Coxiella burnetii אחראי להתפרצויות גדולות של קדחת Q, zoonosis דמוית שפעת מתישה עם בריאות חמורה והשפעה כלכלית 1. המאגרים העיקריים של Coxiella הם חיות בית ומשק, וההערכה היא כי יותר מ -90% מבקר לחלב בארה&quot;ב לשאת ג burnetii 2. בני אדם הם מארחים מקריים שנגועים על ידי שאיפה של אירוסולים מזוהמים. קדחת Q האנושית באה לידי ביטוי גם כמחלה אקוטית או כרונית, שעשויה להיות לי סיבוכים קטלניים עם שיעור תמותה מגיע 65% 1,3. עם מינון זיהומיות של 1 - 10 אורגניזמים, Coxiella הוא הפתוגן זיהומיות הידועים ביותר והוא נחקר כנשק ביו פוטנציאל 4. ההתפרצות האחרונה הנפץ של קדחת Q בהולנד (2007 - 2010), במקרי הסלמה מ-182 ליותר מ 2,000 בשנה, עומדת כדוגמא לאלימות הקשה של הפתוגן5. היעילות המדהימה של זיהומי Coxiella הוא צפוי הקשורים להתנגדותה ללחץ סביבתי, בשילוב עם ההתאמה הייחודית שלה לארח תאים. ואכן, Coxiella נמצא בסביבה בצורה של גרסאות מטבולית פעילה קטנות תא (SCV), אשר להפליא עמידים במספר תנאים קשים (התייבשות, טמפרטורה, וכו &#39;). SCVs נתפס על ידי תאי phagocytic באמצעות V α β 3 integrins 6 תוך פלישה של תאים שאינם phagocytic מתווכת על ידי ההדבקה / פלישת Coxiella 7 OmpA וקולט עדיין לא מזוהה. בעקבות ספיגה, Coxiella מתגורר בvacuoles ההדוק, חיובי לסמני endosomal המוקדמים Rab5 וEEA1 8. חיידקים להגיב להחמצת endosomal ידי המרה לגרסות מטבולית פעילה גדולות תא (LCVs) והפעלת מערכת דוט / ICM סוג 4 הפרשה (T4SS) 9, הומולוגי מאוד לזה של Legionella pneumophila 10. הפרשת effectors דוט / ICM תאפשר Coxiella ליצור תא גדול, LAMP1 חיובי חומצי המכיל אנזימי lysosomal פעילים בי חיידקים יכולים לשגשג ופעיל בהגנה על תאים נגועים מאפופטוזיס 11. לפיכך, המחזור תאיים של Coxiella נשלט על ידי טרנסלוקציה תיווך ICM דוט / של effectors חיידקי 12, לעומת זאת, גורמי החיידקים מעורבים בפלישת מארח תא, שכפול והפצה של חיידקי הזיהום יישארו במידה רבה לא ידועים. שילוב mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת, אנו מפתחים גישות משוחדת לזיהוי בו זמני של גורמי חיידקים מעורבים בשלבים העיקריים של זיהומי Coxiella: 1) הפנמה בתוך תאי מארח, 2) שכפול תאיים, 3) התפשטות תא אל התא , ו 4) התמדה. עד כה, יש לנו יותר מ -1,000 מטר הוקרנוutations ב500 רצפי Coxiella קידוד, אשר סיפק לנו תובנות חסרות תקדים לתוך אינטראקציות מארח הפתוגן המסדירות פתוגנזה Coxiella 7. ראוי לציין, גישה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים תאיים אחרים שחולקים תכונות ביולוגיה של תא עם Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, without phenol red</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; transformation</td></tr><tr><td>Trackmates screw top tubes with caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded screwcap</td></tr><tr><td>96-well microplate with black walls and bottom</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>For &lt;em&gt;Coxiella&lt;/em&gt; mutants infections</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>For dsDNA quantitation</td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>For single primer colony PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antibody</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>For immunofluorescence staining</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence automated microscope Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

פלישה והתישבות של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים תלויה בפעילות של מספר רב של חלבוני פרוקריוטים, שהוגדר כגורמים ארסי, שיכול לערער ולשנות פונקציות מארח מפתח. המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן לכן חשוב מאוד להבין זיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. גישה זו לעומת זאת, דורשת הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה החדשים לזיהוי משוחד, אוטומטי והאפיון של גורמי אלימות חיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ספריית מוטציה מתויג GFP ידי mutagenesis transposon ופיתוח גבוה הקרנת תוכן גישות לזיהוי בו זמני של פנוטיפים הקשורים transposon מרובים. מודל העבודה שלנו הוא burnetii תאית חיידקי Coxiella הפתוגן, סוכן etiological של קדחת Q zoonosis, אשר מזוהה עם seVere התפרצויות עם בריאות כתוצאה מכך וניטל כלכלי. הטבע תאיים לחייב של הפתוגן זה, עד לאחרונה, הקשה מאוד על זיהוי של גורמי חיידקים מעורבים באינטראקציות הפתוגן מארח, מה שהופך את של Coxiella המודל האידיאלי ליישום תפוקה גבוהה / גבוה תוכן גישות.

עם הבידוד של מוטציות transposon, המושבה פריימר היחידה PCR הוא שיטה לזיהוי האתר של הכנסת transposon לכל מוטציה חזקה, תפוקה גבוהה. גישה זו נובעת מפרוטוקול PCR מקונן טיפוסי אבל כאן פריימר יחיד hybridizes ו / או שאינו ספציפי במיוחד לתבנית ה- DNA בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה (איור 1 א). מוצרי ה- PCR הטיפוסיים מורכבים ממספר רב של שברי ה- DNA, שרובם ספציפיים (איור 1). השימוש בפריימר רצף שונה שanneals תקין במעלה הזרם של ITR transposon, ומורד זרם של הרצף מוכר על ידי פריימר ההגברה מספק סגוליות לצעד הרצף (איור 1 ג). תוכנה אוטומטית לניתוח רצף מיישרת את הרצפים שהתקבלו לגנום Coxiella מתן האתר של הוספות transposon (איור 1 ג) המדויק. כל הוספות transposon יכולות להיות אז אןotated על הגנום Coxiella (1D איור). כל מוטציה Coxiella מבודדת ומוגברת axenically בACCM-2 בינוניים לפני או אחסון או הקרנה. איור 2 מדגים דוגמא של 38 מוטציות transposon בנקודת 16 / גני Coxiella ICM (איור 2 א). כדי להעריך את הכדאיות של מוטציות Coxiella, עקומות גדילת axenic מתקבלות על ידי דגימת תרבויות חיידקים למשך 7 ימים לאחר חיסון ויישום assay ריכוז החיידקים מתואר ב1.5 (Figurie 2B). אז מוטציות מוגברות מודגרת עם תאי אפיתל, ב96-גם צלחות בשלושה עותקים למשך 7 ימים. כל מוטציות Coxiella נוצרו להיות מתויג GFP, עקומות גדילה תאיות מתקבלות על ידי מדידת עוצמת הקרינה GFP של כל טוב, בכל שעה 24, וקשירת קשר לערכים שנמדדו כפונקציה של זמן (איור 2 ג). Intrעקומות גדילה תאיות לספק ניתוח כמותי של פנוטיפים הקשורים כל הכנסת transposon בגנום Coxiella. כדי להוסיף מידע איכותי על אותו מוטציות transposon, בחרנו לרכישת תמונה אוטומטית וניתוח. שבעה ימים שלאחר זיהום, צלחות קבועות, מעובד לimmunofluorescence כמתואר ב 4 ונותחו באמצעות מיקרוסקופ, כמתואר ב5. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית כגון CellProfiler (Broad Institute, אוטומטי, epifluorescence <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com)</a> מעבד את הערוצים שנרכשו באופן עצמאי ומגזרים מזוהים אובייקטים לניתוח השוואתי (איור 3). זה מאפשר זיהוי ואפיון מורפולוגי של גרעיני מארח תא, קווי המתאר תא, lysosomes ומושבות Coxiella (איור 3 פנלים העליונים). התאמת מושבות Coxiella עם תאים ומאפשר lysosomes identificatiובניתוח צורני ספציפי של vacuoles המכיל Coxiella (שהם LAMP1 החיובי, איור 3 פנל שמאלי תחתון). התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מארח מאפשר זיהוי וניתוח צורני ספציפי של תאים נגועים (איור 3 פנל מרכז תחתון). לבסוף, 4 הערוצים ימוזגו להמחשה ולמטרות בקרת איכות (איור 3 פנל ימני תחתון). נתונים שהתקבלו מניתוח תמונה אוטומטית ניתן להתוות אחד נגד השני כדי להשיג &quot;מגרשי פיזור רב פנוטיפי&quot;. כדוגמא, באיור 4 א השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד מספר מושבות לכל תא (איור 4 א), על מנת לזהות מוטציות המשפיעות על שכפול תאיים של Coxiella (פנוטיפ שכפול) ו / או היכולת של חיידקים לפלוש תאי מארח (internaפנוטיפ lization). ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). מוטציות נצפו ב 3 אשכולות עיקריים: מוטציות שגרמו לצמיחה תאית פגומה של Coxiella קובצו בחלק השמאלי ביותר של העלילה (איור 4 א, ​​ורוד ונקודות אדומות); מוטציות שהשפיעו על הפנמת Coxiella בתאים קובצו בחלק התחתון של העלילה (איור 4 א, ​​נקודות אור והצבע כחולים כהה) ולבסוף, נקודות ירוקות בימני ביותר באזור של העלילה מתאימות למוטציות וכתוצאה מכך פנוטיפים שאינם משמעותיים ( Z-ציון&gt; -2). חשוב לציין, מוטציות שאינן מצליחין לשכפל אבל עדיין מסוגל לפלוש לתאי מארח, מזוהות לאחר 7 ימים של זיהום חיידקים בודדים, או מושבות קטנות, סמוכים לארח תא גרעינים (איור 4C, פנל שני). לפיכך, קולו הגודל של Coxiella &quot;nies &quot;יושפע באופן משמעותי, אך מספר התאים נגועים לא להשתנות בהשוואה לתאי -infected WT Coxiella. להיפך, מוטציות המשפיעות על היכולת של Coxiella לפלוש תאי מארח לגרום לירידה במספר מושבות / תא. כאשר מספר זה הוא נמוך משמעותי 1, הוא מציין כי, בממוצע, יש ירידה במספר הכולל של תאים נגועים. לחלופין, השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella ניתן להתוות נגד מספר תאי מארח שרדו זיהום (איור 4), לזהות מוטציות המעניקות רעיל לCoxiella (פנוטיפ ציטוטוקסיות). כאמור לעיל, ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). רוב הוקרן מוטציות לא השפיעו באופן משמעותי הישרדות תא, ללא קשר לשכפול חיידקים בתוך מארחתאים (נקודות ירוקות איור 3). 37 מוטציות הישרדות תא מארח מושפעת במתינות (איור 3, נקודות אדומות אור), ו- 7 מוטציות היו הרסניות, במיוחד לארח הישרדות תא (איור 3, נקודות אדומות כהות). שים לב שפרמטרים נוספים שהושגו על ידי הליך ניתוח תמונה האוטומטי יכולים לשמש כדי להפיק תרשימים אחרים, בהתאם לצרכי ניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1:. המושבה פריימר יחידה רצף וביאור של מוטציות transposon Coxiella () PCR משמש כדי להגביר קטעי DNA המכילים את האתר של הכנסת transposon. פריימר הגברה (AMP) משמש גם כפריימר ספציפי ולא ספציפי, בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה. תוצאה אופיינית של המושבה פריימר היחידה PCR (B). כל Reactiבמייצר מספר שברים בגודל משתנה, שחלקם מכילים את אתר הכנסת transposon; כמה אחרים הם מוגברים באופן אקראי כתוצרי לוואי של מחזור PCR חומרה הנמוכה. (ג) השימוש בפריימר רצף (Seq) שhybridizes לרצף transposon מאפשר הרצף של שברים של עניין. תוכנת ניתוח (ד &#39;) רצף מאפשרת ביאור האוטומטי של הוספות transposon על הגנום של החיידקים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2:. Axenic וצמיחה תאית של מוטציות transposon Coxiella (א) במסך הטייס, יש לנו מבודד, רצף והוקרנו 38 מוטציות transposon בגרם ליבה 16Enes של מערכת הפרשת הנקודה / ICM Coxiella (מצויינים באדום). (ב) על מנת להעריך את הכדאיות של כל מוטציה transposon, הצמיחה של כל הבודד במדיום תרבות axenic מנוטר על 8 ימים באמצעות מתויג fluorescently סוכן intercalating DNA. (ג) כל מוטציה משמשת אז כדי להדביק תאי אפיתל. כtransposon בעל קלטת GFP, התפתחות חיידקים תאית היא פיקוח על 7 ימים של זיהום על ידי ביצוע השינויים של הקרינה GFP קשורה לשכפול Coxiella, באמצעות קורא microplate. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3: אוטומטי ניתוח תמונה של זיהומי Coxiella אוטומטי.מיקרוסקופ epifluorescence הזדווגו משמש לתמונה 21 עמדות בכל טוב של 96-גם צלחות בשלושה עותקים. מגזרי תוכנת ניתוח תמונת אובייקטים בכל ערוצים שנרכשו לכימות וניתוח. בכל המקרים, חפצים נוגעים בגבול של התמונות אינם נכללים. () ערוץ Hoechst משמש לזיהוי גרעין תא מארח (מוקף בעיגול ירוק). (ב) אלה משמשים כגרעינים לזהות קווי המתאר תא מארח בערוץ Cy3 (העמדה של גרעינים היא בעיגול כחול, קווי המתאר תא נמצאים בירוק). (C) ערוץ Cy5 משמש לזיהוי תאי LAMP1-חיובי (בעיגול ירוק); רק האובייקטים כלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (באדום) נשמרים לניתוח תמונה. ערוץ ה- GFP (ד) משמש לזיהוי מושבות Coxiella (מוקף בעיגול ירוק). (ה) התאמת מושבות Coxiella עם תאי LAMP1 חיובי מאפשרת זיהוי של Coxiella </em&gt; Vacuoles המכיל (CCVs); רק האובייקטים הכלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (בירוק) נשמרים לניתוח תמונה. (F) התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מאפשר זיהוי של תאים נגועים (pseudocolored). תמונות (G) שנרכשו בערוצי הקרינה 4 (המקביל למושבות Coxiella (ירוק), גרעיני תאי מארח (כחול), קרום פלזמה תא מארח (אפור), תאי LAMP1-חיובי (אדום)) ימוזגו ומשמש להמחשה ואיכות שליטה. בקנה מידה מונעת 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4: זיהוי בקנה מידה גדולה של גורמים המעורבים בCoxiella מארח / אינטראקציה הפתוגןהשטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד המספר היחסי של מושבות לכל תא יונים. (א), לזהות פנוטיפים שכפול והפנמה של עניין. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). ורוד ונקודות בצבע תכלת מייצגים פנוטיפים שכפול והפנמת בהתאמה, עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). אדום ונקודות בצבע כחולות כהות מייצגים פנוטיפים עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). השטח הממוצע (במיקרומטר 2) (ב) למושבות Coxiella היה זמם נגד המספר הכולל של תאים (נגוע ולא נגוע) ששרדו 7 ימים של זיהום להעריך את ההשפעה הרעילה לתאים וכתוצאה מהוספות transposon. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). נקודות הוורודות מייצגות ph ציטוטוקסיותenotypes עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). נקודות אדומות מייצגות פנוטיפים ציטוטוקסיות עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). חצים מצביעים על מוטציות מאוירות על ידי האות קטנה המקבילה בג (ג) נציג תמונות של שכפול, הפנמה ופנוטיפים ציטוטוקסיות. בכל המקרים, גרעיני תא מארח הם באדום, מושבות Coxiella נמצאות בירוק. בקנה מידה מונעת 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Views.  Université Montpellier.  burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך. 

Video: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicine

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biology

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

דור של<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video